一種羅丹明內酰胺類高分子pH熒光探針的合成及性能

李桂貞，胡英元，章博，楊耀祖，翟榮佳，趙鑫

（蘇州科技大學化學與生命科學學院，江蘇 蘇州 215009）

pH 在細胞代謝、離子遷移、酶活性和蛋白質降解等生理過程中起著重要的作用，此項生理參數非常關鍵[1-4]。多數生物體都不能存活于強堿或強酸條件下，正常的生理條件下，pH 應保持在一個狹窄的范圍內，異常的pH 會引起細胞功能障礙，由此引發相關生物體病變，包括癌癥、神經退行性疾?。∟DD）、阿爾茨海默氏?。ˋD）與囊性纖維化（CF）等[5-6]，因此研究弱酸或弱堿性環境下pH的變化十分重要?，F有技術證明，在酸堿度上，正常細胞和腫瘤細胞的pH 分別為7.4 和6.2～6.9，后者一般偏低，這種pH 上的顯著差別可用于腫瘤細胞的識別與診治[7]。此外，溶酶體是細胞中一類弱酸性細胞器（pH 為4.7～6.5），可降解細胞組分及大分子物質，能夠維持細胞穩態[8]。另一方面，生態環境pH 的變化會導致農作物物理干旱，破壞植被組織，阻礙營養吸收等[9-10]。因此，尋找定量測量pH 的有效方法對于疾病診斷和環境監測都具有重要意義。

現今，已有諸多方法皆可用來測定pH，例如電化學測量法、酸堿指示劑滴定法、電位滴定法和光譜學等方法[11-14]。但這些方法對于儀器精度、處理過程有較高要求，對其用于測定細胞pH 有諸多限制。與這些方法相比，小分子熒光探針的長處在于操作簡便、高選擇性等，但其制備過程相對復雜，與細胞可能存在排異、水溶性問題。近年來，聚合物熒光探針成為了另一研究熱點，其在生物相容性與水溶性方面表現更佳，還具有熒光信號強、高靈敏度等優勢[15]。目前，現有聚合物熒光探針研究大多是檢測金屬離子，用于pH 檢測的聚合物熒光探針還有待深入研究[16-20]。在實際檢測中，待檢測物與探針結合會導致熒光增強或熒光猝滅，受猝滅劑等因素影響，猝滅型聚合物熒光探針可能會導致檢測結果偏差[21]，增強型聚合物熒光探針的研發意義更加顯著。包含內酰胺螺環結構的羅丹明（Rhodamine）類熒光染料分子具有無熒光、無色特性，但對pH 變化有高敏感性，酸性環境下，其螺環結構開環，形成大共軛結構，會發射出熒光量子效率在85%以上的橙紅色強熒光[22]。然而，羅丹明內酰胺小分子缺乏良好水溶性，同時常與金屬離子形成配位效應或被催化分解，可嚴重干擾氫離子的熒光響應，所以水溶性表現良好的羅丹明內酰胺聚合物探針的研究具有較大價值。

本文先修飾羅丹明B，使其轉變為具有可聚合雙鍵結構的單體，接著與能夠穿透細胞膜的水溶性單體共聚，制備出一種高分子pH熒光探針PRAM，此探針具有很好的細胞膜透性與水溶性。且探針PRAM所包含的內酰胺結構中的N原子與吸電子基團相連，使相鄰N原子上電子云密度減少，因此不能再與金屬離子配合響應，導致分子呈現開環-閉環的臨界態，但對H+極為敏感。因此，探針PRAM以丙烯酰胺基團作為響應位點調控羅丹明基團，能夠只對H+形成熒光響應，且抗干擾性能突出，其響應機理如圖1 所示。該探針pKa值為4.30，可在較快的響應時間下監測細胞器內和水環境中pH 的變化，同時實現了TM3活細胞的熒光成像。

圖1 探針PRAM對pH變化的響應機理

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

化學試劑皆為市場中銷售的分析純，若未特定標注，不需要再純化，可直接使用。實驗用蒸餾水為二次蒸餾水。紅外譜圖采用德國Bruker 公司FTIR-VERTEX 80/80v 傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）；1H NMR 和13C NMR 譜圖采用瑞士Bruker公司AVANCE Ⅲ型400MHz 核磁共振儀（NMR）；元素分析用Elementar Vario EL Ⅲ型元素分析儀測定。采用UV-8500 紫外分光光度計測定其吸收光譜；熒光發射光譜采用FLS920 熒光分光光度計；用pHS-3C 型精密pH 計測定pH。采用三次獨立測量的平均標準偏差（SD）收集數據。細胞熒光成像采用SZX10型奧林巴斯顯微鏡檢測。

