植物乳桿菌對小鼠高強度運動后肌肉損傷的緩解作用及機制研究

嚴中漢,石劉婷,趙建新,張灝,王剛,陳衛

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

高強度運動會導致身體出現明顯的疲勞感,長期的高強度運動會引發慢性疲勞,大部分運動員以及體力工作者均深受其害。外周疲勞被定義為由于神經肌肉連接處或遠端發生的改變而導致的最大力量的損失[1]。長時間的高強度運動所引發的外周肌肉的疲勞具體表現為骨骼肌功能下降,不能維持預定收縮強度等現象。高強度運動會導致肌肉正常代謝功能的紊亂和肌肉結構的損傷,其能量代謝紊亂表現為肌肉中乳酸的過量堆積[2]以及糖原的過量消耗[3],過度的乳酸堆積會觸發系列病理性反應,導致延遲性肌肉酸痛或者非感染性炎癥[4],而血清中的肌酸激酶活性和乳酸脫氫酶的活性常被用來反映肌細胞的損傷程度[5]。目前對于這種疲勞感的治療大多采用睡眠休息為主、膳食藥物為輔的方法,市場上較多的產品有藥物、功能飲料等,但是這些產品或多或少都會有一些副作用,主要是外源性對抗疲勞所帶來的身體變化,存在一定的風險及人群針對性。因此尋求一種可安全有效地緩解由于高強度運動所導致的外周肌肉疲勞的膳食干預方法非常重要。

人體的腸道中含有大量的腸道菌群,腸道菌群與宿主腸道屏障功能、免疫系統發育以及營養代謝關系密切。益生菌被定義為“當攝入足夠數量時,給予宿主有益健康作用的活的微生物”,已被證明對腸道菌群具有顯著的調節作用。植物乳桿菌作為食品中常用的乳酸菌中的一種,已被證明具有一定的免疫調節、抑制致病菌生長等作用。植物乳桿菌在緩解肌肉損傷方面也有研究。LEE等[6]研究表明,植物乳桿菌HY7715可以有效緩解小鼠的肌肉損傷。因此,植物乳桿菌作為潛在的具有緩解疲勞作用的膳食補充劑,具有很好的研究價值和應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌FSCDJY73L1和FJSWX14L1均保藏于江南大學生物技術中心菌種保藏庫。

實驗選用32只SPF級雄性ICR小鼠,飼養于江南大學動物實驗中心SPF級屏障環境,室溫(22±1) ℃,濕度(55±10)%,光照與黑暗各12 h。動物實驗方案經江南大學實驗倫理委員會批準,審批號:JN.No20201230i0960420[398],所有動物實驗操作符合江南大學動物管理與使用委員會的規定(SYXK 2021-0056)和歐盟指導手冊(編號:2010/63/EU)。

乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)試劑盒(微板法)、肌糖原測定試劑盒(比色法)、乳酸測試盒(比色法)和肌酸激酶測定試劑盒(比色法),南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

RP-9160型隔水式恒溫培養箱,上海森信實驗儀器有限公司;Eppendorf 高速冷凍離心機5804R,德國艾本德股份公司;994型Thermo超低溫冰箱、酶標儀,美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗方案

適應喂養1周后,將32只ICR雄性小鼠隨機分為空白組、模型組、73L1組和14L1組,每組8只。造模期間,對模型組和2組植物乳桿菌干預組進行為期6周的高強度運動造模實驗,期間空白組和模型組小鼠每日灌胃200 μL質量濃度為100 g/L的脫脂乳;73L1組和14L1組小鼠每日灌胃200 μL含有1×109CFU/mL對應植物乳桿菌的上述脫脂乳。從動物入駐開始記錄小鼠每周的體重變化。

造模結束后,所有小鼠在水箱進行無負重游泳,游泳30 min后,迅速采用質量濃度為10 g/L的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,取血后輔以斷頸處死。血液樣本離心15 min(3 500 r/min,4 ℃),取上清液獲得血清,-80 ℃凍存;取左腿肌肉組織中腓腸肌、脛骨前肌、股四頭肌樣本稱重,所有組織樣本于液氮中速凍并轉移于-80 ℃凍存。

1.3.2 高強度運動模型構建

高強度運動模型參照CHEN等[7]的方法并作適當修改。具體方案如下:高強度運動造模共6周;第1周進行無負重適應游泳,周一游泳30 min,周二游泳45 min,周三～周五游泳60 min,周末休息;第2周負重1%(質量分數)的物體(物體/體重),周一～周五游泳60 min,周末休息;第3周～第4周負重2%(質量分數)的物體(物體/體重),周一～周五游泳60 min,周末休息;第5周～第6周負重為3%(質量分數)的物體(物體/體重),周一～周五游泳60 min,周末休息。游泳均在水深30 cm,水溫(25±1) ℃的塑料水箱中進行。

