納米銀對小鼠H22 肝癌腹水瘤抑制作用的實驗研究*

石皓，林倩，王毓興，許玲，鄭洋，俞紅女

116000 遼寧 大連，大連大學附屬新華醫院 中心實驗室（石皓、林倩、許玲，俞紅女）；571900 ?？?，澄邁縣人民醫院 重癥醫學科（王毓興）；116000 遼寧 大連，大連大學 醫學院（鄭洋）

腹水瘤是惡性腫瘤后期發生轉移產生的常見并發癥，確診后患者的中位生存期僅有5.6 個月，反映了腫瘤的預后不良。產生癌性腹水的常見腫瘤類型包括肝癌、消化道腫瘤、乳腺癌以及卵巢癌等，其中50%以上會在腫瘤后期產生惡性腹水［1］。腫瘤后期的癌性腹水對大多數常見的化療藥物敏感性低，目前除了腹腔導管引流等治療措施外，尚無良好的處理方式。然而這些手段也只能暫時緩解腹痛、腹脹、便秘及呼吸困難等癥狀，長期的效果并不理想，并且存在并發腸粘連、腸梗阻及腹腔感染的風險，影響生存時間及生存質量［2］。傳統抗腫瘤藥物治療易產生耐藥，同時伴隨明顯的藥物副作用。因此，開發對腹水瘤及其原發腫瘤具有高效殺傷作用的藥物，已成為當前亟需解決的難題。

金屬納米材料的應用是一種新興的抗腫瘤手段，它克服了傳統藥物局部濃度低、非選擇性彌散及副作用大等方面的缺陷。金屬納米材料自身帶有磁性，可通過外界磁性設備對藥物進行特異投送，較大的比表面積還有利于通過基團修飾提高藥物的溶解度、增加腫瘤局部藥物濃度及增強長期滯留效應等，對腫瘤細胞進行長時程、特異性殺傷。納米材料的研究和使用，將為腫瘤疾病提供一種全新的診療方式［3-4］。作為研究熱點之一，納米銀的抗菌作用已有一定研究［5］，同時它還具有明顯的抗腫瘤潛能［6］，尤其是在乳腺癌及卵巢癌的研究中［7-8］。而對癌性腹水治療作用的相關研究卻鮮有報道，納米銀對癌性腹水療效及機制的相關研究，將為后期合并惡性腹水的腫瘤耐藥患者帶來福音。

H22 肝癌腹水瘤模型是常用的癌性腹水研究模型，利用腹水瘤模型可觀察藥物對癌性腹水的療效并研究其作用的分子機制。本實驗旨在通過應用納米銀治療昆明小鼠的H22 肝癌腹水瘤，探究納米銀對癌性腹水的療效及其安全性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞株 SPF 級昆明小鼠，6～8周齡，體重18～22 g。購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物許可證編號：SCXK（遼）2020-0001。小鼠飼養于溫度為20～25 ℃，濕度為40%～60 %的舒適環境中，自由飲水進食。實驗經大連大學附屬新華醫院倫理委員會批準開展，并嚴格遵守實驗動物倫理福利相關要求。H22 肝癌腹水瘤細胞購自上海中科院細胞庫。

1.1.2 藥品 納米銀（平均大小5 nm）由浙江三禾納米科技有限公司提供，注射用順鉑（凍干型）購自齊魯制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞腹腔內傳代 于昆明小鼠腹腔注射H22細胞懸液200 μL，1 周后處死小鼠并抽取腹水，離心（1 000 r/min， 5 min）收集細胞，再用生理鹽水調整濃度至（1×106/mL），取200 μL 細胞懸液再次注射于小鼠腹腔。同樣方式連續傳代兩次后，收集第三代細胞并調整至相應濃度，用于小鼠肝癌腹水瘤模型構建。1.2.2 小鼠H22 肝癌腹水瘤模型建立、分組及給藥處理 將200 μL 的H22 細胞（1×106/mL）注射于昆明小鼠腹腔，建立小鼠肝癌腹水瘤模型。并將其隨機分為模型組（等體積溶劑）、順鉑組（1 mg/kg）、納米銀低劑量組（0.5 mg/kg）、納米銀中劑量組（1 mg/kg）及納米銀高劑量組（2.5 mg/kg）5 組，每組8 只。24小時后，每天腹腔注射相應藥物，連續給藥12 天。

