圓口銅魚呼吸代謝的溫度響應特征研究

胡曉娜，吳興兵，朱永久，朱挺兵，李學梅，楊德國

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

呼吸代謝是魚類最基本的生命活動。魚類通過呼吸獲取水體中溶解氧以維持其各種生命活動，同時向水體釋放氨態氮和CO2。耗氧率和排氨率是魚類呼吸代謝的重要表征指標[1]。影響魚類呼吸代謝的因素有體重、年齡等內在因素和水溫、鹽度等外在因素，其中水溫是影響魚類呼吸代謝重要的環境因素之一[2]。水溫對魚類的各方面均產生影響，如生理生化水平、能源物質需求、能源物質代謝途徑等。溫度系數(Q10)是反應魚類代謝率對水溫變化響應程度的重要指標，Q10值越大，說明水溫變化對魚類影響越大[3]。另外，若水溫變化劇烈，甚至超出機體可調節范圍，魚類將產生應激反應，表現為皮質醇升高，生理機能受到影響，進而影響呼吸代謝過程[4]。因此，研究魚類呼吸代謝對水溫變化的響應特征，對魚類養殖產業健康發展和自然資源的保護都具重要意義。

圓口銅魚(Coreiusguichenoti)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)亞科(Gobioninae)銅魚屬(Coreius)，為長江上游特有魚類，棲息于水流湍急的江河底層[5]。因受水利工程建設、過度捕撈和環境惡化等影響，自然資源嚴重衰減[6]。目前，圓口銅魚已被《中國脊椎動物紅色名錄(2016)》列為極危物種[7]，野外種群被《國家重點保護野生動物名錄(2021)》列為國家二級重點保護野生動物。由于人工養殖環境與圓口銅魚自然棲息生境差異較大，研究圓口銅魚對環境因素的響應特征十分重要。目前對圓口銅魚的研究主要集中在野生資源現狀[5]、應激及其緩解方法[8]等方面。有關環境條件對圓口銅魚影響的研究較少，在呼吸代謝方面，僅見流速、體重和水溫對圓口銅魚代謝率的影響[9，10]。而關于圓口銅魚呼吸代謝對不同水溫的響應特征，仍缺乏系統研究。

基于此，本實驗研究了人工繁育圓口銅魚不同水溫下的耗氧率、排氨率、氧氮比和不同水溫范圍Q10，并同步測定了相應水溫下圓口銅魚血液生理生化指標，探討了圓口銅魚呼吸代謝對不同水溫的響應特征，以期為圓口銅魚人工養殖和野外種群保護提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚體質量(94.84±1.72)g，為人工培育的3齡子一代圓口銅魚，均取自中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣基地。實驗前所有實驗魚暫養于室內封閉循環水養殖系統中的養殖桶(直徑0.8 m，高0.73 m，水深0.45 m。如無特殊說明，本研究均使用此規格養殖桶)。暫養期間保持水溫(20±0.5)℃和自然光周期。

暫養期間投喂人工配合飼料(粗蛋白質≥42.0%，粗脂肪≥5.0%，總磷≥1.0%，粗纖維≤10.0%，粗灰分≤16.0%，賴氨酸≥2.4%)，采用飽食投喂，每日8：00和16：00各投喂一次。每日換水量約為養殖水體總水量的10%。所換新水經曝氣、調溫后進入養殖桶使用。養殖水體溶解氧大于7 mg/L，pH(7.61±0.27)，氨氮(0.04±0.03)mg/L，亞硝酸鹽(0.02±0.02)mg/L，硝酸鹽(15.40±7.37)mg/L。

1.2 實驗設計

設置5個水溫處理組(10、15、20、25、30 ℃)，每個水溫組設3個平行，每個平行隨機放置圓口銅魚30尾至養殖桶中。各水溫組水溫波動范圍為±0.5 ℃。實驗魚初始養殖水溫為(20±0.5)℃，水溫以2 ℃/d調整至各水溫組水溫。實驗魚在各水溫下適應2周后開始實驗，實驗前禁食24 h。

采用封閉流水式實驗裝置[11]測定耗氧率和排氨率，使用10 L的廣口瓶做呼吸室，呼吸室放入恒溫水槽中，呼吸室和恒溫水槽使用的水均來自控溫養殖系統。廣口瓶使用橡皮塞塞緊，橡皮塞上帶有長短2根玻璃管，長玻璃管深入呼吸室底部，作為呼吸室的進水口，短玻璃管稍突出橡皮塞，為呼吸室的出水口。每個水溫組3個重復，每個重復使用2尾實驗魚。實驗魚放入呼吸室2 h后開始實驗，測定進、出水口溶解氧和氨氮。每隔2 h測定一次進出水口水溫、溶解氧、水流量，同時采集水樣用于水體中氨氮測定，持續24 h。實驗過程中，呼吸室出水口溶解氧水平保持在4 mg/L以上，氨氮水平保持在0.20 mg/L以下，水流量為(14.58±1.48)L/h。采樣結束后，測量實驗魚全長(cm，精確至0.1 cm)、體長(cm，精確至0.1 cm)和體質量(g，精確至0.01 g)。

