飼料中維生素A對黃鱔生長性能、腸道微生物組成和腸道組織結構的影響

黃廣華，胡重華，周秋白，張錦華，陳希環，周磊濤，張文平，陳愷文

(1.江西農業大學動物科學技術學院，南昌 330045；2.南昌市特色水生生物營養生理與健康養殖重點實驗室，南昌 330045)

適宜維生素A(VA )對魚類正常生長、發育和繁殖有重要作用[1]，在動物體內可維持細胞膜以及上皮組織的完整性、通透性[2]；對魚類免疫細胞以及魚類體液免疫因子也能產生積極的作用[3]。研究表明，適宜VA可以提高牙鲆(Paralichthysolivaceus)子代幼魚正常的比例[4]，也可提高草魚(Ctenopharyngodonidellus)[5]、青魚(Mylopharyngodonpiceus)[6]、加州鱸(Micropterussalmoides)[7]的生長性能。然而，維生素缺乏或過量都會影響魚類健康生長。當VA 缺乏時會影響與抗氧化能力相關的物理屏障功能，加劇細胞凋亡[8]，從而導致花鱸(Lateolabraxmaculatus)[2]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚[9]等魚類生長減緩、死亡率升高、皮膚充血、鰓蓋扭曲等；當VA過量時可增加魚類的死亡率、抑制生長或者使得魚類出現脊椎異常生長，以及出現肝臟指數降低等一系列不良情況[7]。

黃鱔(Monopterusalbus)味道鮮美，營養豐富，常生活于水體底層，主要以各種水生動物為食。隨著人工養殖規模和養殖密度的增加，環境及餌料等因素的脅迫均會影響黃鱔生長和免疫，而營養調控可作為一種有效改善黃鱔生長及提高其免疫能力的措施。動物的腸道是抵御病原體入侵的重要物理屏障[10]，腸道微生物與宿主的健康、疾病密切相關[11]，腸壁厚度、腸道皺襞高度也影響著宿主消化吸收營養物質[12]。因此本實驗以1齡人工養殖黃鱔幼苗為實驗對象，在飼料中添加不同量VA，分析其對黃鱔生長、腸道結構發育以及腸道微生物組成的影響，探究VA對黃鱔的影響機制，以期為黃鱔營養學研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗設計及材料

實驗所需黃鱔選自江西農業大學水產養殖基地，體質健壯、規格整齊[均重(7.32±0.02)g]，實驗分為7組，每組4個重復，每個重復45尾。本實驗采用單因素實驗設計，VA醋酸酯(50萬IU/kg)作為添加源，添加水平分別為0(3 201)、500(3 620)、1 000(4 010)、2 000(4 730)、4 000(6 510)、8 000(9 720)、16 000(16 890)IU/kg(括號內為VA在飼料中的實測值)，編號為A～G。所有飼料原料經80目過篩處理，飼料制粒后風干，保存于-20 ℃冰箱備用。飼料原料及配方見參考文獻[13]。

1.2 飼養管理

實驗于江西農業大學水產養殖基地進行。實驗開始前將黃鱔暫養于養殖箱中7 d。正式實驗養殖時間為70 d。整個實驗期間水溫為20.9～29.5 ℃，保持pH在6.5～7.4之間，溶解氧大于5 mg/L，氨氮濃度不高于2.0 mg/L，亞硝酸鹽濃度不高于0.01 mg/L，每日18：00投喂1次，投喂量以大部分黃鱔停止攝食為止。

1.3 樣品采集處理

養殖結束后，停止投喂24 h后，從每箱中隨機選取4尾黃鱔運回實驗室解剖取樣。先將黃鱔稱重、測量體長后尾靜脈采血，采血完成后將黃鱔置于無菌冰盤上解剖。取黃鱔腸道內容物于1.5 mL無菌管中，液氮速凍后轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存，將4尾黃鱔腸道內容物混為一個樣，每組3～4個平行。取前腸于4%多聚甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅染色。

