代謝工程改造釀酒酵母高效合成游離脂肪酸

朱滿志,陳獻忠,沈微,楊海泉,夏媛媛

(江南大學 生物工程學院,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

原油成本的攀升和不穩定、日益增長的環境問題,都促使人們對使用微生物生產生物燃料和生物化學制品的興趣增加[1]。油化學品是石化產品的替代品,通常從植物油和動物脂肪中提取,其供應量有限[2]。微生物脂肪酸的生物合成已經引起了廣泛的關注,因為它提供了一種可再生油化學品的生產方式[3]。游離脂肪酸(free fatty acids,FFAs),即不與其他分子結合的脂肪酸,由于其較低的生產和收獲成本以及可以直接地化學轉化為廣泛的生物燃料和生化產品,包括烷烴、烯烴、脂肪酸甲基酯、脂肪酸乙基酯和脂肪醇,而被人們所需要[4]。

釀酒酵母作為模式真核微生物,基于成熟的遺傳操作系統,成熟的表達系統和相對較好的工業條件耐受性,已經被成功開發為可用于多種生物化學品的細胞工廠,并且已經應用于工業生產[5]。野生型釀酒酵母本身具有合成脂肪酸的能力,但其生產效率很低,無法滿足實際應用的需求。因而需要對其進行代謝改造,提高其FFAs的生產能力。近年來釀酒酵母已被設計用來生產FFAs,在野生型釀酒酵母內脂肪酸主要由細胞質I型FAS合成的,它是一個大型的、多功能的二聚體復合物,由基因FAS1以及FAS2編碼,負責從丙二酰CoA和乙酰CoA合成脂肪酸。首先葡萄糖經糖酵解生成丙酮酸,然后在丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)的作用下生成乙醛,隨后在乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALD)的作用下生成乙酸,乙酸在乙酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase,ACS)的作用下生成乙酰CoA,接著在乙酰CoA羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC1)的催化下生成丙二酰CoA,隨后脂肪酸合成酶以乙酰CoA以及丙二酰CoA為前體合成脂肪酸(圖1)[6]。

之前的研究表明,通過敲除?；?CoA合成酶基因FAA1和FAA4,酵母開始分泌FFAs到生長介質中[7],LI等[8]通過破壞FAA1和FAA4能夠生產大約80 mg/L的脂肪酸。RUNGUPHAN等[9]通過刪除FAA1和FAA4以及過量表達大腸桿菌硫酯酶TesA,生產了207 mg/L的FFAs;CHEN等[10]通過去除FAA1和FAA4以及過量表達一種截短的S.cerevisiae過氧體?；?CoA硫酯酶5(ACOT5),生產了大約520 mg/L FFAs。LEBER等[4]通過將Δfaa1Δfaa4基因型與過量表達TAGs的積累和水解途徑相結合,生產了2.2 g/L的FFAs。馮叨等[11]在多形漢遜酵母中通過敲除FAA1并進行發酵優化實現了1.86 g/L的脂肪酸產量。YU等[12]通過對釀酒酵母代謝途徑進行重構,消除了釀酒酵母生長過程中乙醇的產生,使碳流量更多流向脂肪酸生產,重組菌在發酵罐中實現了高達33.4 g/L的游離脂肪酸產量。本文利用CRISPR-Cas9技術連續敲除3個脂酰輔酶A合成酶編碼基因、阻斷β-氧化途徑并上調脂肪酸合成關鍵酶編碼基因ACC1、FAS1、FAS2的表達,酵母工程菌株FFAs的合成能力得到顯著提高,為進一步開發工業水平發酵生產FFAs的酵母細胞工廠奠定來基礎。

圖1 脂肪酸的合成Fig.1 Synthesis of fatty acids注:Mal:蘋果酸;OAA:草酰乙酸;TAG:三?；视?SE:甾醇酯;DAG:二?；视?LPA:溶血磷脂酸;G3P:三磷酸甘油醛;PA:磷脂酸; PI:磷脂酰肌醇;PS:磷酯酰絲氨酸;PE:磷脂酰乙醇胺;PC:磷脂酰膽堿;PL:磷脂

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

質粒B18-pRS426,大腸桿菌菌株JM109,釀酒酵母菌株BY4741,均為本實驗室保存;小鼠ATP:檸檬酸裂解酶基因MmACL,圓紅冬孢酵母蘋果酸酶基因RtME,合成于蘇州金唯智生物科技有限公司;ExTaq和 Prime STAR DNA聚合酶以及限制性核酸內切酶,Takara;重組酶C112、C113,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;本研究所用引物(表1)均在蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