1.3.3 小鼠肌肉相關指標測定

將-80 ℃保藏的腓腸肌、股四頭肌取出,按照組織與∶生理鹽水比為1∶9(g∶mL)=進行勻漿研磨,經過離心后取得上清液,采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測腓腸肌樣本中的乳酸含量和股四頭肌中的糖原含量。

1.3.4 小鼠血清相關指標測定

參照南京建成生物工程研究所試劑盒方法,檢測血清樣本中肌酸激酶和乳酸脫氫酶的活性。

1.4 數據分析

數據以“均數±標準差”表示,用 GraphPad Prism 9(GraphPad software,California,USA,9.0 版)將實驗數據進行正態分布檢驗,對符合正態分布的數據進行t檢驗(Student′s t test),P<0.05為差異有統計學意義。各組均與模型組比較分析討論,*與模型組比較,P<0.05;**與模型組比較,P<0.01;***與模型組比較,P<0.001。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌對小鼠體重的影響

由圖1可知,所有實驗組小鼠最終體重均較初始體重有所增加,但與空白組相比,模型組小鼠體重增量顯著降低(P<0.05),而植物乳桿菌73L1和植物乳桿菌14L1干預后,雖無顯著性,但均在一定程度上減緩了小鼠體重增量降低的趨勢。

圖1 各組小鼠體重變化趨勢圖Fig.1 Trend of body weight of mice in each group

2.2 植物乳桿菌73L1對小鼠肌肉含量及結構的影響

由圖2-a可知,高強度運動以及植物乳桿菌的干預對于肌肉含量(肌肉/體重)沒有顯著影響。此外,在高強度運動下,小鼠的腓腸肌質量顯著下降(P<0.01),灌胃植物乳桿菌73L1后,小鼠的腓腸肌質量顯著增加(P<0.05)(圖2-c)。而脛骨前肌(圖2-b)和股四頭肌(圖2-d)的質量均未出現顯著變化。這些結果提示了腓腸肌的重要性,腓腸肌富含肌纖維,與運動過程中的能量代謝和氧化應激密切相關。植物乳桿菌73L1可以有效地增加高強度運動下小鼠的腓腸肌質量,改善小鼠由于高強度運動所造成的肌肉結構失調。

a-肌肉占比;b-脛骨前肌;c-腓腸肌;d-股四頭肌圖2 植物乳桿菌對高強度運動小鼠肌肉含量及質量的影響Fig.2 Effects of L.plantarum on the muscle content and mass in mice under high-intensity exercise注:*表示與模型組比較,P<0.05;**表示與模型組比較,P<0.01。

2.3 植物乳桿菌73L1對小鼠肌肉能量代謝指標的影響

由圖3-a可知,與空白組相比,模型組小鼠肌肉中肌乳酸的含量顯著增加,而與模型組相比,73L1組小鼠肌肉中肌乳酸的含量顯著下降(P<0.05),且低于空白組小鼠。植物乳桿菌14L1干預后,小鼠肌肉中肌乳酸含量下降,但差異不具有統計學意義(P>0.05)。此外,高強度運動下小鼠肌肉中肌糖原的含量顯著下降(P<0.05),但植物乳桿菌73L1和植物乳桿菌14L1干預后并未逆轉這一變化(圖3-b)。這些結果表明植物乳桿菌73L1可以在一定程度上緩解高強度運動導致的乳酸堆積,提高乳酸的循環利用率,緩解高強度運動下小鼠肌肉能量代謝的紊亂。

a-肌乳酸;b-肌糖原圖3 植物乳桿菌對高強度運動下小鼠肌肉 能量代謝指標的影響Fig.3 Effects of L.plantarum on muscle energy metabolism indexes in mice under high-intensity exercise注:*表示與模型組比較,P<0.05。

2.4 植物乳桿菌73L1對小鼠肌肉損傷指標的影響

由圖4-a可知,與空白組相比,模型組小鼠血清中乳酸脫氫酶活性顯著上升(P<0.05)。2株植物乳桿菌干預后均能顯著降低小鼠血清中乳酸脫氫酶活性,其中,73L1效果更好(P<0.01)。此外,高強度運動下小鼠血清中肌酸激酶活性顯著增加(P<0.01),而與模型組相比,73L1組小鼠血清中肌酸激酶活性顯著下降(P<0.05)。血清中乳酸脫氫酶和肌酸激酶的活性是檢驗肌肉損傷的重要指標[5],這表明73L1能夠有效地緩解高強度運動后的肌肉損傷,增強肌肉組織的抗壓能力。

a-乳酸脫氫酶;b-肌酸激酶圖4 植物乳桿菌對高強度運動小鼠肌肉損傷指標的影響Fig.4 Effects of L.plantarum on muscle damage indexes in mice under high-intensity exercise注:*表示與模型組比較,P<0.05;**表示與模型組比較,P<0.01。