1.3 耗氧率、排氨率測定

溶解氧使用溶氧儀(哈希，HQ40d)測定，氨氮含量使用水質分析儀(哈希，DR3900)測定。耗氧率、排氨率、溫度系數、氧氮比計算公式[12-14]如下：

耗氧率[mg/(kg·h)]：RO=(DO0-DOt)×V/W

排氨率[mg/(kg·h)]：RN=(Nt-N0)×V/W

溫度系數：Q10=(R2/R1)10/(T2-T1)

氧氮比：O∶N=(Ro/16)/(RN/14)

式中：DO0、DOt分別代表進、出水口溶解氧含量(mg/L)；N0、Nt分別代表進、出水口氨氮含量(mg/L)；V代表呼吸室水流速度(L/h)；W代表實驗魚體質量(kg)；R1、R2分別代表水溫T1和T2時的耗氧率(或排氨率)；RO、RN分別代表耗氧率和排氨率。

1.4 生理生化指標測定

實驗魚分別在10、15、20、25和30 ℃水溫條件下暫養2周后，禁食24 h進行樣品采集工作。每個水溫組9個重復。取樣時，每次從養殖桶中快速撈取1尾魚，放入含MS-222(100 mg/L)的水中麻醉，用1 mL注射器(1%肝素鈉浸潤針頭)尾靜脈抽血。血液分為2份：一份全血凍存，用于血紅蛋白含量測定，另一份置4 ℃冰箱中靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，取上層血清，用于乳酸、血糖、皮質醇測定。

血液生化指標測定均使用南京建成生物工程研究所試劑盒，樣品處理與測定均按照試劑盒說明書步驟進行。血紅蛋白含量采用HICN比色法測定(貨號：C021)，血糖含量采用葡萄糖氧化酶法測定(貨號：A154)，乳酸和皮質醇含量采用比色法(貨號分別為A019-2和H094)測定。

1.5 數據分析

各測定參數數據采用平均值±標準誤(Mean±SE)的形式表示。各指標的差異比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較，顯著水平為0.05。數據分析軟件為SPSS 25。

2 結果

2.1 水溫對圓口銅魚耗氧率、排氨率、溫度系數Q10和氧氮比的影響

不同水溫下圓口銅魚耗氧率、排氨率見圖1。在10～30 ℃內，隨著水溫升高，圓口銅魚耗氧率和排氨率均呈現先上升后下降的趨勢，均在25 ℃組達到最大，其值分別為247.95 mg/(kg·h)和8.52 mg/(kg·h)。15～25 ℃內各組耗氧率無顯著差異，但顯著高于10、30 ℃組，10 ℃組顯著低于其他各水溫組[圖1(a)]。各水溫組排氨率無顯著差異[圖1(b)]。

圖1 不同水溫下圓口銅魚耗氧率(a)、排氨率(b)。Fig.1 Oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of C.guichenoti under different water temperatures不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下圖同。

不同水溫范圍圓口銅魚耗氧率、排氨率的Q10值見表1。耗氧率Q10值范圍為0.45～5.64，整體呈下降趨勢，10～15 ℃組顯著高于其他組，25～30 ℃組顯著低于其他組。排氨率Q10值范圍為0.38～1.53，整體呈現先上升后下降的趨勢，在20～25 ℃組達到最大值，25～30 ℃組最小且顯著低于其他組。

表1 不同水溫范圍圓口銅魚耗氧率和排氨率的Q10值Tab.1 Q10 values of oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of C.guichenoti under different water temperature range

不同水溫下圓口銅魚氧氮比見圖2。10～30 ℃范圍內，氧氮比范圍為15.28～30.71，單因素方差分析表明，水溫對氧氮比有顯著影響，繼而使用多重比較進行不同水溫組間的差異比較，發現10 ℃組氧氮比顯著低于其他組。

圖2 不同水溫下圓口銅魚氧氮比Fig.2 O∶N ratio of C.guichenoti under different water temperatures