二氯甲烷(dichloromethane,DCM)、十五烷酸、正己烷,上海阿拉丁生化科技有限公司;碘甲烷,梯希愛上?；晒I發展有限公司;12%氯化氫甲醇溶液,上海阿達瑪斯試劑有限公司,37種脂肪酸甲酯混標,美國sigma公司,四丁基氫氧化銨,上海麥克林生化股份有限公司。

YPD培養基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20。

LB培養基(g/L):氯化鈉10,蛋白胨10,酵母粉5。

MM培養基(g/L):酵母氮基6.7,硫酸銨10,葡萄糖20。

SM培養基(g/L):酵母氮基6.7,硫酸銨10,葡萄糖20,尿嘧啶0.06。

1.2 儀器與設備

AL104電子分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司:HB-100恒溫金屬浴,杭州博日科技有限公司;TSQ8000三重四極桿氣質聯用儀,賽默飛世爾科技公司;4K-15臺式高速冷凍離心機,美國Sigma公司;UV-2100紫外可見光分光光度計,上海優尼特有限公司;PH-070A干燥箱,杭州匯爾儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 質粒構建

質粒構建的方法主要使用一步克隆的組裝方法。以釀酒酵母BY4741基因組為模板,以引物UFAA1-F/UFAA1-R,DFAA1-F/DFAA1-R分別克隆基因FAA1上下游同源臂將其與載體pMD19T(simple)連接構建FAA1敲除質粒,以同樣的方式構建FAA4,FAT1,POX1,FAA2,PXA2,DPP1,LPP1,PAH1敲除質粒;以質粒B18-pRS426為模板,以引物B18-F1(FAA1)/B18-R1,B18-F2/B18-R2,B18-F3/B18-R3(FAA1)分別擴增B18-1(FAA1),B18-2,B18-3(FAA1)3個片段用一步克隆的方法將其連接構建帶有FAA1對應sgRNA的Cas9質粒,同理構建分別帶有另外8個基因對應sgRNA的Cas9質粒。

以釀酒酵母BY4741基因組為模板克隆線粒體檸檬酸鹽轉運蛋白基因CTP1,以及截短的蘋果酸脫氫酶基因MDH3′,將CTP1插入質粒PPH01的NotI和BglII位點之間獲得質粒PPH02,將MDH3′插入質粒PPH02的BamH I和XhoI位點之間獲得質粒PPH03;將MmACL插入質粒PTT01的BamH I和XhoI位點之間獲得質粒PTT02,將RtME插入質粒PTT02的NotI和SacI位點之間獲得質粒PTT03;以質粒PPH03為模板tADH1-F/tTPI1-R為模板擴增片段,將片段插入PTT03的XbaI位點獲得質粒PTTPH01。

1.3.2 菌株構建

本研究釀酒酵母的轉化采用改進的LiAc轉化法:挑取單菌落過夜培養,次日以OD600=0.1接種于50 mL在250 mL錐形瓶新鮮的YPD培養基中,培養至OD600=0.5～0.8,離心棄上清液,用無菌冰水清洗1次,100 mmol/L的LiAc清洗1次,將菌體重懸在400 μL 100 mmol/L的LiAc中,然后50 μL分裝;對分裝體系高速離心30 s棄去上清液,向菌體中依次加入240 μL 40% PEG3350,36 μL 1 mol/L LiAc,50 μL片段和質粒,25 μL的單鏈載體DNA,充分混勻后在30 ℃孵育30 min,42 ℃熱激23 min,最后離心后用1 mL無菌水重懸,取50 ～100 μL涂布到MM固體平板上。本研究所涉及的菌株均列于表2中。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this research

續表1

表2 本研究構建的質粒與菌株Table 2 Plasmids and strains constructed in this research

1.3.3 產物提取與檢測

使用此前描述的方法提取游離脂肪酸并將其衍生為甲酯[13]。將培養72 h的培養物稀釋2倍后取200 μL立即加入10 μL 40%四丁基氫氧化銨(堿性催化劑),然后加入200 μL二氯甲烷,其中含有200 mmol/L甲基碘作為甲基供體,含有 100 mg/L十五烷酸作為內標。通過使用渦流混合器將混合物在1 400 r/min下振蕩30 min,然后以5 000×g離心以促進相分離。將160 μL二氯甲烷層轉移到帶有內襯管的GC小瓶中,蒸發4 h至干。將提取的甲酯重懸于160 μL正己烷中。

