基于形態標記和ISSR分子標記的長瓣鐵線蓮遺傳多樣性分析

賈艷艷 邱玉鵬 周欣瑩 耿宇航 孫浩男 劉冬云

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.008

引用格式：

賈艷艷， 邱玉鵬， 周欣瑩，等.基于形態標記和ISSR分子標記的長瓣鐵線蓮遺傳多樣性分析［J］.草地學報，2024，32（1）：75-86

JIA Yanyan， QIU Yupeng， ZHOU Xinying，et al.Genetic Diversity Analysis of Clematis macropetala Based on ISSR and Morphological Markers［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：75-86

收稿日期：2023-06-01；返修日期：2023-11-18

基金項目：河北省鐵線蓮屬植物種質資源收集與新種質創制（20326339D）資助

作者簡介：

賈艷艷（1996-），女，漢族，河北承德人，碩士研究生，主要從事園林花卉育種栽培方向研究，E-mial：331291361@qq.com；*通信作者 Author for correspondence，E-mial：510297525@qq.com

摘要：為快速區分鑒定市場上繁多的長瓣鐵線蓮（Clematis macropetala）品種，了解長瓣鐵線蓮間的遺傳多樣性水平及親緣關系，本試驗利用形態標記結合ISSR分子標記對25個長瓣鐵線蓮品種和1個野生種進行遺傳多樣性研究。結果表明：14個數量形狀的變異系數在0.24%～2.32%之間；15個假質量性狀的信息多樣性指數H在0～2.29%之間，遺傳多樣性指數D在0～0.94%之間；在歐式距離為15時，可將29個表型性狀劃分為七類，在歐式距離為15時，可將26個長瓣鐵線蓮劃分為五類。12條引物共擴增出144個條帶，多態性條帶占比為100%。利用引物UBC815、UBC824和UBC836構建26個長瓣鐵線蓮的指紋圖譜，可快速區分鑒定26個長瓣鐵線蓮。UPGMA聚類結果顯示，在遺傳相似系數為0.68時，可將26個長瓣鐵線蓮劃分為八大類。形態標記結合ISSR分子標記可有效鑒別長瓣鐵線蓮種質資源，以期為長瓣鐵線蓮種質資源收集保存、創制新品種等提供理論基礎。

關鍵詞：長瓣鐵線蓮；形態標記；ISSR分子標記；遺傳多樣性；

中圖分類號：S682.1+9??? 文獻標識碼：A????? 文章編號：1007-0435（2024）01-0075-12

Genetic Diversity Analysis of Clematis macropetala Based on

Morphological Markers and ISSR Molecular Makers

JIA Yan-yan， QIU Yu-peng， ZHOU Xin-ying， GENG Yu-hang， SUN Hao-nan， LIU Dong-yun*

（Hebei Agricultural University Baoding， Baoding， Hebei Province 071000， China）

Abstract：This experiment aimed to quickly distinguish and identify the varieties of Clematis macropetala on the market，and to understand diversity and relationships among 26 Clematis macropetala samples.The experiment used morphological markers combined with ISSR molecular markers to study genetic diversity and phylogenetic relationships among 26 Clematis macropetala.The results showed that the variation coefficient of 14 quantitative shapes ranged from 0.24% to 2.32%，with an average coefficient of variation of 0.29% for leaf indicators and 0.64% for flower indicators.The information diversity index H of 15 quality traits ranged from 0 to 2.29%，and the genetic diversity index D ranged from 0 to 0.94%. At a European distance of 15，29 phenotypic traits were divided into 7 categories，and at a European distance of 15，26 samples of Clematis macropetala were divided into 5 categories. The total of 144 bands were amplified using 12 primers，with a polymorphism rate of 100%. Using primers UBC815，UBC824，and UBC836 to construct fingerprint maps of 26 Clematis macropetala，26 Clematis macropetala were quickly distinguished and identified. The UPGMA clustering analysis results showed that when the genetic similarity coefficient was 0.68，26 Clematis macropetala could be divided into 8 categories.Phenotypic traits combined with ISSR molecular markers could effectively identify the germplasm resources of Clematis macropetala. These research results provided a theoretical basis for the collection and preservation of Clematis macropetala germplasm resources，as well as the creation of new varieties.

