二代測序技術在骨關節結核臨床診斷中的應用價值

姚曉偉 劉樹仁 景艷色 賈晨光

目前,結核病仍然是一個威脅全球公共衛生安全的嚴重問題。肺外結核是由肺結核通過血液或淋巴系統播散到人體的各個臟器,發生在肺部以外部位的結核病。骨關節結核約占肺外結核患者的11.3%～34.5%[1]。骨關節結核病變組織由于處于循環終末端,病灶中結核分枝桿菌數量少,加之病灶處病變組織直接獲取困難,傳統檢測方法陽性率低,使得骨關節結核的早期診斷仍然面臨挑戰[2]。近年來,二代測序技術(next generation sequencing,NGS)的發展明顯提高了病原菌檢測陽性率[3-5],但其在骨關節結核診斷中應用價值的研究報道還較少[6]。本研究旨在通過回顧性分析疑似骨關節結核患者的NGS與BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(簡稱“培養”)和利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測(GeneXpert MTB/R1F,簡稱“Xpert”)的檢測結果,評估NGS技術在骨關節結核診斷中的應用價值。

對象和方法

一、研究對象

采用回顧性研究方法,參照入組標準收集2019年12月至2022年12月河北省胸科醫院骨科收治的185例疑似骨關節結核患者臨床資料,根據最終臨床診斷,將患者分為結核組(骨關節結核155例)和非結核組(非骨關節結核30例),具體見表1。其中,非結核組患者包括化膿感染性疾病24例、退變性骨關節炎和風濕免疫性骨關節病各3例。所有患者病灶標本(包括51份膿液、89份肉芽組織和45份骨組織)均經手術或者穿刺途徑獲取,且均同時送檢NGS、培養及Xpert。本研究經河北省胸科醫院倫理委員會審批(審批號:XK2022023)。

表1 患者一般臨床資料在兩組中的分布情況

入組標準:(1)存在骨關節結核癥狀及體征,臨床懷疑骨關節結核;(2)實驗室初步檢查提示存在結核感染;(3)患者臨床特征及影像學表現支持骨關節結核,且抗結核治療有效;(4)具有完整的臨床資料。需同時滿足以上4項標準。

排除標準:(1)有精神疾病者;(2)合并HIV/AIDS等免疫系統疾病;(3)經臨床癥狀、影像學、實驗室檢查、病原學及病理學等聯合診斷已排除骨關節結核的患者。

二、研究方法

1.標本的采集:所有患者均經手術或穿刺病變部位采集病灶部位標本。采集過程嚴格按照手術無菌操作原則在層流手術室內進行。在標本采集、轉移、分裝過程中杜絕與環境空氣接觸,病灶膿液或病灶組織采用無菌采集瓶進口管直接通過負壓吸引進入專用采集瓶,再通過無菌注射器注入相關封裝容器進行送檢與培養。

參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[7],將所有組織標本充分研磨,用N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-2%NAOH)適當清洗,3000 r/min 離心半徑8 cm,離心20 min。肉芽組織、骨組織加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)后,應用微型研磨器(Fast-prep24,美國 MPBiomedicals公司)研磨,按組織的堅韌度等調節設置按鈕,采用頻率為6.5 m/L,設置時間標準為 20 s,振蕩2～3次形成勻漿,制成懸液,均勻分為3份,分別用于分枝桿菌培養、 Xpert檢測和NGS檢測。

2.分枝桿菌培養:取2 ml標本用于培養,嚴格按照BACTEC MGIT 960系統操作說明書進行,培養時間設定為42 d。儀器報告陽性后,取儀器報陽培養液進行涂片鏡檢,確定菌純度后使用MPB64抗原法和聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)進行菌群鑒定。

