組蛋白激活晚期糖基化終末產物受體并引發炎癥反應

孫常津,楊巖,劉國玉,2,中西秀樹*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(中國食品發酵工業研究院有限公司,功能主食創制與慢病營養干預北京市重點實驗室,北京,100015)

晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)是免疫球蛋白超家族的一員,最早作為晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products, AGEs)的受體被發現,并因此得名[1-2]。RAGE在人體肺臟組織中高表達,在人體內皮細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞等多種細胞中均有表達[3]。后來研究發現,RAGE能夠非序列特異性地與多種配體結合,如S100蛋白、淀粉樣蛋白β、高遷移率族蛋白1、DNA、RNA等,是一個模式識別受體。RAGE作為多配體受體,其配體種類多為損傷相關分子模式分子(damage associated molecular pattern molecules, DAMPs),RAGE與其配體結合后,能夠激活細胞的下游信號通路,盡管其確切的生理功能尚不清楚,但有充分的證據表明RAGE信號通路能夠通過調控炎癥反應以及細胞凋亡等生理過程參與免疫反應,進而參與多種疾病的疾病進程,如糖尿病、癌癥、敗血癥等[4-6]。

在真核細胞內,組蛋白作為染色質的主要組成蛋白,能夠參與調控基因的復制、轉錄及翻譯等多種生理過程;然而胞外組蛋白卻被認為是多種疾病不良預后的生物標志物,其在患者體內水平的升高會導致急性炎癥反應等并發癥從而加重病情。例如,胞外組蛋白是導致敗血癥患者死亡的主要原因之一[7];胞外組蛋白水平的升高能夠加重腎損傷、促進血栓的生成[8-9];除此之外,在腹膜炎、胰腺炎等多種炎癥反應中,胞外組蛋白的濃度均有明顯上升[10-12],因此其也被看作是一種內源性DAMPs。當細胞受到損傷時,組蛋白會被釋放到胞外,此外,組蛋白還會通過凋亡、壞死細胞,以及中性粒細胞胞外殺菌網絡(neutrophil extracellular traps, NETs)被釋放。有研究表明,組蛋白能夠通過刺激Toll樣受體2、4(TLR2/4)介導疾病過程,但其引發炎癥反應的具體分子機制目前尚不清楚,對此深入研究能夠幫助人們理解胞外組蛋白誘導炎癥反應的機制,開發抗炎癥疾病的治療手段。

先前研究發現RAGE能夠介導哺乳動物細胞對組蛋白修飾的微米級顆粒的吞噬[13],然而目前并沒有報道稱組蛋白是RAGE的配體,對RAGE能否直接識別組蛋白,以及該過程能對細胞產生何種影響尚沒有研究報道。因此,本研究對組蛋白激活RAGE進而引發的細胞反應做了初步探究,為進一步研究組蛋白及RAGE相關的疾病過程提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HEK293T細胞是由HEK293細胞的衍生細胞而來,含有SV40大T抗原;RAGE-敲除HEK293T細胞是由HEK293T細胞敲除RAGE基因而來;RAW264.7細胞是小鼠單核巨噬細胞白血病細胞;RAGE-敲除RAW264.7細胞是由RAW264.7細胞敲除RAGE基因所得;實驗細胞均由實驗室保存。

DMEM培養基、EDTA-胰酶、PBS、組蛋白,生工生物工程(上海)股份有限公司;標準胎牛血清,美國Hyclone公司;Lyso-Tracker-Red、Calcein AM/PI染色試劑盒、活性氧檢測試劑盒、Avidin-FITC,上海碧云天生物技術有限公司;生物素,美國默克公司;賴氨酸,國藥集團化學試劑有限公司;ELISA試劑盒,美國eBioScience公司。