Key words：Clematis macropetala;Morphological markers;ISSR molecular markers;Genetic diversity

鐵線蓮屬（Clematis）植物具有較高的觀賞價值和應用價值，常被用于植物園、公園和家庭花園等地的裝飾綠化［1-3］。長瓣鐵線蓮為攀援藤本花卉，花形奇特，呈鐘狀到碗狀，藍紫色花色在自然界中較為少見，外輪雄蕊不育，多瓣化，花瓣狀退化雄蕊數量眾多。長瓣鐵線蓮是很好的花卉裝飾材料，在國外被廣泛應用于園林的垂直綠化，可配植于假山或巖石園中，亦可做切花、瓶插、盆景等應用，但在國內鮮有應用［4-5］。

遺傳標記主要有4種，即形態標記（Morphological marker）、細胞標記（Cytological marker）、生化標記（Biochemical marker）和分子標記（Molecular marker）［6］。4種標記方法各有利弊，結合2種或2種以上標記方法可提高結果可靠性。董媛等［7］利用形態標記對河南洛陽9種常見栽培芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）品種進行了分類；李曉慧等［8］對17份葉菜用甘薯（Dioscorea esculenta）進行形態標記研究時表明，由于環境因素影響，形態標記在多數植物中多態性較差，存在表現型不同而遺傳物質相同，或表現型相同而遺傳物質不同等情況，需結合分子標記進行深入研究。

王楠等［9］以鐵線蓮園藝品種‘Gravetye Beauty為研究對象，應用ISSR分子標記技術建立了最優ISSR-PCR反應體系。和文志等［10］以16個鐵線蓮品種為試驗材料，采用ISSR分子標記技術研究了16個品種的遺傳多樣性。王鑫等［11］以河北省17個野生鐵線蓮為試驗材料，采用ISSR和rDNA-ITS標記方法鑒定了17個野生種間的親緣關系。余偉軍等［12］以32個鐵線蓮屬植物為試驗材料，采用ISSR分子標記技術研究了32個試驗材料間的遺傳多樣性。鐵線蓮屬植物約有300種之多，經過育種專家長期的繁殖培育，很多早已無法追溯遺傳背景。為解決鐵線蓮屬植物遺傳背景模糊復雜的問題，前人多從形態學和細胞學上對鐵線蓮屬植物進行了遺傳多樣性及親緣關系研究［13-17］，但對于分子生物學的相關研究報道較少。常用的分子標記方法有RAPD（隨機擴增多態性DNA）、SRAP（相關序列擴增多態性）、SSR（簡單重復序列）、ISSR（簡單序列重復區間）、及ITS序列等，與其他分子標記技術相比，ISSR分子標記技術具有多態性豐富，易操作，穩定性高的優點，被廣泛應用于植物品種鑒定、遺傳多樣性和系統發育等研究中［18-20］。

本試驗對26個長瓣鐵線蓮進行形態及ISSR分子標記遺傳多樣性研究，探究長瓣鐵線種質資源的遺傳多樣性水平及親緣關系，以快速區分鑒定市場上繁多的長瓣鐵線蓮品種，為ISSR分子標記技術在長瓣鐵線蓮品種分類測評鑒定、遺傳多樣性評價、親緣關系分析等方面研究提供理論依據。形態標記結合ISSR分子標記可有效鑒別長瓣鐵線蓮種質資源，研究結果可為長瓣鐵線蓮種質資源收集保存、創制新品種等提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