3.NGS檢測:將獲取的標本裝入不同的無菌容器,送至實驗室(中國上海冰緣醫學檢驗實驗室)。取500 μl標本,經玻璃珠混合研磨后按照DNA/RNA Miniprep Kit(R2002,ZymoBIOMICS)試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產)步驟提取病原體DNA/RNA產物,使用RTIII All-in-One Mix(MR05001,莫納生物科技有限公司)逆轉錄試劑盒步驟將RNA產物逆轉錄成cDNA。以cDNA和DNA產物為模板,使用病原體靶向測序建庫試劑盒(Pathogeno One標準版,SJ0005,上海冰緣醫療科技有限公司)進行多重PCR擴增富集(一輪PCR擴增),擴增產物經DNA純化磁珠分選后,再通過二輪PCR擴增,加上測序接頭試劑盒和用于樣本識別的barcode序列試劑盒,產物再次經DNA純化后,即得到制備好的測序文庫。制備好的文庫使用瓊脂糖凝膠電泳進行質檢,然后再使用Qubit 4.0熒光計準確定量DNA濃度,按照文庫濃度定量結果進行混庫,再經過稀釋和旋渦振蕩使文庫變性。其后使用Illumina MiSeq Reagent Nano Kit進行高通量測序,測序平臺為Illumina MiSeq,平均每個文庫的數據量為0.03～0.05 M reads,測序讀長為PE60。對下機數據進行引物識別,并與病原數據庫進行比對,最終確定樣本中的病原體種類和含量?？紤]結核分枝桿菌為胞內致病菌,豐度較低,污染可能性小,本研究設定了較低的閾值,即當至少1個讀數被映射到種或屬水平時,則被視為結核分枝桿菌陽性。

4.Xpert檢測:按照利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測系統儀器使用說明書進行操作(美國Cepheid公司)。取2 ml標本置于螺旋蓋的無菌管中,加入2 ml標本處理液,旋緊管蓋,在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10 s,室溫靜置10 min,在渦旋振蕩器上再次渦旋振蕩10 s,室溫靜置5 min,使標本充分液化。吸取2 ml液化標本至Xpert反應試劑盒,將其放置到Xpert MTB/RIF模塊中,儀器開始進行自動化檢測。反應結束后,檢測結果自動判讀,在檢測系統窗口下即可直接觀察測試結果。

5.臨床診斷標準:參考《WS 288—2017肺結核診斷》[8]與《WS 196—2017結核病分類》[9]進行骨關節結核的臨床診斷。符合以下全部條件則臨床診斷為骨關節結核:(1)患者臨床癥狀、體征與影像學(包括X線攝影、CT及MRI檢查)發現的局部膿腫、死骨與結核病表現相符;(2)標本病理學提示干酪樣壞死為朗罕細胞肉芽腫形成;(3)病灶標本的微生物學檢測(培養法或者Xpert檢測)證實為結核分枝桿菌感染;(4)規律抗結核藥物治療6個月以上,結核中毒癥狀及局部癥狀消失。

6.病原學檢測質量控制:(1)陽性質控:使用企業自制的參考品,構建3個重復文庫并上機測序,以測試擴增的靈敏度。同批次試劑購買到貨后,進行質粒(即已知混菌)性能測試。(2)陰性質控:使用無菌無酶水與當日樣本一起提取質控,查看其提取過程是否存在污染。(3)純化質控:使用無菌無酶水從一輪擴增開始參與試驗,查看建庫過程是否存在污染。

三、統計學處理

使用SPSS 20.0軟件進行數據的統計分析。計數資料以“例(百分率,%)”描述,兩組間差異的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。以最終臨床診斷為參考標準,計算并比較NGS、分枝桿菌培養及Xpert檢測標本中結核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率、Kappa值及約登指數,并計算NGS檢測各臨床標本中結核分枝桿菌的陽性檢出率,以了解NGS檢測不同臨床標本的診斷準確性。繪制受試者工作特征(ROC)曲線,計算ROC曲線下面積(AUC),以判斷不同檢測方法對臨床診斷結果的診斷價值。其中,Kappa值在0.00～0.20為極低一致性、0.21～0.40為一般一致性、0.41～0.60為中度一致性、0.61～0.80為高度一致性、0.81～1.00為幾乎完全一致;AUC的取值范圍為0.5～1,AUC值越大說明該分類效果越好。

