惡臭假單胞菌F1表達P450酶催化檸檬烯生物合成紫蘇醇

底心怡,劉春立*,劉秀霞,楊艷坤,白仲虎*

1(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

紫蘇醇,也被稱為二氫枯草醇,是一種天然存在的單環萜類化合物,來自植物的甲羥戊酸途徑。紫蘇醇性能穩定,耐熱、耐酸,可溶于甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑,具有類似于芳樟醇、松油醇的特殊氣味,在醫藥、日化、食品等行業具有廣闊的應用前景[1]。例如,在動物實驗中,紫蘇醇能抑制法尼基轉移酶和香葉酰轉移酶,從而抑制翻譯后腫瘤蛋白的法尼基化、異戊二烯化,從而抑制腫瘤細胞激活,使其細胞周期停止在G2/M期[2]。作為一種植物代謝物,紫蘇醇也存在于多種植物精油成分中,如薰衣草、薄荷和檸檬草等。目前獲取紫蘇醇的主要方法分為化學合成和生物合成。對于化學合成,可使用有機溶劑或超臨界二氧化碳萃取等方法從天然植物精油中獲得紫蘇醇,但產品含量低,且分離不易,成本較高[1,3]。以天然存在的單萜類化合物為原料,通過異構化、皂化等過程也可生成,但選擇性不高,且所使用的氧化劑對于環境污染較大[4-5]。對于生物合成,常使用檸檬烯作為底物,通過生物酶系統如嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus) BR388中的微生物酶系統進行轉化[6]。然而,氧化酶體系大多較為復雜,不具有足夠的區域特異性,會產生大量沸點和疏水性相似的副產物,如香芹酮、松油醇等,后續需要昂貴的純化過程才能獲得較高純度的紫蘇醇[7]。因此,紫蘇醇生物合成的宿主菌株及生物酶尚有開發和改造空間。

細胞色素P450 (CYP450),又稱P450酶,是一類單加氧酶超家族,以血紅素作為輔因子,能夠對底物進行區域選擇性氧化,且往往是立體選擇性氧化[8]。P450酶廣泛存在于動物、植物、真菌、原生動物、細菌和古菌中。在哺乳動物中,P450酶附著于內質網,用于氧化類固醇、脂肪酸等物質,并在激素合成和分解過程中發揮著重要作用。在植物中,P450酶用于合成激素、脂肪酸等對植物本身具有保護作用的化合物。在微生物中,P450酶參與各種生化反應,包括初級、次級代謝物合成及反硝化作用[9]。目前已有較為成熟的應用P450酶的研究成果。SCHNEIDER等[10]利用來自石油假單孢菌(Pseudomonasoleovorans)的輔酶A非依賴型脂肪酸吸收系統,以表達P450 BM3的重組大腸桿菌(Escherichiacoli)為宿主催化制備12-,13-,14-羥基化十五酸,能夠有效替代傳統生物轉化長鏈脂肪酸為亞末端羥基化脂肪酸的方法。BEZALEL等[11]利用P450酶的單加氧特性,使用糙皮側耳菌(Pleurotusostreatus)降解菲類化合物。GIANG等[12]通過序列同源性比對發現球狀紅球菌(Rhodococcusgloberulus)來源的P450酶(CYP108 N12)具有能夠氧化檸檬烯、傘花烴等物質的功能。分岐桿菌(Mycobacteriumsp.)HXN-1500來源的P450酶,即CYP153A6,可氧化C6-C11正烷烴,也可以結構較為復雜的烴類作底物,能得到高度區域選擇性烴化的產物[8,13]。當底物為檸檬烯時,CYP153A6可將其特異性氧化為紫蘇醇,目前已在多種宿主中得到應用(圖1)。GUDIMINCHI等[14]使用pCom8-PFR1500載體在大腸桿菌中表達CYP153A6、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶,在自誘導培養基生長的大腸桿菌所得紫蘇醇產量最高達到1.85 mol/L。VAN等[15]在惡臭假單胞菌GPo12中表達CYP153A6生物轉化檸檬烯生成紫蘇醇,但惡臭假單胞菌GPo12的檸檬烯耐受度較低,紫蘇醇產量也因此受到限制。

圖1 P450酶生物轉化檸檬烯生成紫蘇醇示意圖Fig.1 Biosynthesis of perillyl alcohol catalyzed by cytochrome P450

惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)是一種腐生營養土壤桿菌,其營養背景豐富,廣泛存在于土壤、水體、動植物體表和各種富含蛋白質的物質中[16]。惡臭假單胞菌酶背景復雜,代謝途徑繁多,能利用多種碳源,且對pH、溶劑等極端環境條件表現出高度穩健性和耐受性,因此多用于環境污染治理及有機廢物再循環利用,并因在土壤中的定植能力和降解各種化學物質的能力而聞名[17-19]。作為革蘭氏陰性菌,惡臭假單胞菌同樣具有培養成本低、生長周期短、安全無害等特點。其中,惡臭假單胞菌F1與模式菌株的KT2440不同,并不常作為外源基因表達或目的產物合成的宿主菌株[20-21]。惡臭假單胞菌F1含有豐富的氧化酶系,如tod、cym、cmt酶系等,使其具有對環境中芳香族、萜類物質較高耐受性,且cym酶系中的CymAa、CymAb具有選擇性羥化活性,作為生產此類物質的宿主菌株具有較大潛力[22]。

本研究將構建穿梭質粒表達載體,并以大腸桿菌BL21 (DE3)、惡臭假單胞菌F1作為宿主菌株,表達選擇性羥化酶CymAa、CymAb和P450酶、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶,以檸檬烯為底物生物合成紫蘇醇,展現惡臭假單胞菌F1作為萜類物質合成載體菌株的優勢。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

2×TaqPCR Mastermix、2×PrimeStar,Takara公司;2×Multif Seamless Assembly Mix,Abclonal公司;引物,蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.1.2 菌株與質粒

本研究中使用的菌株與質粒如表1所示,所使用引物如表2所示。

表1 本研究中使用的菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L):酵母提取物5,蛋白胨5,NaCl 10,主要用于質粒構建菌株及發酵種子液培養。LB固體培養基為上述液體培養基中添加1%(質量分數)的瓊脂粉。

M9培養基(1 L):0.1 mL 1%維生素B12,0.01 mL 10% 維生素B1,0.1 mL trace礦物鹽溶液(108 g/L FeCl3·6H2O, 2 g/L H3BO3, 4 g/L ZnCl2·7H2O, 5 g/L MnSO4·H2O, 7 g/L CoCl2·6H2O, 7 g/L Na2MoO4·H2O, 8 g/L CuSO4·6H2O),0.1 mL 1 mol/L CaCl2, 2 mL 1 mol/L MgSO4, 50 mL 20%D-葡萄糖,50 mL 10% 酪蛋白水解物, 100 mL 10×M9鹽溶液 (60 g/L Na2HPO4·7H2O, 30 g/L KH2PO4, 5 g/L NaCl),主要用于產物發酵菌株培養。

抗生素:卡那霉素終質量濃度為50 mg/L。

1.1.4 儀器與設備

ETC821 PCR基因擴增儀,東勝公司;411BR8608 MicroPulser電轉儀,BIO-RAD;759S21023 UV-Vis Spectrophotometer紫外可見分光光度計,上海棱光公司;GCMS-QP2020 SYSTEM氣相色譜質譜聯用儀,島津公司。

1.1.5 標準品

檸檬烯標準品:(-)-檸檬烯,(-)-Limonene,別名(S)-(-)-二戊烯,CAS編號5989-54-8,分子式C10H16,分子量136.24,規格及純度為>95.0%(GC),沸點為64 ℃/15 mmHg(lit.),密度0.845,購于Aladdin公司。

紫蘇醇標準品:紫蘇醇,Perillyl alcohol,CAS編號536-59-4,分子式C10H16O,分子量152.23,規格及純度為90%,室溫貯存,購于Aladdin公司。

乙酸乙酯:Ethyl acetate,CAS編號141-78-6,分子式C4H8O2,分子量88.11,規格及純度為≥99.5%,沸點為77 ℃,相對密度0.902,購于國藥滬試公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因克隆和質粒構建

使用引物pBBR1-vector-F/pBBR1-vector-R,以廣宿主載體pBBR1MCS2為模板,擴增含有卡那霉素抗性基因、pBBR1復制子的DNA片段;使用引物promoter-F/promoter-R,以質粒載體pTrc99a為模板,擴增含有lacI基因、trc啟動子、lacO序列以及rrnB T1終止子的DNA片段。使用Gibson組裝法連接上述兩片段,構成質粒pBBR1-Ptrc。