26份供試材料由課題組于2019—2021年收集自國內外，每個品種（野生種）引種10株，種植于河北農業大學試驗基地，種植基質為進口草炭∶珍珠巖∶10～15 mm樹皮=3∶1∶1。供試材料相關信息詳見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 形態數據測量? 參考《植物新品種特異性、一致性、穩定性測試指南鐵線蓮》［21］選取29個表型性狀，其中數量性狀14個（表2），假質量性狀15個（表3）。表型性狀的數據獲取于盛花期及葉片成熟期2個階段進行，每個品種選取10株長勢基本一致的植株進行性狀調查，盛花期進行花的相關性狀測量調查，葉片成熟期進行葉的相關性狀測量調查。

1.2.2? DNA的提取與檢測? DNA的提取采取試劑盒法（CW0531S，康為世紀），DNA純度采用微量紫外分光光度計進行檢測，要求其純度（OD260/OD280）在1.6～2.0之間，剔除不合格的樣本重新提取至合格。將DNA母液濃度稀釋成40 ng·μL-1的工作液，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測［10］。

1.2.3? ISSR引物篩選及PCR擴增? 參照王鑫等［11］篩選出的12條引物進行試驗。12條引物相關信息見表4。

ISSR-PCR反應體系為25.0 μL，具體包括：1.0 μLDNA工作液、2.0 μL引物、12 μL 2× Es Taq Master Mix、10 μLddH2O。

ISSR-PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性50 s；50℃退火1 min；72℃延伸1 min；36個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.4? 數據處理

（1）形態指標數據處理

利用Excel 2019對調查測定的表型性狀數據進行整理，計算14個數量性狀的最小值、最大值、極差、平均值、標準差和變異系數；計算15個假質量性狀的分布頻率及Shannon-Wiener信息指數H（H=1-∑in=iPilnPi）和Simpson遺傳多樣性指數D（D=1-∑in=1P2i），式中：Pi為某一性狀第i級內材料份數占總份數的百分比。利用SPSS26.0基于歐式遺傳距離（Euclidean distance）對29個表型性狀進行R型聚類分析，對26個長瓣鐵線蓮品種（種）進行Q型聚類分析。

（2）ISSR分子標記數據處理

依據人工讀帶原則，同一引物擴增出來的條帶，在同一位置上出現清晰無拖帶條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建立0，1矩陣。利用NTsys軟件計算遺傳相似系數，使用UPGMA法繪制聚類分析圖［22］。使用POPGENE軟件計算等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannons多樣性信息指數（I）、Neis基因多樣性指數（H）等指標。選擇具有良好多態性位點的引物，構建26個長瓣鐵線蓮的指紋圖譜［23］。

2? 結果與分析

2.1? 形態標記遺傳多樣性結果與分析

2.1.1? 14個數量性狀的多樣性分析? 由表5可知，14個數量形狀的變異系數在0.24%～2.32%之間，其中復葉長，復葉寬和萼片長的變異系數均最小，為0.24%；花瓣狀退化雄蕊數量的變異系數為2.32%，表明花瓣狀退化雄蕊的變異較為豐富，長瓣鐵線蓮品種‘粉紅瑪卡的花瓣狀退化雄蕊數量為0，而海洋珍珠的花瓣狀退化雄蕊數量最多可達311個。葉指標的平均變異系數為0.29%，花指標的平均變異系數為0.64%，可見長瓣鐵線蓮花的變異較為豐富。

2.1.2? 15個假質量性狀的多樣性分析? 由表6可知，15個假質量性狀的信息多樣性指數H在0～2.29%之間，遺傳多樣性指數D在0～0.94%之間，葉片形狀、葉片頂端形狀、葉片基部形狀、萼片上表面主要顏色、萼片下表面主要顏色、萼片上表面顏色分布（1種顏色）、萼片上表面次色分布（兩種以上顏色）、萼片邊緣波狀程度、花瓣狀退化雄蕊主要顏色，9個指標的H和D值均較高，表明這些指標在26個長瓣鐵線蓮中表現出較高的遺傳多樣性。