1.2 性能測試

探針PRAM儲備液的配制：稱取0.1g純品探針PRAM，溶于蒸餾水中，并移入100mL容量瓶，用蒸餾水定容，配制成1mg/mL的探針測試液。

UV-Vis 測試：取多份1mL 探針PRAM 水溶液（1mg/mL）于25mL的燒杯中，分別調節溶液pH為4.0～9.0，放入10mL 容量瓶，蒸餾水定容，混勻并靜置15min，檢測UV-Vis譜。

熒光光譜測試：溶液制備參照UV-Vis 測試，以下為檢測條件：激發波長（λex）與狹縫寬度各為526nm、5nm。

選擇性和干擾性測試方法：取多份1mL的PRAM水溶液（1mg/mL），分別加入1mL濃度為1×10-4mol/L的金屬離子水溶液（Fe3+、Cu2+、Pb2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+和Na+），混合均勻，調節pH為5.0或7.0，靜置15min，檢測其熒光強度。

1.3 細胞成像

控溫37℃，在?(CO2)為5%恒溫培養箱中，用10%的滅活胎牛血清DMEM 培養基培養TM3 細胞（正常小鼠睪丸Leydig細胞）。把TM3放入DEME高糖培養基[內含10%牛血清（FBS）]，靜置培養24h。將其移至24 孔板內接種。待細胞貼壁后，滴加0.5mg/mL濃度的探針，靜置培養30min，再加入不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0）的磷酸緩沖液（PBS）培養15min，用PBS 溶液洗滌兩次，在熒光顯微鏡（FM）下成像。

1.4 探針PRAM的合成

使用試劑羅丹明 B、水合肼、丙烯酰氯和丙烯酰胺，經過三步合成得到熒光探針PRAM，其合成路線如圖2所示。

圖2 PRAM的合成路線

1.4.1 中間體Mrh的合成

根據Minami等[23]和翟榮佳等[24]的方法，合成底物羅丹明B酰肼，得到粉色固體1.83g，產率80.3%。m.p.110.4～112.7℃。1H NMR（CDCl3，400MHz）（δ）：7.95～7.93（d，J= 7.5Hz，1H），7.46～7.44（m，2H），7.12～7.10（d，J= 7.5Hz，1H），6.45～6.47（d，J=7.5Hz，2H），6.41～6.42（d，J= 7.5Hz，2H），6.28～6.31（s，2H），3.61（s，2H），3.32～3.37（q，J=8.0Hz，8H），1.15～1.18（t，J=8.0Hz，12H）。元素分析[C28H32N4O2理論值（實測值）]：C，73.64%（73.61%）； H， 7.07% （7.09%）； N， 12.28%（12.23%）。

取羅丹明B 酰肼0.912g（2mmol）和四氫呋喃（THF）5mL加入到50mL三口燒瓶，冰浴下，把溶于5mL 四氫呋喃的0.2g（2.2mmol）丙烯酰氯滴加到三口燒瓶內，室溫條件下反應6h。過濾沉淀，THF 洗滌、干燥，得0.53g 粉紅色固體Mrh，收率52.0%，m.p.198.2～200.3℃。1H NMR（DMSO-d6，400MHz）（δ）：9.95（s，1H），8.79（s，1H），7.88～7.86 （d，J= 7.5Hz，1H），7.58～7.54 （m，2H），7.27～7.25（d，J= 7.5Hz，2H），7.08～7.06（d，J=7.5Hz，1H），6.74～6.72（d，J= 7.5Hz，2H），6.42（s，1H），6.39（m，1H），6.34～6.32（d，J= 16.8Hz，2H），3.40～3.29（q，J= 8.0Hz，8H），1.08～1.05（t，J= 8.0Hz，12H）。13C NMR（DMSO-d6，100MHz）（δ）： 163.84， 160.07， 153.15，151.58，149.71，148.83，133.99，129.61，129.10，128.13，125.98，124.20，123.29，116.13，108.38，106.14，97.73，65.82，44.10，12.88。元素分析[C31H34N4O3理論值/（實測值）]：C，72.92% （72.98%)；H，6.71%（6.67%）；N，10.97%（10.92%）。