1.2 儀器與設備

DS-Ri2共聚焦熒光顯微鏡,Nikon公司;TY7622振蕩混合器,易擴中國有限公司;QB-128旋轉培養器,其林貝爾儀器制造有限公司;HYL-A電熱恒溫搖床、SF-SW-1100生物安全柜,上海三發科學儀器有限公司;MX150高速冷凍離心機,日本日立HITACHI公司;Midi 40二氧化碳培養箱、NanoDrop2000分光光度計,賽默飛世爾科技有限公司;Accuri C6流式細胞儀,美國碧迪醫療器械有限公司;iMark酶標儀,美國伯樂公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞消化與傳代

待細胞鋪板率為80%左右(S/S)時,棄上清,用PBS輕輕洗滌細胞2次(洗去板底殘留蛋白),加入1 mL 胰酶(含EDTA)并輕輕搖動培養皿,使胰酶與細胞充分接觸。2～3 min后,加入4 mL新鮮培養基終止胰酶消化,用移液槍輕輕吹打,將貼壁細胞完全吹打混勻后,吸入離心管中,1 400 r/min離心3 min收集細胞,棄上清液,用5 mL新鮮培養基將白色沉淀吹打混勻,吸取2～2.5 mL接種到37 ℃預熱的10 mL 培養基中,在37 ℃含5%二氧化碳的培養箱中靜置培養。

1.3.2 綠色熒光標記的組蛋白、DNA-組蛋白復合物的制備

稱取1 000 μg組蛋白凍干粉并用1 mL雙蒸水溶解,使終質量濃度為1 000 μg/mL,向組蛋白溶液中加入10 μmol生物素,振蕩混勻,避光室溫孵育30 min后,加入8 μmol賴氨酸避光室溫孵育20 min終止反應。向組蛋白溶液中加入10 μL Avidin-FITC,避光室溫孵育1 h后,將組蛋白溶液放在4 ℃透析過夜,以去除未與組蛋白結合的Avidin-FITC。綠色熒光標記的DNA-組蛋白復合物的制備是將200 μL透析后的綠色熒光標記的組蛋白與2 nmol 22-nt DNA(序列為5′-GTCGCGTGCCAGATCGGGGTTC-3′)干粉振蕩混勻,在4 ℃轉盤結合1 h以上。

1.3.3 流式細胞術分析對組蛋白的內化

將HEK293T細胞接種于12孔板(1 mL),每孔接種約2×105個細胞,置于37 ℃含5%二氧化碳的培養箱中靜置培養24 h,待鋪板率達到80%(S/S)左右時準備實驗。將100 μg提前制備的綠色熒光標記的(DNA-)組蛋白與細胞共孵育1 h,孵育結束后PBS洗滌細胞1次,用含EDTA的胰酶消化5 min后再用PBS洗滌2次,上機檢測內化效率。

1.3.4 熒光共定位分析

將HEK293T細胞接種于1.5 mL共聚焦顯微鏡專用培養皿中,待鋪板率達到80%(S/S)左右時準備實驗。將綠色熒光標記的組蛋白加入到培養皿中,使其終質量濃度為100 μg/mL,在37 ℃含5%二氧化碳培養箱中孵育1 h,然后加入0.06 μL Lyso-Tracker-Red,孵育20 min后,更換新鮮培養基,在顯微鏡下觀察、拍攝。

1.3.5 活性氧檢測

將HEK293T細胞接種于12孔板(1 mL),每孔接種約2×105個細胞,待鋪板率達到約80%(S/S)時準備實驗。按照說明書操作原位裝載探針,具體步驟為用無血清培養基1∶1 000稀釋熒光探針,使其終濃度為10 μmol/L,去除培養基后,每孔加入500 mL稀釋好的熒光探針,37 ℃細胞培養箱孵育30 min,用無血清培養基洗滌3次,以充分去除細胞外的熒光探針。向12孔板每孔中加入100 μg(DNA-)組蛋白,使實驗組培養基內組蛋白質量濃度為100 μg/mL,與細胞共孵育1 h后使用PBS洗滌一次細胞,隨后用200 μL PBS吹打混勻并收集細胞,使用流式細胞儀進行綠色熒光的檢測。