為了定量細胞內總脂肪酸,用去離子水洗滌沉淀兩次。然后通過加入500 μL濃鹽酸并在70 ℃下孵育1 h來進行細胞裂解。細胞裂解后,加入500 uL二氯甲烷其中含100 mg/L十五烷酸,渦旋振蕩10 min提取脂肪酸,12 000 r/min離心10 min取400 μL下層二氯甲烷層,蒸干后加入500 μL 12%(體積分數)鹽酸-甲醇,然后渦旋2 min。在62 ℃下孵育3 h后,將反應混合物冷卻至室溫,并通過用400 μL正己烷渦旋2 min來提取脂肪酸的甲酯衍生物。在10 000 r/min離心15 min后,收集頂部己烷層。

脂肪酸甲酯通過配備有TG-5 30 m×0.25 mm×0.25 μm色譜柱(ThermoFisher Scientific)和TSQ8000質譜儀(ThermoFisher Scientific)的氣相色譜Trace1310(ThermoFisher Science)進行分析。GC程序如下:初始溫度為40 ℃,保持2 min;以每分鐘30 ℃的速度升至130 ℃,然后以每分鐘10 ℃的速率升至280 ℃并保持3 min。入口、傳質管線和離子源的溫度分別保持在280、300、230 ℃。注入體積為1 μL。載氣(氦氣)的流速設置為1.0 mL/min,并在全掃描模式(50～650m/z)下采集數據。使用Xcalibur軟件進行最終定量。

2 結果與分析

2.1 構建?；鵆oA合成酶缺失突變株

在野生型釀酒酵母中脂肪酸以三?；视?triacylglyceride,TAG)和甾醇酯(sterol ester,SE)的結合態儲存在脂滴(neutral lipids,LD)當中,或者以?；鵆oA的形式參與細胞代謝。在釀酒酵母中?；鵆oA合成酶主要由FAA1,FAA2,FAA3,FAA4,Fat1和Fat26個基因編碼,其中長鏈?；o酶A合成酶FAA1發揮著主要作用[14]。有文獻報道,刪除FAA1和FAA4基因能夠提高酵母細胞的游離脂肪酸合成能力[7]。本研究以BY4741作為底盤細胞,敲除FAA1和FAA4基因,考察細胞的生長和FFAs的合成。結果表明,突變株的生長速度有一定的下降,但最終的生物量與出發菌株基本一致(圖2-a),而胞內的脂肪酸和胞外FFAs均有顯著提升,胞外的FFAs濃度達到380.4 mg/L(圖2-b)。進一步,累積刪除負責長鏈脂肪酰CoA的合成和脂肪酸轉運的Fat1基因,突變菌株BY3的生長和FFAs的合成與BY2突變株相比沒有顯著區別(圖2)。

a-工程菌BY2、BY3和出發菌株BY4741的細胞生長比較; b-工程菌BY2、BY3和出發菌株BY4741的脂肪酸合成能力比較圖2 敲除?；鵆oA合成酶的影響Fig.2 Effect of removal of lipid acyl-CoA synthase

2.2 β-氧化途徑的阻斷提高FFAs合成

β-氧化是脂肪酸在過氧化物酶體中代謝分解生成乙酰CoA的過程。在酵母中,當脂肪酸不被用作碳源時,β-氧化活性對于酵母細胞的正常生長不是必須的。雖然先前的研究已經通過刪除參與脂肪酸降解的初始酶POX1的基因來破壞釀酒酵母中的β-氧化,但由于其他同工酶的作用,這可能不足以完全去除β-氧化活性[15]。為了阻斷工程菌株的β-氧化途徑,本研究首先敲除了POX1基因獲得菌株BY4,其生長狀況并未受到顯著影響(圖3-a),同時FFAs產量提升到了390.1 mg/L。為了進一步提升FFAs的產量,本研究隨后敲除了基因PXA2以及FAA2獲得一株6重突變體菌株BY6,PXA2編碼ABC轉運蛋白復合物Pxa1-Pxa2的一個亞基,負責將長鏈脂肪酸導入過氧化物酶體,FFA2負責在過氧化物酶體中活化一些能夠直接穿過過氧化物酶體膜的中鏈脂肪酸。BY6的生長狀況并未受到基因PXA2以及FAA2敲除的影響,與此同時其FFAs產量僅有少量提升,達到了394.9 mg/L,但是其胞內脂肪酸產量得到了較大的提升,達到了622.1 mg/L(圖3)。

a-工程菌BY3、BY4、BY6細胞生長比較; b-工程菌BY3、BY4、BY6的脂肪酸產量比較圖3 β氧化阻斷的影響Fig.3 Effects of β-oxidative blockade