1.4 測定方法

前腸經4%多聚甲醛固定后，用于HE切片制備。腸道內容物按照建庫要求抽提樣品DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，并將通過質量檢驗的DNA樣品用338F和806R引物特異擴增細菌16S rRNA保守的V3-V4區域，于上海美吉生物科技有限公司進行測序，用于腸道微生物組成分析。每個實驗組的黃鱔計數、稱重，計算黃鱔的生長性能指標，增重率(WGR)、特定生長率(SGR)計算公式如下：

WGR=(W2-W1)/W1×100%

SGR=(lnW2-lnW1)/t×100%

式中W1、W2分別為實驗魚的初、末均體重(g)，t為實驗天數(d)。

1.5 數據處理與分析

應用Nikon ECLIPSE Ci觀察拍照組織切片，用Image-Pro Plus6.0測量分析前腸組織的絨毛高度、微絨毛高度、肌層厚度、粘液細胞數量。對測序獲得的原始數據進行過濾、質控等處理。以97%的相似性對數據進行去嵌合體和聚類后的OTU序列采用RDP Classifier進行分類學分析。根據SILVA數據庫對每個OTU的代表序列進行篩選、標注信息。采用Mothur進行Alpha多樣性分析，并繪制稀釋曲線。用Qiime進行beta多樣性分析，LEfSe多級物種判別分析，PICRUSt對OTU豐度表標準化并進行KEGG功能注釋。采用SPSS22.0、STAMP等軟件對數據進行差異分析，P<0.05為顯著差異，有統計學意義。

2 結果

2.1 飼料不同VA水平對黃鱔生長性能的影響

如圖1所示，B～D組黃鱔增重率、特定生長率顯著高于A組。以特定生長率為評價指標，采用折線回歸得出黃鱔對飼料VA適宜需求量為3 849.96 IU/kg(圖2)。

圖1 飼料不同VA水平對黃鱔生長性能的影響Fig.1 Effects of dietary vitamin A level on growth performance of M.albus

圖2 飼料不同VA水平與黃鱔特定生長率的關系Fig.2 Relationship between dietary vitamin A level and SGR of M.albus

2.2 飼料VA水平對黃鱔腸道結構的影響

飼料VA水平對黃鱔腸道結構的影響如表1所示。隨著飼料維生素A水平的升高，前腸絨毛高度、微絨毛高度以及肌層厚度呈先上升后下降的趨勢。與A組相比，B～G組絨毛高度和C組微絨毛高度顯著升高；C～D組肌層厚度和C～E組粘液細胞數量均顯著升高。

表1 飼料VA水平對黃鱔腸道結構的影響Tab.1 Effects of dietary VA levels on intestinal morphology of M.albus

2.3 飼料VA水平對黃鱔腸道菌群結構的影響

2.3.1 飼料VA水平的黃鱔腸道菌群Alpha多樣性差異

綜合考慮，選取A、D、G組黃鱔腸道內容物進行比較分析。稀釋曲線(圖3a)顯示樣品中大部分的OTU都能被檢測到。由表2可知,Sobs指數、Chao1指數、ACE指數、Shannon指數均為D組最高，但三組的Alpha多樣性無顯著性差異。

表2 三組樣品菌群Alpha多樣性差異Tab.2 Differences in Alpha diversity of three sample groups

圖3 三組樣本黃鱔腸道菌群分析Fig.3 Intestinal microflora analysis of M.albus in three groups of samples(a)稀釋曲線；(b)維恩圖；(c)門水平物種組成；(d)屬水平物種組成

2.3.2 飼料VA水平的黃鱔腸道菌群物種組成

基于OTU水平構建維恩圖(圖3b)，結果顯示，A組、D組、G組共有的OTU數量為 862 ，各組特有OTU數量分別為235、420、219，總OTU數量分別為1 463、1 723、1 448。