2.1.3? 基于表型性狀的聚類分析

（1）29個表型性狀的R型聚類分析

由圖2可知，在歐式遺傳距離為15時，可將29個表型性狀劃分為七大類，第一類包括萼片上、下表面主要顏色等4個假質量性狀；第二類包括葉片頂端形狀和葉片基部形狀兩個假質量形狀；第三類包括的表型性狀數量最多，包含花瓣狀退化雄蕊長度、花瓣狀退化雄蕊寬度、株高等16個表型性狀；第四類包括花量和葉片形狀兩個表型性狀；第五類包括花瓣狀退化雄蕊數量、萼片基部形狀和萼片上表面顏色分布（1種顏色）3個性狀；第六類僅包含萼片邊緣起伏；第七類僅包含萼片上表面次色分布（2種以上顏色）。

（2）26個長瓣鐵線蓮的Q型聚類分析

由圖3可知，在歐式距離為15時，可將26個長瓣鐵線蓮樣本劃分為五大類，第一類包括‘梅德威爾、‘弗朗姬和‘拉古等11個樣本；第二類包括‘粉紅火烈鳥、‘紫色驚喜和‘鄉村玫瑰等5個樣本；第三類僅包含‘珍珠海洋；第四類包括‘黃金之夢、‘粉色秋千和‘檸檬之夢等8個樣本；第五類僅包含‘金色斯托爾維克。第一類的11個長瓣鐵線蓮花色均為藍紫色，花瓣狀退化雄蕊數量較多，重瓣較高。第三類的‘珍珠海洋花形最為獨特，既無雄蕊亦雌蕊，花瓣狀退化雄蕊數量100多。第五類的‘金色斯托爾維克葉色為金黃色，與其他長瓣鐵線蓮存在顯著差異。

2.2? ISSR分子標記遺傳多樣性結果與分析

2.2.1? DNA提取與檢測? 26個樣本DNA的電泳檢測，結果顯示樣本DNA母液電泳結果均為一條清晰明亮的條帶，26個樣本純度高滿足后續反應對模板DNA的質量要求（圖4）。

2.2.2? ISSR引物篩選及擴增結果? 12條引物共擴增出144條清晰條帶，其中特異性條帶144條，每個引物平均擴增出12個位點，平均特異性位點12個，多態性比率達到100%（表7）。12條引物可擴增出6～17條數量不等的條帶，擴增條帶片段大小為200～2 000 bp，其中，引物UBC815擴增出數量最多的多態性條帶（圖5），為17條。引物U844擴增出數量最少的多態性條帶，為6條。利用POPGENE分析26份長瓣鐵線蓮樣本DNA多樣性，鐵線蓮等位基因數（Na）為1.993 1，有效等位基因數（Ne）為1.293 4，Neis基因多樣性指數（H）為0.201 4，Shannons多樣性信息指數（I）為0.336 2，表明26個長瓣鐵線蓮具有較高的DNA多態性和豐富的遺傳多樣性。

2.2.3? 26個長瓣鐵線蓮的ISSR聚類結果? 利用12條引物擴增出來的144個條帶構建0、1矩陣，導入Ntsys建立26個長瓣鐵線蓮種質資源遺傳相似系數矩陣（表8），26個供試樣本的遺傳相似系數在0.052 6～0.477 3之間，平均相似系數為0.20，說明26個長瓣鐵線蓮間具有較高的遺傳多樣性。其中，‘金色斯托爾維克和‘紫色驚喜的遺傳相似系數最小為0.052 6，表明二者之間親緣關系較遠；從形態學角度來看，二者間的確存在較大差異，‘金色斯托爾維克葉色為黃綠色，葉型為倒卵圓形，葉片邊緣為圓齒狀，花色為藍紫色，萼片形狀為橢圓形；‘紫色驚喜葉色為淺綠色，葉型為披針形，葉片邊緣為鋸齒狀，花色為紫色，萼片形狀為披針形。