2.5 植物乳桿菌73L1對小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 小鼠腸道菌群多樣性分析

采用evenness指數、Shannon指數和Simpon指數對小鼠腸道菌群α多樣性進行評估。與空白組相比,模型組Shannon指數顯著上升(P<0.05)(圖5-a、圖5-b),而evenness指數和Simpon指數雖有一定程度上升,但差異不具有統計學意義(P>0.05)。植物乳桿菌73L1以及14L1對以上3個指數均無顯著影響,上述結果表明植物乳桿菌73L1對小鼠腸道菌群α多樣性并無顯著影響。

通過主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA)對小鼠腸道菌群的β多樣性進行分析。如圖6所示,高強度運動下小鼠腸道菌群結構發生變化,植物乳桿菌73L1和植物乳桿菌14L1干預后小鼠腸道菌群分布進一步發生變化,但是變化均不顯著。這表明,高強度運動以及植物乳桿菌73L1干預對于菌群的β多樣性沒有顯著影響,在人群實驗中也出現過類似結論,久坐健康人員菌群與運動人員菌群的β多樣性沒有顯著差異[8]。

a-evenness指數;b-Shannon指數;c-Simpon指數圖5 植物乳桿菌對高強度運動小鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.5 Effects of L.plantarum on α-diversity of gut microbiota in mice under high-intensity exercise注:*表示與模型組比較,P<0.05。

圖6 植物乳桿菌對高強度運動小鼠腸道菌群的 β多樣性的影響Fig.6 Effects of L.plantarum on the β-diversity of gut microbiota in mice under high-intensity exercise

2.5.2 小鼠腸道菌群組成分析

各實驗組小鼠腸道菌群門水平組成如圖7所示。在門水平上,各實驗組小鼠的腸道菌群主要由Firmicutes和Bacteroidetes構成。高強度運動下小鼠腸道菌群中的Firmicutes和Bacteroidetes含量均有一定程度上升,但差異不具有顯著性(P>0.05)。值得注意的是,植物乳桿菌73L1干預后顯著下調了小鼠腸道中Firmicutes含量(P<0.05),這與李楠楠等[9]的實驗結果一致。

為了區分植物乳桿菌干預后高強度運動下小鼠腸道菌群中的不同微生物類群,我們進行了LEfSe分析。分類單元與生物標志物分類單元之間的關系(LDA評分>3,P<0.05)顯示在一個枝狀圖中(圖8-a)。其中,植物乳桿菌73L1干預后的小鼠腸道中的微生物類群比植物乳桿菌14L1組中的微生物類群更易區分。此外,植物乳桿菌干預后,小鼠腸道菌群屬水平發生顯著變化(圖8-b～圖8-g)。與空白組相比,模型組小鼠腸道中Oscillibacter和CandidatusSaccharimonas的相對豐度顯著上升(P<0.05);與模型組相比,73L1組小鼠腸道中Oscillibacter(P<0.01)、Mucispirillum(P<0.05)、Stenotrophomonas(P<0.001)和Tyzzerella(P<0.01)相對豐度顯著增加,腸道中CandidatusSaccharimonas的相對豐度顯著下降(P<0.001)。此外,植物乳桿菌14L1干預后顯著下調高強度運動小鼠腸道中CandidatusSaccharimonas(P<0.05)和RuminococcaceaeUCG-005(P<0.05)的相對豐度,顯著上調Tyzzerella的相對豐度(P<0.01)。這些結果表明植物乳桿菌的干預顯著改變了腸道的內環境,且植物乳桿菌73L1所帶來的影響更大。

a-各實驗組小鼠腸道菌群門水平組成;b-Bacteroidetes相對豐度;c-Firmicutes相對豐度圖7 植物乳桿菌對高強度運動小鼠腸道菌群門水平的影響Fig.7 Effects of L.plantarum on the phylum level of gut microbiota in mice under high-intensity exercise注:*表示與模型組比較,P<0.05。

a-LEfSe分析;b-Oscillibacter相對豐度;c-Candidatus Saccharimonas相對豐度;d-Mucispirillum相對豐度;e-Ruminococcaceae UCG-005相對豐度; f-Stenotrophomonas相對豐度;g-Tyzzerella相對豐度圖8 植物乳桿菌對高強度運動小鼠腸道菌群屬水平的影響Fig.8 Effects of L.plantarum on the genus level of gut microbiota in mice under high-intensity exercise注:*表示與模型組比較,P<0.05;**表示與模型組比較,P<0.01;***表示與模型組比較,P<0.001。