1.3.6 細胞活性與毒性檢測實驗

使用Calcein AM/PI染色試劑盒進行細胞活性與毒性檢測實驗。接種約1×105個細胞于鋪有細胞爬片的24孔板中(0.5 mL),置于37 ℃細胞培養箱靜置培養24 h后每孔加入250 μL Calcein AM/PI檢測工作液,37 ℃避光孵育30 min,孵育結束后,在熒光顯微鏡下觀察染色效果,并拍照記錄。

1.3.7 細胞因子檢測

將RAW264.7細胞接種于12孔板(1 mL),每孔接種約2×105個細胞,置于37 ℃細胞培養箱靜置培養24 h后,每個孔中加入100 μL 1 000 μg/mL的組蛋白或DNA-組蛋白復合物,與細胞共同培養8 h后取上清培養基,3 000 r/min離心3 min,每個樣品設置4個平行;使用ELISA試劑盒檢測炎癥因子TNF-α以及IL-6的釋放水平。具體步驟如下:

(a)按比例混合捕獲抗體及包被緩沖液,渦旋振蕩30 s后加入96孔板中,每孔加100 μL,4 ℃密封條件下過夜,使抗體與孔板底部偶聯,用含0.05%吐溫的PBS緩沖液洗滌3次(后續步驟中洗滌均使用此緩沖液)。

(b)將200 μL ELISA/ELISPOT稀釋液加入到已包被抗體的96孔板中,室溫下封閉2 h,洗滌1次以上。

(c)用去離子水將TNF-a、IL-6標品稀釋至1 000 pg/mL。用去離子水將樣品稀釋10倍,標準品梯度稀釋3次后分別加入孔板中,并用稀釋液設置空白對照,每孔體積100 μL,室溫密封條件下反應2 h,洗滌3次。

(d)按比例混合檢測抗體及稀釋液,渦旋振蕩30 s后加入96孔板中,每孔100 μL,室溫密封條件下反應1 h,洗滌3次。

(e)按比例混合Avidin-HRP以及稀釋液,渦旋振蕩30 s后加入96孔板中,每孔100 μL,室溫密封條件下0.5 h,洗滌5次。

(f)將TMB顯色劑按照每孔100 μL加入96孔板,室溫避光條件下反應15 min,此時樣品由無色變為藍色;

(g)每孔加入100 μL終止液終止反應,樣品由藍色變為黃色;

(h)用酶標儀測量各孔在450 nm波長下的吸光度值;根據標準曲線及稀釋倍數計算各孔樣品的細胞因子濃度。

1.4 統計學分析

所有實驗均采用至少3個獨立數據樣本分析,使用GraphPad Prism 9軟件計算雙尾非配對t-test檢驗分析統計學顯著性,在P<0.05時表示差異具有統計學意義。對于本實驗結果標記如下:P≥0.05標記為ns;P<0.05標記為*;P<0.01標記為**;P<0.001標記為***;P<0.000 1標記為****。

2 結果與分析

2.1 敲除RAGE降低HEK293T細胞對組蛋白的內化能力

RAGE與其配體綁定后,多引發吞噬作用[14-15],為了觀察HEK293T細胞是否能夠識別內化可溶性組蛋白分子,本研究使用綠色熒光(FITC)標記了組蛋白,將其加入到細胞培養基中,使終質量濃度為100 μg/mL,與HEK293T細胞共孵育1 h后,在顯微鏡下觀察。結果顯示,野生型細胞呈現明顯的組蛋白與溶酶體共定位現象(圖1中箭頭所指黃色熒光點即為綠色熒光標記的組蛋白與紅色熒光標記的溶酶體共定位,比例尺為10 μm),而在RAGE-敲除細胞內則未發現有熒光共定位現象(圖1),說明在HEK293T細胞中,RAGE可以介導識別并內化組蛋白。

