超高效液相色譜-串聯質譜法測定洗發水中14種防脫育發類藥物的含量

唐柏彬, 劉 貝, 鄭 文, 嚴貴濘, 王聰玲, 郗存顯

(重慶海關技術中心, 重慶 400020)

受自然環境、飲食習慣、生活節奏等因素影響,面臨脫發困擾的人數日益增加,而且發病年齡日趨年輕化[1]。臨床研究表明,能有效治療和抑制脫發的藥物有抗雄激素類、前列腺素F2α類、前列腺素D2抑制劑、雄激素受體抑制劑等[2-5]。藥物治療雖然效果好、見效快,但長期使用這些藥物會導致皮膚過敏、性功能障礙等副作用[3-5]?！痘瘖y品安全技術規范(2015年版)》中已經明確禁用的藥物有米諾地爾、螺內酯和酮康唑等[6]。受利益的驅使,不乏有違法添加的行為發生。目前已有米諾地爾、螺內酯、酮康唑等的檢測方法[6],但覆蓋范圍窄,無法同時分析,因此需要建立同時檢測多種防脫育發類藥物的高靈敏度的方法。

目前防脫育發類藥物的檢測方法主要有薄層色譜法[7]、液相色譜法[8-12]、液相色譜-串聯質譜法[13-16]和液相色譜-高分辨質譜法[12,17]等,其中液相色譜-串聯質譜法專一性強、靈敏度高、普及度廣,是高通量、快速檢測多種化合物的首選方法。液相色譜-串聯質譜法檢測前,多采用甲醇[12-13,15-17]、乙腈[11,14]等超聲處理樣品,這種前處理方式簡單,但提取液中雜質多、基質效應(ME)強,容易污染色譜柱和質譜系統。本工作選擇臨床證明具有防脫育發功效的西咪替丁、米諾地爾、美拉酮寧、香草酸甲酯、酮康唑、比馬前列素、非那雄胺、塞替匹侖、尼魯米特、氟羅地爾、螺內酯、氟他胺、拉坦前列素、度他雄胺等14種藥物為研究對象,考察并優化提取和凈化條件,采用超高效液相色譜-串聯質譜法進行測定,為洗發水中多種防脫育發類藥物的監測提供有效的技術手段。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Shimadzu LC-30A型超高效液相色譜儀;AB SCIEX QTRAP 5500型三重四極桿串聯質譜儀;5920R型臺式高速冷凍離心機;KQ-300DE型超聲波清洗器;XH-B型渦旋混勻器;N-EVAP型氮吹儀。

單標準儲備溶液：分別稱取適量的西咪替丁、米諾地爾、美拉酮寧、香草酸甲酯、酮康唑、比馬前列素、非那雄胺、塞替匹侖、尼魯米特、氟羅地爾、螺內酯、氟他胺、拉坦前列素、度他雄胺標準品,用甲醇配制成質量濃度為1 000 mg·L-1的單標準儲備溶液,于2～10 ℃保存。使用時,用50%(體積分數,下同)乙腈溶液稀釋至所需質量濃度。

混合標準儲備溶液1和2：分別移取適量的單標準儲備溶液,用50%乙腈溶液稀釋,配制成西咪替丁、米諾地爾、美拉酮寧、比馬前列素、非那雄胺、塞替匹侖、氟他胺、尼魯米特和氟羅地爾質量濃度均為1 mg·L-1的混合標準儲備溶液1,和香草酸甲酯、酮康唑、螺內酯、拉坦前列素和度他雄胺質量濃度均為10 mg·L-1的混合標準儲備溶液2,于2～10 ℃保存。

西咪替丁、米諾地爾、美拉酮寧、香草酸甲酯、酮康唑、比馬前列素、非那雄胺、塞替匹侖、尼魯米特、氟羅地爾、螺內酯、氟他胺、拉坦前列素、度他雄胺標準品的純度均大于98%;乙腈、二氯甲烷、甲酸、乙酸銨均為色譜純;氯化鈉、冰乙酸均為分析純;試驗用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1．2．1 色譜條件

Waters Accquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫40 ℃;流動相A為乙腈,B為含0.1%(體積分數,下同)甲酸的2 mmol·L-1乙酸銨溶液;流量0.3 mL·min-1;進樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～0.5 min時,B為90%;0.5～4.0 min時,B由90%降至15%,保持2.0 min;6.0～6.5 min時,B由15%升至90%,保持0.5 min。

1．2．2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正(ESI+)、負離子(ESI-)模式掃描;電噴霧電壓5 500 V(ESI+)和-4 500 V(ESI-);離子源溫度550 ℃;氣簾氣壓力0.24 MPa,霧化氣壓力0.34 MPa,輔助氣壓力0.34 MPa;碰撞室入口電壓10 V,出口電壓13 V;駐留時間25 ms;多反應監測(MRM)模式檢測;其他質譜參數見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質譜參數Tab. 1 MS parameters

1．3 試驗方法

稱取2 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL水,振蕩溶解后,加入20 mL乙腈,超聲提取20 min。取出,加入5 g氯化鈉,振蕩1 min,以轉速5 000 r·min-1離心5 min,取1 mL上清液于玻璃試管中,于40 ℃水浴氮吹至干,用1 mL體積比95∶5∶0.1的二氯甲烷-甲醇-乙酸混合溶液溶解殘渣。溶液轉移至經活化的氨基固相萃取柱(500 mg/3 mL),用1 mL體積比95∶5∶0.1的二氯甲烷-甲醇-乙酸混合溶液洗滌試管,洗滌液過柱,棄去流出液,用8 mL體積比95∶5∶0.1的二氯甲烷-甲醇-乙酸混合溶液洗脫,收集洗脫液,于40 ℃水浴氮吹至干,用1 mL 50%乙腈溶液溶解殘渣,過0.22 μm微孔濾膜,濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2．1 質譜條件的優化