為了進一步了解飼料VA水平對黃鱔腸道菌群的影響，合并豐度小于1%的部分，分別比較在門、屬水平黃鱔腸道菌群豐度差異。結果發現A組主要以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)為主；D組主要以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門(Actinobacteriota)為主；G組以變形菌門、厚壁菌門、疣微菌門(Verrucomicrobiota)為主(圖3c)。在屬水平上發現所有樣品集中在30個屬上(圖3d)。三個不同處理組的Others屬占比都較大，D組黃鱔腸道屬水平菌群多樣性高于另兩組。A組黃鱔腸道的根瘤菌屬(Rhizobium，7.11%)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas，7.85%)、Neochlamydia(6.09%)豐度較高，D組黃鱔腸道則以根瘤菌屬(12.40%)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia，5.48%)為主；G組黃鱔腸道以衣原體(Chlamydia，18.24%)、羅姆布茨菌屬(9.60%)、狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto，6.78%)為主。

2.3.3 飼料VA水平的黃鱔腸道菌群差異分析

在采用bray curtis算法進行PCoA分析時(圖4)，三組不能分離開。而采用PLS-DA進行分析時(圖5)，三組都可以分離開來，說明飼料中不同VA水平顯著影響了黃鱔腸道菌群組成。

圖4 PCoA圖Fig.4 PCoA

圖5 PLS-DA圖Fig.5 PLS-DA

為了進一步探究三組之間的主要差異物種，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行組間差異檢驗，發現D組在組間擁有較多的顯著差異物種。在門水平上，unclassified_k_norank_d_Bacteria在組間差異顯著(圖6a)。在屬水平上(豐度前15的差異物種)，γ-變形菌科(Gammaproteobacteria)、軍團菌科(Legionellaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、俠義梭菌屬(Clostridiumsensustricto)、水小桿菌屬(Undibacterium)、Hypnocyclicus、井桿菌屬(Phreatobacter)、脫氯菌屬(Dechloromonas)、光合紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、Solitalea、沉積菌科(Sedimentibacter)、脫硫腸狀菌屬(Desulfohalotomaculum)、少鹽芽孢桿菌屬(Paucisalibacillus)等在組間存顯著差異(圖6b)。

圖6 三組腸道菌群差異分析Fig.6 Differential analysis of intestinal flora in three groups of samples(a)門水平，(b)屬水平。圖中*表示P<0.05

使用LEFSe來識別在各組之間具有顯著作用的物種，尋找生物標記物，LDA得分閾值為2分。LEFSe多級物種差異判別分析(圖7)顯示，D組以假單胞菌科(Pseudomonadaceae，LDA得分=3.34，P=0.046)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae，LDA得分=2.85，P=0.028)為差異代謝物種，A組以γ-變形菌目(Gammaproteobacteria，LDA得分=3.63，P=0.043)、γ-變形菌科( Gammaproteobacteria，LDA得分=3.60，P=0.043)、 奈瑟菌科(Neisseriaceae，LDA得分=2.35，P=0.014)為差異優勢物種，G組以沉積菌科(Sedimentibacteraceae，LDA得分=2.32，P=0.040)為差異代謝物種。

圖7 LEFSe多級物種差異判別分析Fig.7 LEFSe multilevel species difference discriminant analysis(a)分支圖，(b)得分圖(LDA>2)

2.3.4 飼料VA水平黃鱔腸道生物群落功能預測

使用PICRUSt2對三組腸道微生物群落的潛在功能進行預測，采用Welch’st-test檢驗對各組間腸道菌群KEGG通路(level2)進行豐度組成差異分析(圖8a)，發現D組與碳水化合物代謝、內分泌系統和其他氨基酸的代謝相關功能基因顯著性高于A組，其余兩組組間無顯著性差異。進一步在KEGG通路(level3)上分析，發現所有樣品共有405個KEGG通路，對豐度前50的進行差異分析，發現D組與糖酵解/糖異生(ko00010，Glycolysis / Gluconeogenesis)代謝相關功能基因顯著高于A組(圖8b)；A與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(ko00260，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝)相關功能基因顯著高于G組(圖8c)；D和G組無顯著性差異。