2.3 提高磷脂酸水平上調脂肪酸的合成

為了進一步提高脂肪酸的合成水平,我們希望能夠上調酵母細胞內脂肪酸合成相關的基因的表達。PA被表征為調節脂質代謝的重要信號分子。高水平的PA導致轉錄調節因子Opi1向細胞核的易位減少[16],阻止其與轉錄因子Ino2的結合。由于Ino2是許多脂肪酸和磷脂生物合成基因的激活劑,PA水平的增加間接導致脂肪酸生物合成機制的上調[17]。為了提高PA的合成水平,我們旨在去除PA到DAG的去磷酸化,這將允許PA積累,從而干擾Opi1介導的調節(圖4)。PA去磷酸化由主要由PAH1、LPP1和DPP1編碼的磷脂酸磷酸酶催化,因此,這些基因從菌株中敲除,獲得菌株BY9。BY9相對于BY6無論其生長速度還是最終的生物量都有所下降,但是BY9的 FFAs產量達到了497.3 mg/L 相對于BY6提升了26%,同時其胞內脂肪酸產量也有所上升,達到了833.9 mg/L(圖5)。

圖4 PA對脂肪酸合成的調控Fig.4 Regulation of fatty acid synthesis by PA

a-工程菌BY6、BY9細胞生長狀況評價; b-工程菌BY6、BY9的脂肪酸產量比較圖5 PA上調對脂肪酸合成的影響Fig.5 PA up-regulation on the yield of fatty acid synthesis

2.4 改造檸檬酸裂解酶途徑提高乙酰CoA供應

有文獻報道,通過改造檸檬酸裂解酶途徑能夠增加脂肪酸合成前體胞質乙酰CoA的供應(圖1)[18],該途徑已被認為在含油酵母的脂質積累中發揮重要作用[19]。本文在菌株BY9內構建了一個由來自小鼠(Musmusculus)的ATP:檸檬酸裂解酶(MmACL),來自圓紅冬孢酵母(Rhodospuridiumtoruloides)的蘋果酸酶RtME,去除了過氧化物酶體定位信號肽的內源性蘋果酸脫氫酶Mdh3′以及檸檬酸鹽轉運蛋白Ctp1組成的檸檬酸裂解酶途徑。Ctp1負責檸檬酸從線粒體到細胞質的運輸;在MmACL作用下以ATP為輔因子胞質中的檸檬酸裂解形成草酰乙酸(oxalacetic acid,OAA)和乙酰CoA,乙酰CoA作為原料合成脂肪酸,而OAA接著參與檸檬酸裂解酶循環;OAA在Mdh3′的催化下形成蘋果酸(Mal);RtME催化蘋果酸形成丙酮酸,而丙酮酸又會進入到線粒體中參與TCA循環形成檸檬酸,這樣我們構建了一個嵌合的檸檬酸裂解酶途徑,增加了胞質乙酰CoA的供應。我們將這一途徑的4個基因整合在基因組上獲得菌株BY10。檸檬酸裂解酶途徑的改造未對細胞的生長產生明顯的影響(圖6-a),工程菌株無論是胞內脂肪酸還是FAAs的產量均有所下降,胞內脂肪酸產量從833.9 mg/L下降到590.7 mg/L,FFAs從497.3 mg/L下降到396.2 mg/L(圖6)。

a-工程菌BY9、BY10細胞生長狀況評價; b-工程菌BY9、BY10的脂肪酸合成能力評價圖6 檸檬酸裂解酶途徑引入對脂肪酸合成的影響Fig.6 Effect of citrate lyase pathway introduction on fatty acid synthesis

3 結論與討論

本研究首先通過刪除釀酒酵母BY4741中?；鵆oA合成酶基因使細胞開始分泌游離脂肪酸到細胞外部,FFAs產量達到384.4 mg/L,而BY4741在胞外未檢測到有FFAs;在阻斷了β氧化活性后FFAs的滴度進一步提升達到了394.9 mg/L,同時其胞內的脂肪酸濃度也有所提升,從492.5 mg/L提升到了622.1 mg/L;之后DPP1,LPP1,PAH1基因的刪除阻斷了PA到DAG的去磷酸化,導致PA的積累從而上調了多個與脂肪酸合成相關的基因,FFAs的產量得到了進一步的提升達到了497.3 mg/L;而檸檬酸裂解酶途徑的引入導致了FFAs和總脂肪酸產量的下降,這說明單純的增加乙酰CoA的供應可能并不能提高脂肪酸的合成水平,反而增加了細胞的代謝負擔,參與脂肪酸合成的后續步驟的編碼基因如乙酰CoA羧化酶ACC1,以及脂肪酸合成酶基因FAS1,FAS2等的上調可能對脂肪酸合成有更重要的影響,這可能也是PA積累能夠大幅提升脂肪酸合成能力原因。本研究通過全新的組合策略構建了一株生產FFAs的菌株,為后續進一步提高FFAs的產量或者生產脂肪酸衍生物奠定了基礎。