1.2.3 觀察指標 每兩天記錄一次各組小鼠活動、飲食等一般狀況，并測量其體重和腹圍變化。終止用藥后24 h，各組隨機選取小鼠進行解剖，觀察腹水生成情況。其余小鼠進行生存分析。

1.2.4 納米銀藥物安全性分析 20 只健康昆明小鼠隨機分為對照組（等體積溶劑）及納米銀高劑量組（2.5 mg/kg），每組10 只。每天腹腔注射給藥，連續給藥12 天。每2 天記錄一次小鼠體重變化情況，終止用藥后24 h 各組隨機選取小鼠5 只，采用眼球摘除法采集小鼠血液樣本，分別使用全自動血細胞分析儀、全自動生化分析儀檢測其血常規指標及肝腎功能相關生化指標。其余小鼠進行生存分析。

1.3 統計學方法

應用統計學方法處理數據：應用SPSS 24.0 統計分析軟件，對數據進行統計學分析，組間比較用LSD-t及SNK-t檢驗，多組間比較用方差分析，生存數據進行Kaplan-Meier 分析，數據以均數±標準差表示，P＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 納米銀對小鼠腹水瘤的影響

2.1.1 一般狀況 肝癌腹水瘤模型構建成功后，小鼠出現精神不佳、活動減少、進食減少、呼吸急促、腹部隆起、大便干結及肢體消瘦等情況。相較于模型組，順鉑組及納米銀高劑量組小鼠癥狀較輕且出現較晚。

2.1.2 體重變化 給藥前各組小鼠體重無明顯差異，第6 天起模型組小鼠體重明顯增加。與模型組相比，順鉑組小鼠體重有降低趨勢，納米銀高劑量組小鼠體重變化與順鉑組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05；圖1）。

圖1 給藥期間各組小鼠體重變化（±s）Figure 1.Weight Variation in Each Group of Mice（ ±s）

2.1.3 腹圍變化及腹水生成情況 終止給藥24 h后，各組隨機選取小鼠解剖觀察腹水生成情況，模型組小鼠腹腔可見大量腹水生成，納米銀組小鼠腹水量明顯減少，呈劑量依賴性，納米銀高劑量組和順鉑組未見明顯腹水生成（圖2A）。與模型組相比，納米銀組小鼠腹圍增加緩慢，納米銀高劑量組小鼠腹圍變化與順鉑組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05；圖2B）。

圖2 給藥期間各組小鼠腹圍變化及腹水生成情況Figure 2.Abdomen Circumference Variation and Ascites Formation in Each Group of Mice

2.1.4 生存分析 生存分析顯示，與模型組小鼠相比，納米銀組小鼠生存期均有所延長，納米銀高劑量組生存與順鉑組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05；圖3）。

圖3 各組小鼠生存分析Figure 3.Survival in Each Group of Mice

2.2 納米銀藥物安全性分析

2.2.1 納米銀腹腔注射對健康小鼠體重及生存的影響 給藥期間各組小鼠體重自然增長，納米銀高劑量組與對照組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05；圖4A）。生存分析顯示，對照組及納米銀高劑量組小鼠均未出現死亡（圖4B）。

圖4 納米銀腹腔注射對健康小鼠體重及生存的影響Figure 4.Effects of AgNPs Intraperitoneal Injection on Weight and Survive of Healthy Mice（ ±s）

2.2.2 納米銀腹腔注射對健康小鼠血常規及生化的影響 終止給藥24 h 后各組隨機選取小鼠采血，檢測血常規及生化各項指標。血常規結果顯示，經腹腔注射給藥后，納米銀高劑量組紅細胞數量、血紅蛋白濃度、血小板數量、白細胞數量、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比及單核細胞百分比等各項指標與對照組相比均差異無統計學意義（P＞ 0.05；表1）。血生化結果顯示，納米銀高劑量組小鼠血尿素氮、肌苷、白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及堿性磷酸酶值等各項生化指標與對照組相比均差異無統計學意義（P＞ 0.05；表2）。以上結果表明，納米銀腹腔注射對小鼠血常規及肝腎功能等無明顯影響，2.5 mg/kg 腹腔注射為納米銀的安全治療劑量。