1.4.2 PRAM的合成

在50mL三口燒瓶中，將0.255g（0.5mmol）Mrh、1.5g （21.13mmol） 丙 烯 酰 胺、0.10g （0.61mmol）偶氮二異丁腈溶解在30mL 環己酮中，于60℃、氮氣保護環境中，反應7h。用丙酮沉析出聚合物。再用水、丙酮溶解、沉析3次，真空干燥，得粉紅色固體，即探針PRAM，收率82%。FTIR（KBr）（v/cm-1)： 3300～3439 （ —NH， —NH2）、 2913（—CH2，—CH3）、1667（酰胺羰基）、1600、1470（苯環）。1H NMR（DMSO-d6，400MHz）（δ）：7.88（s，Ar-H），7.58～7.54（d，J=7.5Hz，Ar-H），6.89（d，J= 7.5Hz，Ar-H），6.75 （s，Ar-H），3.30（s， —NH）， 2.00～2.40 （m， —CH， —CH2），1.60～1.20（t，J= 8.0Hz，—CH3）。

2 結果與討論

2.1 PRAM的合成與表征

探針PRAM經胺解、?；?、聚合三步反應得到，制備步驟少、合成條件簡單、收率高。水溶性好的聚丙烯酰胺鏈的引入，增大了探針PRAM 的水溶性，為其實際應用，尤其是在生物活細胞熒光成像中的應用奠定了很好的基礎。高分子探針PRAM的FTIR 譜上出現的特征峰：3300～3439cm-1（—NH、—NH2）、2913cm-1（—CH2、—CH3）、1667cm-1（酰胺羰基）、1600cm-1、1470cm-1（苯環），初步表明羅丹明B 與丙烯酰胺進行了共聚反應。對比探針PRAM 和單體Mrh 的核磁共振氫譜發現，聚合后，化學位移為6.32～6.40 的烯鍵質子峰消失，同時在化學位移為2.00～2.40附近出現了—CH—、—CH2—的質子峰，但依然可觀察到氧雜萘環和羅丹明基團中苯環上的質子峰。這表明單體Mrh與丙烯酰胺進行了共聚反應，并且Mrh單元通過共價鍵連接在了高分子PRAM的側鏈上。

2.2 探針PRAM的紫外-可見吸收光譜

在pH 4.0～9.0范圍內測試探針PRAM的紫外-可見吸收光譜，見圖3。結果顯示，pH為7.0～9.0區間內，其吸光度變化不大，但在4.0～7.0區間內，其吸光度變化明顯，且隨pH變?。ㄋ岫仍鰪姡?，其吸光度大幅增強，并于526nm、567nm處出現兩個吸收峰。因此可選取能量較高的526nm作為測試發射光譜的激發波長，567nm處的最大吸收峰應歸屬內酰胺螺環結構于酸性環境中開環所致，同時使溶液從無色向粉紅色轉變，表明探針PRAM 在4.0～7.0 的范圍內可裸眼識別溶液pH的變化。

圖3 PRAM在不同pH水溶液下的紫外-可見吸收光譜

2.3 探針PRAM的熒光光譜

選擇526nm為激發波長，測定PRAM的熒光光譜，見圖4。圖4(a)顯示，隨著pH逐漸減小，探針PRAM于585nm處的熒光峰強度逐漸增強，發射出明亮的橙紅色熒光。弱酸性（pH 為4.0～7.0）環境下，當pH等于4.0時，熒光強度升至最大，對比pH為9.0 時的熒光強度，其熒光強度提升了約10 倍。原因在于H+促進了螺內酰胺環開環，羅丹明內酰胺基團被質子化，同時形成了較大共軛體系，因此熒光強度大幅增強。同時當處于弱酸性環境，探針表現出較高的靈敏性。但在弱堿性（pH 為7.0～9.0）環境下，內酰胺基團去質子化，探針PRAM的存在形式為螺內酰胺環結構，故基本無熒光發射。此外，pH為5.0～6.0區間內，pH與585nm處的熒光強度具有良好的線性關系（見圖4 插圖）。其線性回歸方程為：I=426.18-69.324c（式中，c為pH；I為585nm處的熒光強度），相關系數為0.9955。所以，在pH 為5.0～6.0 區間內，測得溶液中探針PRAM的熒光強度，可由此線性方程精確計算體系的pH?；贖enderson-Hasselbachtype方程[25]得式(1)。