圖1 熒光顯微鏡分析野生型與RAGE-敲除細胞內化組蛋白Fig.1 Analysis of histone uptake in wild-type and RAGE-KO cells by fluorescence microscopy

為了進一步量化比較野生型和RAGE-敲除細胞對組蛋白的內化能力,采用流式細胞術進行分析。將細胞與100 μg/mL組蛋白共孵育1 h后上機檢測,結果顯示,在敲除RAGE后,HEK293T細胞對組蛋白的內化能力降低約80%(圖2-b),說明RAGE在HEK293T細胞內化組蛋白過程中起到了主導作用。有報道稱DNA可以增強組蛋白對TLR2、TLR4的激活作用[16],因此接下來檢測了細胞對DNA-組蛋白復合物的內化能力。實驗數據顯示,將組蛋白與DNA結合后再與細胞共孵育可以顯著提升細胞對組蛋白的內化效率,提升約3倍(圖2-b)。該實驗結果說明DNA可以增強組蛋白對RAGE的激活作用。

a-野生型與RAGE-敲除細胞綠色熒光通道FACS直方圖對比; b-FACS直方圖的量化表示圖2 敲除RAGE抑制HEK293T細胞對組蛋白的內化Fig.2 Knock out of RAGE inhibits histone uptake in HEK293T cells

2.2 內化組蛋白不會導致細胞死亡

許多研究表明,胞外組蛋白在體內、體外均表現出明顯的細胞毒性[7, 17],因此本研究分析了(DNA-)組蛋白與細胞共孵育后的對細胞活性的影響。如圖3所示,將細胞與100 μg/mL組蛋白共孵育1 h后,不論野生型或RAGE-敲除細胞,均呈現鈣黃綠素-AM陽性(有綠色熒光)、碘化丙啶陰性(無紅色熒光)現象(圖3),這表明在本實驗條件下,野生型與RAGE-敲除細胞均未在與(DNA-)組蛋白共孵育后造成細胞死亡。

a-野生型細胞染色結果圖;b-RAGE-敲除細胞染色結果圖圖3 內化組蛋白不會導致細胞死亡Fig.3 Uptake of histone does not induce cell death

2.3 組蛋白能夠通過RAGE導致胞內活性氧濃度升高

RAGE與其配體的綁定會激活多種信號通路,從而引發炎癥反應,例如,由活性氧水平升高導致線粒體損傷所引發的炎癥反應[18]。因此本研究檢測了野生型和RAGE-敲除細胞與100 μg/mL(DNA-)組蛋白共孵育1 h后胞內的活性氧水平。結果顯示,組蛋白和DNA-組蛋白復合物均可使野生型細胞的胞內活性氧濃度提高,但(DNA-)組蛋白無法使RAGE-敲除細胞的胞內活性氧濃度升高(圖4-c)。DNA-組蛋白復合物提升活性氧水平約為組蛋白的3倍(圖4-b),為了排除游離DNA對結果的影響,研究也設置了DNA對照組,結果表明游離DNA不能引起胞內活性氧水平升高(圖4-b),這說明組蛋白可以通過激活RAGE導致胞內活性氧水平升高,DNA可以增強組蛋白對RAGE的激活。

a-野生型和RAGE-敲除細胞綠色熒光通道的FACS直方圖對比; b-野生型細胞FACS直方圖的量化表示; c-RAGE-敲除細胞FACS直方圖的量化表示圖4 組蛋白通過RAGE導致胞內活性氧水平升高Fig.4 Histone induces ROS production via RAGE