以流動注射的方式,將1 mg·L-1單標準溶液注入三重四極桿串聯質譜儀中,一級質譜掃描顯示氟他胺、氟羅地爾、尼魯米特和香草酸甲酯在ESI-模式下具有很好的響應,其他化合物則在ESI+模式下響應較高。在對應的離子化模式下進行二級質譜掃描獲得二級碎片離子,選擇響應較高的子離子在MRM模式下進行質譜參數的優化。優化的質譜參數見1.2.2節。

2．2 色譜條件的優化

試驗選用常用的Waters Accquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),考察了分別以乙腈-含0.1%甲酸的2 mmol·L-1乙酸銨溶液和甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L-1乙酸銨溶液為流動相體系時梯度洗脫的效果。結果表明：乙腈-含0.1%甲酸的2 mmol·L-1乙酸銨溶液對目標物的分離效果更好,雖然沒有實現所有目標物的基線分離,但各目標物的檢測離子均不相同,可以借助三重四極桿串聯質譜儀的高分辨能力實現分離,不會互相干擾檢測。因此,試驗選擇采用乙腈-含0.1%甲酸的2 mmol·L-1乙酸銨溶液為流動相體系進行梯度洗脫?；旌蠘藴嗜芤?香草酸甲酯、酮康唑、螺內酯、拉坦前列素和度他雄胺質量濃度均為100 μg·L-1,其他目標物質量濃度均為10 μg·L-1)的總離子流色譜圖見圖1。

峰號1～14對應的化合物名稱同表1圖1 混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the mixed standard solution

2．3 提取溶劑的優化

溶解性調查顯示14種目標物難溶于水,易溶于甲醇、二氯甲烷等有機溶劑。試驗采用超聲提取的方式,考察了提取溶劑分別為甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯時對空白加標樣品(加標量均為50 μg·kg-1)中目標物回收率的影響。結果顯示：以乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇提取時,14種目標物的回收率分別為5.30%～123%,11.0%～124%,85.6%～112%,82.2%～97.4%,其中乙腈和甲醇的提取效率較好。與甲醇溶液相比,乙腈溶液中加入氯化鈉能夠很好的實現鹽析分層,使樣品中的烷基磺酸鈉等鹽類極性雜質溶解在水相。因此,試驗以水溶解樣品,采用乙腈超聲提取后加入氯化鈉鹽析,取乙腈層進行下一步凈化。

2．4 凈化條件的優化

試驗考察了分別以HLB、MCX、C18和氨基固相萃取柱凈化后14種目標物的ME。分別用空白樣品溶液和50%乙腈溶液(溶劑)配制相同質量濃度的混合標準溶液,根據(目標物在空白樣品溶液中的峰面積/目標物在溶劑中峰面積-1)×100%計算ME值,結果見表2。

表2 固相萃取柱對目標物基質效應的影響Tab. 2 Effect of solid phase extraction column on the matrix effect of targets

結果顯示：HLB、C18固相萃取柱凈化后,各目標物ME并沒有得到改善;MCX固相萃取柱凈化后,減小了西咪替丁、美拉酮寧和比馬前列素的ME,而其他化合物ME沒有得到改善;氨基固相萃取柱凈化后,螺內酯、拉坦前列素、美拉酮寧、比馬前列素、氟羅地爾等5種目標物的ME絕對值小于20.0%,其他化合物的ME值為27.3%～71.6%。因此,試驗選擇以氨基固相萃取柱凈化提取液,并采用基質匹配的混合標準溶液繪制工作曲線,以提高定量的準確度。

2．5 工作曲線、檢出限和測定下限

按照試驗方法對空白樣品進行處理,加入適量的混合標準儲備溶液1和2,配制成質量濃度為1.0,2.5,5.0,10.0,25.0,50.0 μg·L-1的基質匹配的混合標準溶液系列。按照儀器工作條件測定,以目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸。結果表明：14種目標物工作曲線的線性范圍均為1.0～50.0 μg·L-1,線性參數見表3。

表3 線性參數、檢出限和測定下限Tab. 3 Linearity parameters, detection limits and lower limits of determination

分別以3,10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果見表3。

2．6 精密度和回收試驗

對空白樣品進行10.0,20.0,100.0 μg·kg-1等3個濃度水平的加標回收試驗,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

表4 精密度和回收試驗結果(n=6)Tab. 4 Results of tests for precision and recovery(n=6)

2．7 樣品分析

按照試驗方法對購置的10個宣稱具有防脫育發作用的洗發水進行分析,共檢出兩個陽性樣品,其中1個樣品檢出米諾地爾、西咪替丁、塞替匹侖、酮康唑、尼魯米特和氟羅地爾等6種藥物,檢出量分別為40.3,47.8,7.1,2.6,0.7,0.4 μg·kg-1;另外1個樣品檢出美拉酮寧,檢出量為7.9 μg·kg-1。從檢測結果可以看出,洗發水中存在防脫育發類藥物非法添加的情況,且有多種藥物混合使用的現象,因此需要加強對洗發水中此類藥物的監測。

本工作提出了超高效液相色譜-串聯質譜法測定洗發水中14種防脫育發類藥物含量的方法,該方法靈敏度高、準確度好,滿足測定分析要求,可用于洗發水中多種防脫育發類藥物的同時檢測。