圖8 各組KEGG通路差異分析Fig.8 Analysis of KEGG pathway difference among groups(a)A、D組KEGG通路(level2)差異分析；(b)A、D組KEGG通路(level3)豐度前50差異分析；(c)A、G組KEGG通路(level3)豐度前50差異分析

3 討論

3.1 飼料VA水平對黃鱔生長性能的影響

VA具有維持動物正常生長發育、調節免疫力等多種生理功能[14]，可不同程度促進養殖魚類的生長[15-18]。在本實驗中，B～D組(VA水平3 620～4 730 IU/kg)顯著提高了黃鱔特定生長率和增重率。本實驗以特定生長率為評價指標，采用折線模型分析，得出黃鱔[(7.32±0.02)g]適宜需求量為3 849.96 IU/kg。研究表明，飼料中VA缺乏或者過量時養殖動物會表現相應的VA缺乏癥和毒害表現，如死亡率增加等[5，19，20]。在本實驗中，低水平VA(3 201 IU/kg)時未見黃鱔明顯VA缺乏癥，可能是本實驗飼料原料的VA在一定程度上被黃鱔利用，設置的最低VA水平未達到黃鱔缺乏VA水平。有研究表明，南美白對蝦(Penaeusvannamei)[21]、幼鮑(Haliotisdiscushannai)[22]缺乏VA時生長明顯下降，但對其死亡率無顯著影響。在本實驗的高水平VA(16 890 IU/kg)中，黃鱔的生長減緩，但未明顯見其它高VA時的毒害表現，這可能與VA的添加水平、黃鱔的短期飼養及發育階段等有關[20，23]。HILTON[24]研究發現虹鱒(Salmogairdneri)VA水平在904 000 IU/kg時，虹鱒死亡率僅1%；當餌料VA添加水平高達8 104 000 IU/kg時，死亡率14.5%。由此推測當黃鱔飼料VA水平處于更高水平時方可見顯著的毒害表現。關于飼料中更低和更高水平的VA是否會對黃鱔生長產生顯著的負面影響尚有待進一步的研究。

3.2 飼料VA水平對黃鱔前腸結構的影響

腸道是動物體消化吸收營養成分的主要場所，其結構及黏膜的生長對動物體吸收營養物質有很大的影響[25]。小腸絨毛是決定消化吸收的重要結構基礎，常用來評價腸道形態[26]，動物體對營養物質的吸收率與小腸絨毛高度、腸吸收面積呈正相關關系[27]。研究表明飼料中適量增加VA可增加鴨腸道的絨毛長度[28]，可顯著增加斷奶仔豬小腸絨毛寬度和絨毛高度[29]，提高生產性能。但是過高濃度的VA對動物體會產生負面影響，梁達智[30]發現過量的VA會降低珍珠龍膽石斑魚幼魚的絨毛高度和肌層厚度，導致生長性能下降。在本實驗中隨著飼料VA水平的提高，黃鱔腸道絨毛高度、腸壁厚度、微絨毛高度以及粘液細胞數量先升高后下降，可見飼料適宜VA水平(3 620 ～4 730 IU/kg)可通過改善腸道結構促進腸道對營養物質的吸收和消化，從而促進生長；但高水平VA(16 890 IU/kg)不利于腸道結構的發育，降低了黃鱔的生長性能。