結 果

一、不同檢測方法陽性結果的檢出情況

185例疑似骨關節結核患者中,NGS檢測陽性117例(63.24%),Xpert檢測陽性100例(54.05%),培養陽性66例(35.68%)。其中,單一NGS檢測陽性74例,單一Xpert檢測陽性55例,單一培養陽性30例,NGS+Xpert+培養均陽性32例,NGS+Xpert均陽性10例,NGS+培養均陽性1例,培養+Xpert均陽性3例;在Xpert檢測陰性的85例患者中,NGS檢測陽性75例(88.24%);在培養陰性的119例患者中,NGS檢測陽性84例(70.59%)。NGS檢測骨關節結核的陽性率明顯高于Xpert和分枝桿菌培養,差異均有統計學意義(χ2=24.982,P<0.001;χ2=37.934,P<0.001)。

二、不同檢測方法對骨關節結核的檢測效能

以最終臨床診斷為標準,NGS、Xpert和培養法診斷骨關節結核的敏感度分別為74.84%、64.52%和42.58%,特異度分別為 96.67%、100.00%和100.00%,診斷符合率分別為78.38%、70.27%和51.89%,Kappa值分別為0.799、0.590和0.504,NGS與臨床診斷結果的一致性程度較強,Xpert和培養與臨床診斷結果的一致性中等。具體見表2。30例非結核組患者中,1例患者NGS檢測陽性(為術中搔刮傷口竇道處病灶標本測得陽性,考慮外界污染可能性,后根據典型影像學歸為“腰椎化膿性脊柱炎”,誤診率為3.33%(1/30),而Xpert和培養法均未在非結核組患者中檢測出陽性,特異度均為100.00%。

表2 185例疑似骨關節結核患者經NGS、Xpert及培養法檢測情況

針對NGS、Xpert和培養法構建ROC曲線(圖1),結果顯示:NGS、Xpert和培養法檢測的AUC值(95%CI)分別為0.867(0.693～0.941)、0.703(0.612～0.784)和0.623(0.529～0.717),三者對臨床診斷結果的診斷價值均較高,以NGS檢測為最高(圖1)。

圖1 NGS、Xpert和分枝桿菌培養診斷骨關節結核的受試者操作特征曲線

三、 NGS檢測不同標本的檢出情況

51例送檢膿液標本患者中,47例最終診斷為骨關節結核,其中41例NGS檢測陽性。89例送檢肉芽組織標本患者中,79例最終診斷為骨關節結核,其中56例NGS檢測陽性。45例送檢骨組織患者中,29例最終診斷為骨關節結核,其中20例NGS檢測陽性。NGS檢測膿液標本的陽性率高于肉芽組織及骨組織送標本,差異有統計學意義(χ2=4.560,P=0.031;χ2=13.335,P<0.001);檢測膿液標本的陽性率高于Xpert和培養,差異均有統計學意義(χ2=2.468,P=0.016;χ2=16.452,P<0.001);檢測肉芽組織的陽性率高于Xpert和培養,差異均有統計學意義(χ2=1.480,P=0.024;χ2=15.208,P<0.001);NGS檢測骨組織標本的陽性率高于培養,差異有統計學意義(χ2=1.169,P=0.028)。具體見表3。

表3 NGS檢測骨關節結核患者不同臨床標本的MTB檢出情況

討 論

盡管分枝桿菌培養是診斷結核病的“金標準”,但其培養條件要求高、周期長、敏感度低,使得臨床中大部分的骨關節結核患者的病原學檢測多為陰性[10]。本研究中185例疑似骨關節結核患者的傳統分枝桿菌培養陽性率僅為35.68%,提示僅依靠分枝桿菌培養進行骨關節結核診斷,會導致大量的病原學陰性患者被漏診。但隨著分子生物學診斷技術的飛速發展,尤其是Xper技術的出現,大大提高了結核分枝桿菌的檢出率,具有檢測快速、準確性高、操作簡便、多重檢測等優點,可用于早期診斷和感染篩查。但其試劑成本較貴,檢測費用高,不利于基層廣泛使用,尚需在臨床工作中進一步實踐和探索[11]。