表2 納米銀腹腔注射對健康小鼠生化指標的影響Table 2.Effects of AgNPs Intraperitoneal Injection on Biochemical Indexes of Healthy Mice

3 討 論

癌性腹水是多種惡性腫瘤后期的主要并發癥之一，以腹痛及呼吸困難等為主要表現，最終因慢性消耗及惡病質而導致患者死亡［9］。本實驗中模型組小鼠腹水生成后腹脹明顯，進食減少，糞便干結，呼吸急促，精神不佳，活動減少，出現明顯的肢體消瘦，同時體重、腹圍明顯增加，這與腹水瘤的進展明顯相關。如前所述，作為惡性腫瘤后期發生腹腔轉移的并發癥，癌性腹水對放療及多種化療藥物的敏感性明顯降低且治療副作用明顯。因此，探索一種副作用小、敏感性高且不易耐藥的新型抗腫瘤藥物成為當前癌性腹水研究中的重中之重。

納米銀的抗菌作用已實現臨床應用［5］，此外，它還具有明顯的抗腫瘤作用［6，10］，有望成一種新型的抗腫瘤藥物。本研究發現，與順鉑相比，納米銀可以有效抑制腹水瘤小鼠的腹水進展，緩解腹水瘤導致的腹脹、納差、便秘及呼吸急促等癥狀，有效提高小鼠的生存質量并延長其生存時間。但其抗腫瘤的具體機制尚未明確，相關研究正不斷完善。有研究表明，納米銀可通過誘導微核結構形成、染色體損傷及DNA 突變等抑制細胞周期及細胞增殖［10］。此外，它還能夠通過損傷線粒體結構誘導氧化應激及活性氧的產生［11］，損傷腫瘤細胞蛋白質和DNA［12］，及增強腫瘤細胞自噬水平［13］等而誘導腫瘤細胞凋亡。并且，納米銀還可以通過調節細胞因子水平及促進細胞內活性氧的產生等激活免疫細胞并解除免疫微環境中腫瘤細胞對免疫細胞的抑制，增強免疫系統功能，對腫瘤實現特異性殺傷［14-15］。較高濃度下，納米銀還可導致細胞骨架和細胞膜的納米結構破壞［16］，引起細胞質滲漏、細胞器膜損傷、氧化應激損傷以及腫瘤蛋白質和DNA 結構破壞等，導致細胞壞死［17］。

納米銀使用中需要注意的是其重金屬離子中毒的風險。有研究發現，靜脈注射后，納米銀顆粒在肝、脾、腎及腦等器官中的分布呈劑量依賴性，且受材料本身大小、形狀及表面電荷等理化性質等影響［18］。同時，通過在納米銀表面負載腫瘤特異性抗體或配體受體等化合物及乳糖等表面修飾，有助于提高其穩定性，增加腫瘤攝取率，有效靶向腫瘤以實現特異性殺傷，同時減少組織非特異性分布等所致的毒副作用［6］。還有研究者將納米銀作為靶向遞送工具，利用納米銀負載凋亡誘導劑Raptinal，有效提升了早期肝細胞癌的治療效果［19］。此外，優化給藥方案，如調整給藥方式（如腹腔注射）或聯合用藥等，也能夠在降低毒副作用的基礎上提高藥物療效。本研究采用腹腔注射給藥的方式研究納米銀在肝癌腹水瘤治療中的安全性，結果發現，與對照組相比，納米銀腹腔注射對小鼠血細胞水平、肝腎功能及體重等無明顯影響，未見明顯的毒副作用。

綜上所述，我們的研究結果表明，納米銀可以有效抑制肝癌腹水瘤的生成以改善小鼠生存情況，同時避免了腫瘤化療藥物相關的體重減輕、白細胞減少及肝腎功能損害等不良反應，且未見明顯毒副作用。本研究為納米銀在癌性腹水治療中的潛在應用價值提供了一定的理論依據，但其發揮作用的具體機制仍有待闡明。深入探究納米銀對肝癌腹水瘤的作用機制，改良納米銀制備工藝并優化其給藥方案，有望推動納米銀治療肝癌腹水瘤等惡性腫瘤的臨床研究工作進一步開展并最終發揮臨床應用價值。

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