2.5.3 腸道菌群與肌肉指標相關性分析

如圖9所示,通過對各組小鼠腸道微生物與高強度運動下小鼠肌肉/體重、腓腸肌質量、肌肉損傷指標和肌肉能量代謝指標進行相關性分析,CandidatusSaccharimonas的相對豐度與乳酸脫氫酶、肌乳酸和肌糖原含量呈正相關,其中與乳酸脫氫酶活性呈顯著正相關(P<0.001)。此外,RuminococcaceaeUCG-005的相對豐度與乳酸脫氫酶活性也呈顯著正相關(P<0.05)。而Stenotrophomonas的相對豐度與乳酸脫氫酶活性呈顯著負相關(P<0.05)。與此同時,Oscillibacter和Tyzzerella的相對豐度與肌糖原含量呈顯著負相關(P<0.05),Mucispirillum的相對豐度與肌酸激酶活性呈顯著負相關(P<0.01)。這些結果表明植物乳桿菌可能通過調節腸道菌群進而緩解高強度運動導致的小鼠肌肉損傷及能量代謝失調現象。

圖9 肌肉指標與不同菌屬的相關性Fig.9 Correlation between muscle indexes and different bacteria注:*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。

3 結論與討論

已有研究發現,高強度運動下運動員體內肌酸激酶和乳酸脫氫酶(肌肉損傷的標志)活性顯著增加,而熱滅活乳酸乳球菌JCN5808干預后運動員體內肌酸激酶和乳酸脫氫酶活性顯著下降[10]。在本研究中,植物乳桿菌73L1顯著降低了高強度運動下小鼠血清中乳酸脫氫酶以及肌酸激酶活性,并且14L1也能降低血清中乳酸脫氫酶的活性,猜測可能是植物乳桿菌對該指標就有一定的緩解作用。肌糖原是肌肉組織中儲存能量的主要形式,肌糖原的耗竭可能是導致肌肉疲勞的主要原因[11]。植物乳桿菌干預后,小鼠體內肌糖原含量并未有明顯上升,表明植物乳桿菌干預后并未有效緩解小鼠高強度運動后肌肉能源儲存降低的情況。過度的乳酸堆積會使得肌肉疲勞,已有研究表明,長雙歧桿菌OLP-01可以顯著降低急性運動下小鼠血清中的乳酸水平[12]。本研究中,植物乳桿菌73L1干預后也顯著降低了小鼠腓腸肌中乳酸含量,同時顯著改善了由于運動過度導致的腓腸肌萎縮。

大量研究表明,高強度運動后產生的肌肉疲勞可能與腸道微生物組成的變化有關[13-14],而服用益生菌可以通過調節腸道菌群進而緩解高強度運動導致的肌肉損傷[15-16]。亞麻籽油能夠使高強度運動小鼠腸道中原本含量豐富的Oscillibacter的相對豐度進一步提升[17],與此報道相似的是,植物乳桿菌73L1干預后顯著增加高強度運動小鼠腸道菌群中Oscillibacter的相對豐度。研究表明,高強度運動會導致腸道屏障損傷[18],而RuminococcaceaeUCG-005與腸道炎癥密切相關[19]。在本研究中,植物乳桿菌73L1與14L1干預均能降低小鼠腸道中的RuminococcaceaeUCG-005相對豐度。此外,CandidatusSaccharimonas在此過程中需要重點關注,CandidatusSaccharimonas是條件致病菌,會誘導狼瘡等免疫學疾病的發生[20],高強度運動造模顯著上調了小鼠腸道中CandidatusSaccharimonas的相對豐度,植物乳桿菌73L1顯著逆轉了CandidatusSaccharimonas的相對豐度變化,逆轉效果優于14L1,并且與血清中乳酸脫氫酶活性顯著正相關。因此,植物乳桿菌73L1可能是通過逆轉小鼠腸道中的CandidatusSaccharimonas的相對豐度來緩解高強度運動誘導的小鼠肌肉損傷,從而顯著降低血清中的乳酸脫氫酶的活性。

綜上所述,通過對比植物乳桿菌73L1和植物乳桿菌14L1對高強度運動導致的小鼠肌肉損傷的緩解效果發現,植物乳桿菌73L1在緩解小鼠肌肉損傷表型上比14L1具有更加顯著的效果。這與植物乳桿菌73L1能夠調節小鼠腸道特定微生物CandidatusSaccharimonas的相對豐度可能是有關的,推測植物乳桿菌73L1可能通過降低腸道致病菌CandidatusSaccharimonas的豐度,緩解腓腸肌高強度運動下的乳酸堆積和肌肉損傷,從而緩解高強度運動造成的外周肌肉疲勞。然而,究竟是何種腸道代謝物在緩解高強度運動誘導的肌肉損傷中發揮了重要作用還有待進一步探究。