2.2 水溫對圓口銅魚血液生理生化指標的影響

不同水溫下圓口銅魚血液生理生化指標如表2所示。整體上，水溫對圓口銅魚血紅蛋白、血糖、乳酸、皮質醇含量均具顯著影響。血紅蛋白含量隨水溫升高呈現先上升后下降趨勢，在25 ℃組達到最大，其值為80.41 g/L，30 ℃組最小，其值為60.52 g/L，顯著低于其他水溫組。血糖含量隨水溫升高整體呈下降趨勢，但在25 ℃出現略微回升；除25 ℃組外，10 ℃組血糖含量顯著高于其他各水溫組。乳酸含量隨水溫升高呈現先升高后降低趨勢，15 ℃組最大，其值為2.42 mmol/L；10 ℃組乳酸含量顯著低于其他水溫組，其值為1.10 mmol/L。皮質醇含量隨水溫升高呈先下降后升高趨勢，25 ℃組達到最低，其值為2.67 ng/mL；10 ℃組含量顯著高于其他各水溫組，其值為14.03 ng/mL。15、20、30 ℃組間無顯著差異，20、25 ℃無顯著差異。

表2 不同水溫下圓口銅魚血液生理生化指標Tab.2 Blood physiological and biochemical indexes of C.guichenoti under different water temperatures

2.3 水溫對圓口銅魚耗氧率晝夜變化的影響

不同水溫下圓口銅魚耗氧率晝夜變化如圖3所示。15～25 ℃范圍內，圓口銅魚耗氧率為夜間顯著高于白天，10、30 ℃組夜間和白天無顯著差異。15～25 ℃組全天耗氧率整體均高于10、30 ℃組。

圖3 不同水溫下圓口銅魚耗氧率晝夜變化Fig.3 Diurnal variation of oxygen consumption rate of C.guichenoti under different water temperatures

3 討論

3.1 水溫對圓口銅魚呼吸代謝的影響

呼吸和排泄是魚類代謝活動重要表征，可反映魚類新陳代謝水平、生理狀況[15]。隨水溫升高，腦、心臟、肝臟等器官組織細胞中各種酶活性增強，新陳代謝水平升高，引起氧氣需求量增加，此時魚類通過增加呼吸頻率、氣體交換量，以及提高血紅蛋白含量增強氧氣運輸能力等提高氧氣攝取量，表現出耗氧率、排氨率和血紅蛋白含量同時升高的現象[16，17]，但超出適宜溫度范圍時，魚體生理機能(如造血系統)發生改變，出現耗氧率、排氨率和血紅蛋白含量降低的現象[18，19]。本研究中，圓口銅魚耗氧率和排氨率均隨水溫升高呈先升高后降低趨勢，均在25 ℃組達到最大值。符合魚類耗氧率和排氨率隨水溫升高先增加后降低的一般規律。與鯔(Mugilcephalus)[18]幼魚的研究結論一致。魚類代謝速率對水溫變化的響應程度可用溫度系數(Q10)表示[3]。10～30 ℃范圍內，鯽(Carassiuscarassius)、鳊(Parabramispekinensis)耗氧率Q10值范圍為0.94～2.61[20]。本研究中，15～25 ℃范圍內，圓口銅魚耗氧率和排氨率的Q10值范圍為1.05～1.53。圓口銅魚耗氧率Q10值在10～15 ℃出現最大值，為5.64，表明該溫度范圍內圓口銅魚對溫度變化較敏感。在適宜溫度范圍內，Q10值隨水溫升高呈現先下降后上升的趨勢，最低值出現在最佳溫度下，水溫超過此范圍時，Q10值減小[13]。在31～34 ℃范圍內，脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)成蝦耗氧率Q10值小于1，認為脊尾白蝦的呼吸在高溫下受到限制[13]，本研究結果與其類似。25～30 ℃，圓口銅魚耗氧率和排氨率的Q10值均小于1且顯著低于其他組，說明30 ℃水溫較高，圓口銅魚的呼吸受到限制。結合耗氧率、排氨率、耗氧率Q10、排氨率Q10綜合分析，認為30 ℃超出圓口銅魚適溫范圍，15～25 ℃范圍內圓口銅魚代謝水平較穩定。

血糖是魚類重要的能源物質，可表示魚類對能量的需求。血糖主要源于消化吸收的葡萄糖或肝糖原的分解和糖異生作用，通常情況下保持動態穩定狀態[21]。低溫應激下，皮質醇含量增加通常作為魚體應激的信號，高皮質醇含量可引起高血糖現象[22]。低溫環境下尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)出現高血糖現象，是為代謝反應提供底物的一種機制[22]。本研究中，10 ℃組圓口銅魚血糖含量顯著高于15、20、30 ℃組，10 ℃組皮質醇含量顯著高于其他組，表明圓口銅魚在此水溫下受到低溫脅迫，為抵御低溫環境，機體大量分解肝糖原，導致血糖含量增加。熱應激下，皮質醇含量增加促進肝糖原分解和糖異生作用增強，血糖含量升高供給能量代謝水平升高的需求，隨時間延長，血糖被消耗，肝糖原大量分解，出現血糖顯著下降的現象[23]。本研究中，當水溫由25 ℃升至30 ℃時，圓口銅魚血糖含量下降，皮質醇含量顯著上升，說明30 ℃條件下，圓口銅魚長時間受到高溫脅迫后，肝糖原大量消耗，導致血糖含量降低。結合耗氧率、排氨率、血紅蛋白含量在30 ℃時顯著下降等現象，認為30 ℃已超出圓口銅魚適溫范圍。氧氮比常用于表示動物體內供能的能源物質的比例，當蛋白質作為主要能源物質時，氧氮比約為7；蛋白質和脂肪共同供能時，氧氮比約為24；脂肪和碳水化合物供能比例越高，氧氮比越大[24-26]。本研究中，10 ℃組圓口銅魚氧氮比值為15.28，顯著低于其他各組，說明圓口銅魚低溫下主要依靠蛋白質供能，可能與低溫下圓口銅魚依附在養殖桶底部，攝食活動較少有關，不利于機體生長。綜合分析，15～25 ℃范圍內，圓口銅魚呼吸代謝水平處于穩定狀態。