從惡臭假單胞菌數據庫(https://www.pseudomonas.com/)獲得cymAa(Pput_2903)、cymAb(Pput_2902)基因的核苷酸序列信息。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得P450酶、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶基因(GenBank:AJ783967.1)的核苷酸序列信息,并對其編碼序列進行密碼子優化(參考大腸桿菌BL21),由蘇州金唯智生物科技有限公司合成質粒pET-Cyp450-Fdr-Fdx。使用引物pBBR1cymAabv-F/pBBR1cymAabv-R和pBBR1P450v-F/pBBR1P450v-R,以pBBR1-Ptrc為模板擴增線性化載體片段;使用引物cymAab-F/cymAab-R,以惡臭假單胞菌F1基因組為模板擴增含有cymAa和cymAb基因的DNA片段;使用引物P450-F/P450-R,以實驗室保存質粒pET-Cyp450-Fdr-Fdx為模板擴增含有P450酶、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶基因的DNA片段。分別使用Gibson組裝法連接載體和片段,構成質粒pBBR1-cymAab和pBBR1-P450-Fdr-Fdx。

1.2.2 惡臭假單胞菌F1電轉化感受態制備

將保存于-80 ℃的惡臭假單胞菌F1接種于裝有5 mL LB培養基的50 mL離心管,于30 ℃過夜培養,轉接至100 mL LB培養基培養至OD600=0.8。將培養液分裝至2個50 mL離心管于5 000×g,4 ℃離心10 min。將獲取的細胞分別用30 mL預冷的無菌水、3 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液{2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid,HEPES}重懸并再次離心,最后加入2 mL預冷的10%甘油重懸并每80 μL分裝于500 μL離心管備用。

1.2.3 菌株培養

將質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)與惡臭假單胞菌F1中。PCR驗證為陽性后于平板上隨機挑取3個菌落,接種至裝有5 mL LB培養基的50 mL離心管中,于220 r/min恒溫培養箱培養,其中大腸桿菌BL21 (DE3)生長溫度為37 ℃,惡臭假單胞菌F1生長溫度為30 ℃。16 h后轉接至裝有5 mL M9培養基的20 mL搖瓶中,當OD600值至0.6～0.8時添加相應濃度的檸檬烯作為底物、以及1 mmol/L 異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導表達,于30 ℃培養24 h和48 h 取樣進行檢測。

1.2.4 紫蘇醇檢測

取1 mL發酵液、0.5 mL乙酸乙酯與過量無水Na2SO4加入2 mL離心管,渦旋振蕩5 min后于13 000 r/min離心10 min,用針管取最上層有機相過濾膜后注入氣相小瓶待檢。GC-MS儀器設置:電子碰撞(electron impact, EI)檢測器和DB-5MS色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。方法條件:入口溫度為260 ℃,氮氣載氣恒定流量為44 cm/s,離子源溫度為250 ℃,掃描30～500m/z。執行以下程序:初始溫度為80 ℃保持1 min,然后以10 ℃/min的速率升至260 ℃,最后保持10 min。分流比5.0。通過與已知濃度的紫蘇醇標品繪制的標準曲線比較,將峰面積轉換為紫蘇醇濃度進行定量。

2 結果與分析

2.1 廣宿主載體pBBR1-Ptrc質粒構建

惡臭假單胞菌F1具有酶背景豐富、環境耐受度高、培養成本低、生長周期短等優點,但并不常作為外源基因表達的宿主菌株,因而缺少可用的基因表達載體。為使承載目的基因的表達載體可以正常在大腸桿菌BL21 (DE3)和惡臭假單胞菌F1中擴增表達,本研究利用廣宿主載體pBBR1MCS2作為模板擴增其復制子pBBR1,通過Gibson組裝連接來自質粒pTrc99a的trc啟動子和lacI基因,構建pBBR1-Ptrc質粒。質粒元件構成如圖2所示。該質粒載體能夠在大腸桿菌、惡臭假單胞菌等多種革蘭氏陰性菌中正常擴增表達,具有可以連接外源基因片段的多克隆位點,并可以通過控制IPTG的添加調控其連接的目的基因的表達。

圖2 質粒構建示意圖Fig.2 Construction of plasmids.