3.3 飼料VA水平對黃鱔腸道菌群影響

腸道菌群組成對宿主健康、新陳代謝、營養物質消化吸收和免疫等有重要影響[31]。在淡水養殖魚類腸道中，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門較為常見[32]。王穎[33]在分析黃鱔腸道菌群時發現變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門為黃鱔核心菌門。與此結果類似，在本實驗中黃鱔優勢菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門。Alpha多樣性分析可以反映樣本群落的豐富度和多樣性。Chao1和ACE指數越大則物種豐富度越高；Shannon指數越大，Simpson指數越小則物種多樣性越高。本實驗中，攝食不同VA水平飼料的黃鱔腸道微生物Alpha多樣性先增加后減少，Sobs指數、Chao1指數、ACE指數、Shannon指數均在D組(4 730 IU/kg )最高，D組物種多樣性和豐富度最高。進一步分析發現，D組飼料VA水平下差異代謝物種為草酸桿菌科、假單胞菌屬，G組(16 890 IU/kg)差異代謝物種為沉積菌科。研究表明，鐵元素在微生物新陳代謝過程中非常重要[34]，假單胞菌Bfr蛋白可能是一種重要的儲鐵蛋白[35]，促進細菌生長。沉積菌屬可代謝氨基酸形成乙酸和丁酸[36]，乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸有抑菌的作用。

從飼料不同VA水平對黃鱔腸道物種組成的結果分析可知，飼料VA水平對菌群組成有較大的影響，添加適量水平VA(4 730 IU/kg)可改善黃鱔腸道菌群結構，過量添加(16 890 IU/kg)則增加了潛在致病菌的豐度。本實驗中，一定程度上提高VA水平，提高了厚壁菌門、放線菌門、根瘤菌、羅姆布茨菌等菌群豐度。研究表明腸道厚壁菌門可促進脂肪酸、碳水化合物的代謝[37]；羅姆布茨菌則可利用不同種類簡單碳水化合物合成氨基酸和維生素[38]；放線菌門可產生多種活性天然產物(淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等水解酶[39]；根瘤菌可能和寡營養生境中氮的分解和礦化有關，促進氮源利用[40]。胡重華等[13]前期研究發現飼料適宜VA水平對黃鱔組織蛋白酶和脂肪酶活性有顯著影響，所以適宜的VA水平可能是通過提高益生菌的益生作用，如產生酶類或者提高對營養物質的消化吸收來促進機體生長。本實驗也發現一定程度提高VA水平后降低了變形菌門、鄰單胞菌屬等菌群豐度，而在添加高水平VA后增加了疣微菌門、衣原體屬等菌群豐度。研究表明，變形菌門豐度過高可能導致機體更易患病，其豐度增加可作為疾病的潛在診斷標準[41]；鄰單胞菌屬中多為條件致病菌，其中類志賀鄰單胞菌對大布氏鱘有較強的致病性可導致其患病死亡[42]；衣原體則可造成幼體和稚扇貝生長緩慢[43]?？梢娺m量的VA水平可通過菌群的益生作用提高消化酶或者增強脂肪酸和碳水化合物代謝，促進機體對營養物質的吸收來提高自身的生長性能，并在減小黃鱔生長過程中患病風險方面有重要的意義。

3.4 飼料VA水平黃鱔腸道生物群落功能預測分析

魚類利用碳水化合物的能力較差，曾被稱為天生的糖尿病患者[44]；糖酵解/糖異生是碳水化合物代謝的主要途徑之一，而大部分魚類因未及時有效地將碳水化合物轉化為肝糖原、肌糖原和脂肪進而導致出現持續高血糖[45]。對KEGG功能分析發現，D組的碳水化合物代謝、內分泌系統、糖酵解/糖異生相關代謝基因豐度顯著高于A組，A、G組無顯著性差異?？梢?，適宜飼料VA水平可促進碳水化合物代謝，有利于黃鱔對碳水化合物的吸收利用。G組甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝相關代謝基因豐度顯著低于A組。從營養平衡角度，飼料中VA水平為 4 730 IU/kg有利于促進黃鱔碳水化合物代謝，從而減少其對氮源的需求。

4 結論

飼料中適宜VA水平可改善黃鱔腸道結構，增加腸道菌群豐富度和多樣性，提高碳水化合物代謝相關基因豐度，提高黃鱔生長性能。以特定生長率為評價指標，采用折線模型得出體質量(7.32±0.02)g黃鱔VA適宜需求量為3 849.96 IU/kg；綜合考慮黃鱔生長性能和腸道健康，本實驗飼料中適宜VA水平為3 620 ～4 730 IU/kg。