‘塞西爾和‘弗朗姬的遺傳相似系數較大為0.477 3，說明兩者間具有較近的親緣關系；形態標記聚類時，二者同樣被劃分為一類，‘塞西爾和‘弗朗姬的大多形態指標相近，例如葉片顏色為淺綠色，葉片形態相近，幼枝都被稀疏短絨毛，葉片均被毛，花朵均具淡香，花朵大小相近，萼片排列方式均為相接，萼片先端均不反折，形狀均為急尖，萼片縱切面形狀均為凸狀，萼片邊緣無起伏，萼片及花瓣狀退化雄蕊主要顏色均為藍紫色等。

綜合26個供試樣本的遺傳相似系數，‘金色斯托爾維克與其他的樣本間的遺傳相似系數較小，在0.05～0.31之間，說明‘金色斯托爾維克與其他品種及野生種的親緣關系較遠，在形態標記聚類時‘金色斯托爾維克單獨被劃分為一類。26個樣本的UPGMA法的聚類結果表明，在相似系數為0.68處，可將26個長瓣鐵線蓮劃分為八類（圖6）。其中，‘黃金之夢劃分為第一類，‘琥珀劃分為第二類，阜平長瓣鐵線蓮劃分為第三類，‘鄉村玫瑰劃分為第四類，‘峭壁劃分為第五類，‘金色驚喜，‘紫色驚喜，‘檸檬之夢劃分為第六類，‘拉古劃分為第七類，其余17個品種劃分為第八類。

聚類結果顯示‘金色斯托爾維克與其他16個品種被劃分為一類，且與‘紫色之夢親緣關系較近，從形態學角度來看，‘金色斯托爾維克葉色為黃綠色，葉型為倒卵圓形，葉片頂端形狀為急尖，葉片基部形狀為楔形，花色為藍紫色，萼片形狀為橢圓形，花瓣狀退化雄蕊數量較少；而‘紫色之夢葉色為淡綠色，葉型為卵圓形，葉片頂端形狀為卷須狀，葉片基部形狀為鈍圓形，花色為紫粉色，萼片形狀為卵圓形，花瓣狀退化雄蕊數量相對較多，但形態聚類‘金色斯托爾維克被單獨劃分為一類，形態學聚類與分子學聚類存在差異。

2.2.4? 26個長瓣鐵線蓮的ISSR指紋圖譜構建? 為快速區分鑒定26個長瓣鐵線蓮，利用多態性高、條帶清晰的ISSR引物UBC815，UBC824和UBC836構建26個長瓣鐵線蓮的數字指紋圖譜（表9）。

3? 討論

物種的遺傳多樣性是其長期進化的結果，也是其生存、適應和發展的前提，遺傳多樣性在物種形態、分子水平上均有所表現，豐富的遺傳多樣性是寶貴的基因資源［24-25］。形態標記表現直觀，易于調查測量，其變異系數和多樣性指數反映了種質間性狀的離散程度和多樣性，是研究植物遺傳多樣性的重要方法［26］。沈瑤等［27］在研究30個盆栽菊（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）品種形態遺傳多樣性時發現，性狀變異系數為14.67%～78.25%，最低和最高變異系數分別為冠幅和舌狀小花數，表明盆栽菊品種表型變異豐富。本試驗中長瓣鐵線蓮復葉長，復葉寬和萼片長的變異系數均最小，為0.24%；花瓣狀退化雄蕊數量的變異系數為2.32%，表明花瓣狀退化雄蕊的變異較為豐富，葉指標的平均變異系數為0.29%，花指標的平均變異系數為0.64%，長瓣鐵線蓮花的變異較豐富。