2.2 CymAab和P450酶表達載體構建及驗證

獲得可用的表達載體后,需要表達目的蛋白CymAab和P450酶。CymAab為惡臭假單胞菌F1來源,分為CymAa和CymAb兩部分,以純化的惡臭假單胞菌F1基因組作為模板,通過引物擴增與Gibson組裝構建成質粒pBBR1-cymAab。本研究中所使用的P450酶為Mycobacteriumsp.HXN-1500 來源,分為主體P450酶、輔因子鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶3個部分,其序列經過大腸桿菌密碼子偏好優化后通過公司合成為質粒pET-Cyp450-Fdr-Fdx,并通過引物擴增與Gibson組裝構建成質粒pBBR1-Cyp450-Fdr-Fdx。質粒元件構成與P450酶生物合成紫蘇醇示意圖如圖2所示。

將含有目的基因的質粒轉化進大腸桿菌BL21 (DE3)與惡臭假單胞菌F1中,并以含有空質粒pBBR1-Ptrc的菌株EcC和PpC作為空白對照,添加10 mmol/L檸檬烯作為底物,檢測誘導后24 h和48 h后發酵液中的細胞密度和紫蘇醇濃度。由OD600值測定結果可以看出,添加了10 mmol/L檸檬烯后,大腸桿菌BL21 (DE3)的生長狀態受到很大程度抑制,而惡臭假單胞菌F1幾乎沒有受到影響(圖3-a)。對于紫蘇醇的產量檢測,表達CymAab酶的實驗組EccymAab、PpcymAab均沒有檢測到紫蘇醇生成;而表達P450酶的實驗組中,由于前述大腸桿菌BL21 (DE3)的生長受到抑制,只檢測到較低濃度的紫蘇醇產量,而惡臭假單胞菌F1組即菌株PpP450在24 h 時達到最高紫蘇醇積累,且產量最高組為96.43 mg/L(圖3-b)。從單位OD600的紫蘇醇產量結果也可看出,惡臭假單胞菌F1發酵24 h的產量為15.32 mg/L,明顯高于大腸桿菌BL21發酵48 h的產量7.64 mg/L(圖3-c)。

2.3 不同底物濃度與紫蘇醇產量關系驗證

由于前序實驗中菌株EccymAab、PpcymAab沒有檢測到紫蘇醇產物,且大腸桿菌BL21 (DE3)的生長狀態受到較大影響,因此選擇P450酶進行后續實驗,并調整了底物檸檬烯的添加濃度,設置1 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L的濃度梯度范圍,使用大腸桿菌BL21 (DE3)與惡臭假單胞菌F1作為發酵宿主,設置了不添加檸檬烯的空質粒組pBBR1-Ptrc作為對照,檢測誘導24、48 h后發酵液中的細胞密度和紫蘇醇產量。在菌體生長方面,加入檸檬烯后大腸桿菌BL21 (DE3)的生長狀態依然受到了較大的抑制,并且抑制程度隨著添加濃度的升高而增強;與之相對,添加檸檬烯的惡臭假單胞菌F1實驗組生長情況隨著檸檬烯濃度升高實驗組的生長情況保持穩定(圖4-a)。在紫蘇醇產量方面,大腸桿菌BL21 (DE3)由于生長受到限制,在添加1 mmol/L檸檬烯的情況下經過48 h發酵所得紫蘇醇最高濃度為28.8 mg/L;而對于惡臭假單胞菌F1,各組添加了不同濃度檸檬烯后所獲得的紫蘇醇產量也沒有明顯差異,菌株PpP450在添加1 mmol/L檸檬烯的情況下經過48 h發酵所得紫蘇醇最高質量濃度為75.6 mg/L,對于檸檬烯的轉化率達到49.66%(圖4-b)。添加5 mmol/L檸檬烯的大腸桿菌BL21雖然在24 h獲得較高紫蘇醇產量,但在48 h時產量驟然減少;與之相比惡臭假單胞菌F1各組的紫蘇醇生產積累較為穩定,添加1 mmol/L檸檬烯時在發酵48 h后達到最高單位OD600紫蘇醇產量38.49 mg/L(圖4-c)。