2019年,通過NGS技術首先發現了新型冠狀病毒的遺傳學信息測序。作為一種新興的病原學檢測方法,NGS技術克服了傳統檢測方法的局限性,可對樣本中所有核酸進行平行檢測,被用于病原菌和耐藥基因的檢測,以及調查流行病來源等方面[12],在目前的臨床工作中主要用于病原菌的檢測。由于NGS是對臨床樣本直接進行無假設性、培養獨立的病原體檢測,使其可檢測任意病原體,包括生長緩慢及較難培養的結核分枝桿菌,因此,理論上NGS技術檢測分枝桿菌的敏感度應該為100%,但這與臨床實際尚有出入,分析原因主要為:(1)檢測標本復雜;(2)臨床檢測標本均含有大量人類基因,使得測序結果中99%以上為人源序列,微生物序列僅占極小部分,降低其檢測的敏感度;(3)檢測成本高,限制了測序的深度[13]。針對這一問題,目前現有技術可以消耗部分宿主核酸,以減少人類宿主背景序列在數據中的相對比例,進而提高病原體的檢測敏感度[14],但該技術尚未成熟;(4)在采樣過程及環境中,甚至檢測試劑中均無法避免污染菌[15]和定植菌的存在,使得NGS可檢測出包括病原菌、污染菌及定植菌在內的所有微生物,但目前尚無明確的標準用于鑒別病原菌、污染菌及定植菌,僅可測定微生物序列占總序列的百分比,這對結果的臨床判斷也帶來了巨大挑戰[16]。臨床工作者應嚴格遵守無菌操作,并在檢測過程中加入陰性對照,并結合序列濃度及其他輔助化驗檢查、臨床特點做出綜合判斷。

本研究發現,NGS檢測結核分枝桿菌的陽性檢出率均明顯高于Xpert和培養法,并可檢出Xpert陰性和培養陰性患者中大于1/2的患者,提示NGS診斷骨關節結核優于Xpert和培養法,具有重要臨床價值。以最終臨床診斷為參考標準,3種檢測方法均表現出較高的特異度,與姚黎明等[17]報道mNGS診斷骨關節結核的敏感度(57.68%)及特異度(97.65%)相符。說明NGS技術不僅可提高結核分枝桿菌的陽性檢出率,還可以避免環境污染、送檢污染及實驗交叉污染,具有較高的特異度,對早期診斷骨關節結核具有重要價值。研究還發現,NGS診斷骨關節結核的符合率(78.38%)明顯高于Xpert(70.27%)和培養(51.89%),且AUC值(0.867)也高于Xpert(0.703)和培養法(0.623)。說明與Xpert和培養相比,NGS檢測結果與臨床診斷的一致性較強,診斷價值也較高。提示NGS對骨關節結核具有更好的診斷效能,可提供重要的臨床指導。

目前,NGS應用于臨床的研究還較少,而通過檢測不同臨床標本診斷骨關節結核準確性的研究更少[18-19]。本研究發現,NGS檢測結核分枝桿菌陽性率的高低還與檢測的標本類型相關,即檢測膿液的陽性率(80.39%)明顯高于肉芽組織(62.92%)和骨組織(44.44%),說明標本組織密度越低陽性檢出率越高,這為臨床標本的送檢提供了有利參考。分析各種標本檢測陽性率差異的原因可能為:骨關節結核病變發展早期,病灶處菌量較多,機體處于較強變態反應期,組織器官中血管的滲透性較高,炎性介質及蛋白質向血管外滲出,此時處于以滲出為主的膿液性病理表現,主要表現為漿液性、纖維蛋白炎性滲出,經過滲出、壞死、增生變化逐漸形成結核性肉芽組織及干酪樣壞死物,干酪物質進一步鈣化,最后形成硬化骨組織,此時菌量減少。因此,在病理過程的不同階段,結核分枝桿菌濃度分布情況不同,致不同標本檢測陽性率不同[20-22]。

本研究仍存在一定的局限性。首先,本研究為單中心研究,樣本收集前的一些臨床資料可能不夠完善;其次,由于本單位就診患者多為高度疑似結核病患者,導致非結核組患者樣本量較小,可能會使結果產生一定的偏倚,影響結論的精準度和可靠性。未來還需持續開展大樣本多中心研究以提高研究結果的可靠性。

綜上所述,NGS可明顯提高骨關節結核患者的病原學陽性檢出率,為臨床早期發現、早期治療骨關節結核提供了有效方法。并建議臨床優先送檢膿液標本行NGS檢測。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻姚曉偉:搜集病案信息、撰寫文章;劉樹仁和景艷色:搜集病案信息;賈晨光:搜集病案信息、對文章的知識性內容作批評性審閱和指導