能量代謝分為需氧代謝和厭氧代謝兩種途徑。乳酸是厭氧代謝途徑的代謝產物，其含量一定程度上可代表魚體厭氧代謝的水平[27]。水溫升高，機體各類酶活性增強，魚體運動增多，能量需求增大，此時機體需氧代謝提供的能量未能滿足機體需求，機體可通過提升厭氧代謝水平以保證機體能量供應充足[27]。本研究中，15～30 ℃組，圓口銅魚乳酸含量均顯著高于10 ℃組，可能與圓口銅魚恢復運動以及運動增多有關。適溫范圍內，魚類與水環境處于動態平衡狀態。本研究中，水溫處于15～25 ℃范圍內時，圓口銅魚乳酸含量無顯著變化，說明此時圓口銅魚代謝水平處于穩定狀態，這與15～25 ℃水溫范圍內圓口銅魚耗氧率無顯著差異的表現一致。30 ℃時，乳酸含量顯著降低，可能與水溫過高，圓口銅魚受到脅迫，機能受損，代謝水平降低有關。

3.2 水溫對圓口銅魚耗氧率晝夜變化的影響

耗氧率晝夜變化顯示了生物體對環境周期性變化的適應特征，通常分為夜間大于白天、白天大于夜間和晝夜差異不明顯等3種類型。一般來說，耗氧率高表明魚類此時代謝水平較高，正處于較強的活動狀態，如攝食和快速游動[3]。本研究中發現，15、20和25 ℃組圓口銅魚耗氧率均為夜間大于白天類型，這與孫寶柱等[28]的研究結果一致，這說明，15～25 ℃范圍內圓口銅魚夜間活動要強于白天，推測與圓口銅魚夜間攝食習性相關。10 ℃組圓口銅魚耗氧率屬于晝夜差異不明顯型，這與劉飛等[29]報道的圓口銅魚春季白晝型攝食節律的研究結果相符。推測與水溫過低，其攝食活動在水溫較高的正午表現更為活躍有關。本實驗過程中發現，10 ℃時，圓口銅魚全天停留于養殖桶底部，游泳運動較少，這與其此時晝夜耗氧率差異不大一致。30 ℃時，耗氧率晝夜差異不大，此時，水溫較高，圓口銅魚攝食活動不受水溫限制，推測與水溫過高，身體機能受到影響有關。另外，本研究還發現15～25 ℃水溫組，圓口銅魚全天耗氧率均高于10、30 ℃水溫組，與實驗過程中10 ℃組圓口銅魚代謝水平低、30 ℃組血紅蛋白含量顯著降低等表現一致，這說明15～25 ℃范圍內圓口銅魚代謝水平較穩定。

研究表明，水溫24.5～26 ℃范圍內，圓口銅魚(體質量：9.9～14.0 g)晝夜耗氧率在11：00和3：00達到高潮，9：00和21：00達到低潮[28]，而本研究中在17：00達到低潮，推測與實驗魚的規格不同有關。15～25 ℃組圓口銅魚耗氧率均在17：00后開始升高，并在19：00至翌日1：00時間段內維持較高水平，推測圓口銅魚在此時間段內活動強，需氧量大[30]，然而夜間由于浮游植物光合作用弱，水體中氧氣不能及時補充，因此在人工養殖過程中，應注意夜間水體溶解氧的含量，必要時需在夜間人工增氧，避免缺氧事故發生。

4 結論

水溫對圓口銅魚呼吸代謝表征指標及血液學參數具顯著影響。15～25 ℃范圍內，圓口銅魚整體代謝水平穩定；水溫對圓口銅魚耗氧率晝夜變化具顯著影響，應根據不同水溫下耗氧率晝夜特征對投喂時間進行合理調整，以期達到圓口銅魚健康養殖的目的。