ISSR分子標記多態性豐富、靈敏度高和穩定性高，被廣泛應用于植物遺傳多樣性研究［28］。Ma等［29］對175種金絲桃屬（Hypericum Linn）植物利用ISSR分子標記法研究其遺傳多樣性水平，結果表明，ISSR分子標記技術可有效鑒別175種金絲桃屬植物，17個歐洲種的遺傳相似系數在0.617～0.911間。本試驗的26個長瓣鐵線蓮遺傳相似系數在0.05～0.48之間，平均相似系數為0.20，表明26個長瓣鐵線蓮間具有較遠的親緣關系，26個樣本的等位基因數（Na）為1.993 1，有效等位基因數（Ne）為1.293 4，Neis基因多樣性（H）為0.201 4，Shannons多樣性信息指數（I）為0.336 2，表明26個長瓣鐵線蓮具有較高的遺傳多樣。12條多態性較高的ISSR引物共擴增出144個位點，多態性比率達100%，表明ISSR分子標記技術可有效鑒別長瓣鐵線蓮種質資源，結果顯示，不同長瓣鐵線蓮種質資源具有較高的遺傳多樣性和復雜的遺傳背景，引物UBC815，UBC824，UBC836構建的26個長瓣鐵線蓮指紋圖譜可快速區分鑒定26個樣本。胡霞等［30］則發現杏（Prunus armeniaca L.）的野生種群間具有較高的遺傳多樣性水平，群體內遺傳分化水平較高，群體間遺傳分化水平較低。對比王鑫等［11］的研究結果發現，引物UBC824對河北易縣野生的長瓣鐵線蓮PCR擴增電泳圖譜與本研究的擴增圖譜存在差異，推測可能與材料取材于不同地區有關，長瓣鐵線蓮野生居群間同樣可能存在遺傳多樣性。

本研究基于表型性狀和ISSR分子標記技術對26個長瓣鐵線蓮進行聚類分析，表型性狀聚類將26個長瓣鐵線蓮樣本劃分為5類，而ISSR分子標記聚類，將26個長瓣鐵線蓮劃分為八類，其中包括‘金色驚喜、‘紫色驚喜、‘梅德威爾和‘吉斯卡等13個品種的形態聚類和ISSR分子聚類結果相同，另外13個長瓣鐵線蓮兩種方法聚類結果差異較大，在形態聚類中‘珍珠海洋和‘金色斯托爾維克分別被單獨劃分為一類，但在ISSR分子聚類中‘金色之夢、‘琥珀、‘鄉村玫瑰、‘峭壁、‘拉古及野生長瓣鐵線蓮分別被單獨劃分為一類。形態標記和ISSR分子標記聚類結果不完全相同，這與前人的研究報道一致［31-33］。造成這兩種分類方法結果不一致的原因是多方面的，首先，長瓣鐵線蓮遺傳背景復雜，本研究利用的形態性狀不足、單一的分子標記探查到的遺傳差異有限，不能全面反映品種的遺傳信息；其次，形態標記由基因和環境的共同作用，長瓣鐵線蓮形態容易受到環境因素影響。結合兩種聚類方法可初步確定26個長瓣鐵線蓮的聚類，由于形態標記易受環境影響，且突變對形態標記會產生不利影響，故推測ISSR分子聚類較為準確。Ismail等［34］利用ISSR、SSR，兩種標記方法對57種火炬姜（Etlingera elatior）種質進行了分子特征評價，表明不同分子標記的組合的研究更具可靠性。為提高試驗結果準確性，在之后的工作中將加入其他的分子標記方法進行佐證，結合多種標記方法，綜合運用多種評價體系，更有利于反應長瓣鐵線蓮遺傳多樣性水平。

4? 結論

形態標記結合ISSR分子標記可有效區分鑒定長瓣鐵線蓮種質資源，兩種標記方法均表明26個長瓣鐵線蓮樣本具有較高遺傳多樣性水平，本試驗可為長瓣鐵線蓮種質資源收集保存、創制新品種等提供一定的理論基礎。

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（責任編輯? 彭露茜）