2.4 組蛋白通過RAGE誘導細胞釋放炎癥因子

RAGE與其配體的綁定會通過多條途徑激活下游信號通路,從而導致炎癥因子的釋放,引發炎癥反應[19]。接下來,本研究檢測了組蛋白和DNA-組蛋白復合物能否激活RAGE誘導炎癥因子的釋放。本實驗選用巨噬細胞檢測炎癥因子的釋放水平,將細胞與100 μg/mL組蛋白共孵育8 h后取培養基上清進行ELISA檢測,結果發現,在與組蛋白共孵育后,野生型巨噬細胞內的TNF-α以及IL-6表達量顯著增加,將DNA與組蛋白綁定后能夠進一步提升炎癥因子的水平,而RAGE-敲除細胞內炎癥因子無上調現象(圖5)。該結果表明組蛋白能夠激活RAGE信號通路,導致胞內炎癥反應。

a-ELISA檢測TNF-α水平;b-ELISA檢測IL-6水平圖5 組蛋白通過RAGE誘導細胞釋放炎癥因子Fig.5 Histones induce pro-inflammatory cytokines in macrophages via RAGE

3 結論與討論

研究表明,RAGE與其配體結合后多引發吞噬作用,例如,使用RAGE特異性抗體封閉的巨噬細胞或Rage-/-小鼠來源的巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬活性均有降低[20]。在之前的研究中,發現RAGE參與了非專職吞噬細胞對組蛋白修飾的微米顆粒的吞噬,本研究結果表示,RAGE能夠介導細胞對可溶性組蛋白分子的內化,該結果支持了組蛋白是RAGE配體的假設。

近來諸多研究表明組蛋白有強細胞毒性與促炎活性。胞外組蛋白能夠激活機體的免疫應答,引發炎癥反應,造成并發癥從而加重疾病,例如,胞外組蛋白被認為是致死性全身炎癥的潛在介質,在多種小鼠器官損傷的模型中,胞外組蛋白的含量均有上升,高濃度胞外組蛋白能夠引發無菌性炎癥,導致急性肺損傷、多器官功能衰竭,甚至死亡[16, 21]。而在本研究中,將哺乳動物細胞與組蛋白共孵育后并不會造成細胞死亡,這說明在本研究的實驗條件下,組蛋白不會表現出強細胞毒性,因此可以將本實驗條件作為研究組蛋白與RAGE相關機制的哺乳動物細胞模型。

RAGE作為模式識別受體,能夠識別多種DAMPs,其配體的種類決定了它可以參與調控多種病理過程,如糖尿病、神經退行性疾病(如阿爾茲海默癥)、慢性炎癥反應等[22-23]。與配體結合后,RAGE能夠通過刺激NADPH氧化酶,促進胞內活性氧的生成[24],RAGE信號通路的激活還能夠促進炎癥因子的釋放,從而介導炎癥反應[18-19]。在本研究中,RAGE與組蛋白結合后能夠顯著提升胞內活性氧水平,并能夠促使TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達,該結果說明組蛋白能夠作為RAGE的配體激活其下游信號通路。

生理條件下,胞外組蛋白多以DNA-組蛋白復合物的形式存在,例如,在炎癥反應中被釋放到胞外的NETs,以及細胞在凋亡、壞死過程中釋放的核小體等。先前研究表明,DNA能夠增強組蛋白誘導的血栓的生成[9],本研究將組蛋白與DNA結合,模擬胞外組蛋白的核小體存在形式,結果顯示將組蛋白與DNA綁定能夠增強其對RAGE的激活作用,該結果更加強化了本研究發現在病理生理過程的重要性。由于DNA是RAGE的配體之一,因此推測DNA能夠增強組蛋白與RAGE綁定的親和力,從而進一步激活RAGE及其下游反應,該假設還需要進一步的結構分析證明。

目前組蛋白在體內誘發疾病的機理尚不明晰,本研究結果表明組蛋白能夠通過激活RAGE誘發炎癥反應,初步明晰了RAGE與組蛋白之間的聯系,為研究RAGE和組蛋白相關的疾病提供了思路,為后續探索組蛋白相關的炎癥反應的分子機制提供了一個新的研究方向。