圖4 PRAM的熒光強度與pH的關系

式中，I代表585nm處的熒光強度。

由式(1)計算出探針PRAM 的pKa值為4.30。585nm 處，探針的熒光強度隨pH 增大逐漸減弱，在pH為5.0～6.0區間內，變化最為顯著[如圖4(b)所示]，表明探針PRAM 適合用于弱酸性細胞器（如溶酶體、腫瘤細胞）pH變化的檢測。

2.4 探針PRAM的選擇性和抗干擾性

考慮到其他陽離子可能會干擾探針對pH 的準確檢測，本文研究了探針PRAM的抗干擾性與選擇性，結果如圖5所示。圖5(a)表明，當pH為5.0時，探針PRAM 產生明亮的橙紅色熒光；但pH 為7.0時，對于空白樣或金屬離子會顯示出較弱的熒光，可見對于H+，此探針表現出良好的選擇性。圖5(b)顯示，處于弱酸性（pH為5.0）環境的各金屬離子溶液相比于中性（pH為7.0）環境，其熒光發射明顯增強，表明常見金屬離子的存在，基本不影響對pH的檢測效果，可見探針PRAM抗干擾性良好。

圖5 探針PRAM的選擇性和抗干擾性

2.5 探針PRAM的可逆性和重復使用性

大多數熒光探針與離子結合后結構穩定，常不具備檢測可逆性，導致探針無法重復利用。為了使探針適應復雜的細胞環境，研究探針PRAM的可逆性對于實時監測細胞pH 變化有重要意義。因羅丹明內酰胺上氧原子可通過質子化、去質子化影響電子轉移，可促進并誘導其開環與閉環，因此，理論上探針PRAM是可逆的，為了驗證其可逆性，本實驗研究了pH 分別為3.0 和7.0 時，探針PRAM 的可逆性，如圖6所示。在pH=3.0時，探針PRAM熒光為“ON”態，發出強橙紅色熒光；pH=7.0 時其熒光為“OFF”態，熒光幾乎消失。在pH為3.0和7.0進行7次循環調節后，熒光強度衰減率僅為6.25%，可見探針PRAM在可逆性方面表現良好，可以重復循環使用。

圖6 探針PRAM在585nm處的熒光強度在pH為3.0和7.0下的變化

2.6 生物細胞成像

研究了探針PRAM 在TM3 細胞中的熒光成像，結果如圖7 所示。圖7 表明，沒有探針PRAM 加入和只有探針PRAM加入的TM3細胞中都無熒光呈現；然而，當pH=4.0 時，探針于TM3 細胞中發射出明亮的紅色熒光；在pH=5.0 條件下，探針PRAM 在TM3細胞內可顯示較暗的紅色熒光；當pH提升至6.0或7.0 時，TM3 細胞中基本沒有熒光。實驗證實，探針PRAM容易進入細胞，透膜性優良，同時酸性環境下能夠發射明亮的紅色熒光，可實現對活細胞內pH 變化的熒光成像。因此，此實驗結果對活細胞實時pH變化的可視化監測具有潛在應用前景。

圖7 TM3細胞的熒光成像

3 結論

以羅丹明B、水合肼和丙烯酰胺等為原料，設計合成了一種含羅丹明內酰胺基團的高分子pH 熒光探針PRAM。其pKa值為4.30，在pH為3.0～7.0范圍內，對H+有較好的選擇性和靈敏度，可實時監測體系pH 變化。在pH 為5.0～6.0 范圍內，其熒光強度與pH 具有良好的線性關系，可精確測定體系的pH。探針PRAM 在常見的金屬離子存在下，仍具有良好的選擇性和抗干擾性。同時還具備很好的可逆性和重復利用性。探針PRAM的水溶性、膜透性突出，弱酸性條件下可快速穿透細胞膜，并成功實現了TM3活細胞pH變化的熒光成像。因此，探針PRAM 可用于弱酸環境下的細胞器（如溶酶體、癌細胞等）內生理pH 變化的檢測，對研究細胞生理功能和疾病診斷具有重要意義。