a-OD600值結果;b-紫蘇醇產量結果;c-紫蘇醇產量/OD600結果圖3 添加10 mmol/L檸檬烯大腸桿菌BL21 (DE3)和惡臭假單胞菌F1的OD600和紫蘇醇產量結果Fig.3 OD600 and Perillyl alcohol yield results of E.coli BL21 (DE3) and P.putida F1 with the addition of 10 mmol/L limonene

a-OD600值結果;b-紫蘇醇產量結果;c-紫蘇醇產量/OD600結果圖4 添加不同濃度檸檬烯大腸桿菌BL21 (DE3)和惡臭假單胞菌F1的OD600和紫蘇醇產量結果Fig.4 OD600 and perillyl alcohol yield results of E.coli BL21 (DE3) and P.putida F1 with the addition of different concentration of limonene

3 討論

紫蘇醇作為單萜類化合物,在醫藥、食品、日化等方面具有廣泛的應用價值,然而化學合成法的高昂成本與環境污染、生物合成法的低選擇性與對宿主毒性都是獲取紫蘇醇的過程中亟需解決的問題。P450酶的引入實現了將檸檬烯特異性轉化為紫蘇醇,極大程度推動了微生物合成紫蘇醇的研究進程。但是由于萜類物質對微生物具有毒性,更高的底物、產物濃度意味著對宿主菌株生長的更大壓力。

大腸桿菌作為常用的工業模式菌株,其明確的代謝背景、易于培養等特點,使得大腸桿菌作為表達外源基因宿主受到廣泛應用。而如實驗結果顯示,大腸桿菌BL21 (DE3)對于檸檬烯的耐受度較低,在外源添加檸檬烯的環境中大腸桿菌BL21 (DE3)的生長會受到較大影響,從而影響其蛋白表達、進而使得生物轉化能力受到限制。而無論是否添加檸檬烯,惡臭假單胞菌F1的生長狀態均沒有受到明顯影響,對于10 mmol/L以內的檸檬烯具有較高耐受性。

在羥化酶的選擇上,本研究使用了惡臭假單胞菌F1自身來源的CymAab和有生物轉化檸檬烯生成紫蘇醇相關報道的P450酶,結果證明CymAab并沒有原先猜測的能選擇性羥化(S)-(-)-檸檬烯的能力,而P450酶在惡臭假單胞菌F1中效果良好。在進一步進行惡臭假單胞菌F1表達P450酶催化紫蘇醇合成實驗探究時,發現不同檸檬烯添加濃度所獲得的紫蘇醇產量并無較大差別,因此可以推斷在添加1 mmol/L檸檬烯時底物濃度對于P450酶的催化效率已達到飽和,即一定范圍內更高濃度的檸檬烯添加雖然不會影響惡臭假單胞菌F1的生長狀態,但也不能被利用生成更多產物。如果在現有的體系基礎上進一步進行提升紫蘇醇的產量的后續實驗,可以從P450酶表達量、活性等方面著手。

結合菌體生長與紫蘇醇產量二者的數據,在以檸檬烯為底物生物合成紫蘇醇的過程中,惡臭假單胞菌F1相較于大腸桿菌BL21 (DE3)或許更適合于作為發酵宿主。與VAN等[15]在使用惡臭假單胞菌GPo12時所遇到的情況不同,惡臭假單胞菌F1在含有10 mmol/L檸檬烯濃度以內的環境下展現出較高的耐受性,或許可以成為突破萜類物質毒性影響宿主生長問題的關鍵。另一方面,梯度濃度添加的底物的紫蘇醇產物結果也為后續實驗縮小了底物使用范圍,并將限制產量的因素引導向P450酶方向。如先前描述表達載體構建時,本實驗所使用的P450酶經過大腸桿菌密碼子偏好優化,且惡臭假單胞菌F1為野生型菌株,后續針對產量提高的相關改造具有較大潛力。

4 結論

本研究通過構建廣宿主表達載體,并在其上連接P450酶及其輔因子3個基因后,將質粒轉入大腸桿菌BL21 (DE3)和惡臭假單胞菌F1中,外源添加檸檬烯并進行濃度調整后,獲得對檸檬烯具有較高耐受性的惡臭假單胞菌F1,添加1 mmol/L檸檬烯底物發酵48 h后獲得最高產量75.6 mg/L,轉化率達到49.66%,縮小了生物合成紫蘇醇的有效底物添加范圍,并提供了具有改造潛力的宿主菌株。