仿刺參內臟的化學成分研究

劉艷芳,李曉棟,尹秀麗,李 可*

1中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物資源高效利用研究與發展中心,煙臺 264003;2中國科學院大學,北京 100049

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺參科(Stichopodidae),主要分布于中國、俄羅斯、日本和朝鮮半島等東亞國家[1]。仿刺參是棘皮動物中營養價值較高的品種之一,也是海參中最為名貴的品種,是我國傳統的食材和藥材,被譽為“參中之冠”[2]。仿刺參是我國北方最重要的海水養殖經濟品種之一,2021年,我國仿刺參養殖面積為24.74萬公頃,產量為22.27萬噸,苗種生產量為601億頭,整個仿刺參產業鏈的價值約90億美元[3]。

海參由海參體壁和海參內臟組成,海參的內臟主要由海參腸壁、海參生殖腺、呼吸樹等組成[4]。研究表明,海參體壁富含蛋白質、氨基酸、脂肪酸,礦物質和維生素等營養物質[5]。除此之外,海參體壁還含有三萜皂苷、海參多糖、膠原蛋白、海參肽、酚類、腦苷脂類和類鞘氨醇等生物活性物質,具有潛在的抗氧化、抗癌、抗高血壓、抗炎、抗血栓、抗糖尿病、抗肥胖和抗菌活性,營養和藥用價值較高[6,7]。目前,在保健和醫學領域,大多數研究主要以海參體壁為原料對海參功能進行開發,有關海參內臟的功能開發較少。研究表明,海參內臟同體壁一樣也含有豐富的蛋白質、氨基酸、多糖、脂肪酸、皂苷等活性成分,因此,海參內臟具有增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤等功能,同時還具有降血糖、降血脂、益菌等功能[8],表明海參內臟也具有很高的營養和藥用價值。然而,在海參產業中,海參內臟未能引起足夠的重視,缺乏深度的研究,對海參內臟開發利用少之又少,導致海參內臟直接被丟棄。海參內臟中的化學成分值得深入研究與開發利用。綜上所述,仿刺參內臟中的化學成分具有潛在的開發價值。為進一步深入認識仿刺參化學成分,本實驗開展了仿刺參內臟乙醇提取物的化學成分研究。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參于2021年4月從中國黃海海域采集,并由中國科學院煙臺海岸帶研究所王全超博士鑒定為Apostichopusjaponicus,解剖收集其內臟。標本(C2021-002)在-20 ℃條件下冷凍保存于中國科學院煙臺海岸帶研究所海岸帶生物學與生物資源利用重點實驗室。

1.2 儀器與試劑

Waters Pre 150半制備高效液相色譜儀(XBridge BEH C18,5 μm,19 mm×250 mm和XBridge BEH C18,5 μm,10 mm×250 mm)(美國Waters公司);Waters UPLC-Xevo G2-XSQ Tof型超高液相色譜質譜聯用儀(美國Waters公司);Bruker Avance III 500 NMR型核磁共振儀(瑞士Bruker公司);Buchi R-100旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司);真空離心濃縮儀(北京吉艾姆有限公司)。

薄層層析硅膠板(煙臺德信生物科技有限公司);薄層層析硅膠制備板(煙臺江友硅膠開發有限公司);60～100目、200～300目和300～400目正相色譜硅膠(青島海洋化工廠);反相硅膠柱層析填料RP-18(日本YMC公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(GE Healthcare公司,瑞典);茴香醛-硫酸溶液(上海國藥集團化學試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,瑞典OCEANPAK公司);甲醇、乙腈(色譜-質譜純,美國Sigma-Aldrich公司);石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇和正丁醇(分析純,上海國藥化學試劑有限公司)。

1.3 提取與分離

收集新鮮仿刺參內臟約50 kg(濕重),用95%乙醇室溫下浸泡,重復提取3次,每次浸泡7 d。合并乙醇提取液,減壓回收溶劑,將乙醇提取物分散于20 L水中,依次用石油醚(40 L)、乙酸乙酯(40 L)和正丁醇(40 L)萃取3次,減壓蒸干,得到石油醚相437.8 g,乙酸乙酯相78.2 g和正丁醇相260.0 g。將乙酸乙酯部分進行硅膠柱層析,依次用石油醚/乙酸乙酯(V/V=50∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1)和二氯甲烷/甲醇(V/V=20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1)體系進行梯度洗脫,分成A～I九個組分,F組分經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離,半制備液相色譜(乙腈∶水=32∶68,10.0 mL/min)分離純化得到化合物1(2.6 mg,tR=33.0 min)、2(1.8 mg,tR=31.0 min)、3(1.3 mg,tR=27.0 min),經半制備液相色譜(甲醇∶水=45∶55,8.0 mL/min)分離純化得到化合物4(3.9 mg,tR=20.0 min)。將正丁醇萃取物進行硅膠柱層析,以二氯甲烷/甲醇/水(V/V/V=15∶1∶0、10∶1∶0.1、7∶1∶0.1、5∶1∶0.2、3∶1∶0.2、2∶1∶0.3、1∶1∶0.2)進行梯度洗脫,分成A～G七個組分。取E組分以甲醇-水(20%→100%)進行反相硅膠柱層析,再將30%甲醇洗脫液經正相硅膠柱層析(以二氯甲烷-甲醇體系沖洗)進行梯度洗脫得到20個流分(E1-E20),E5、E9、E11、E12、E13、E18、E20再經過凝膠柱(甲醇沖洗)。E5組分利用半制備液相色譜(甲醇∶水= 30∶70,8.0 mL/min),分離純化得到化合物5(5.0 mg,tR=22.0 min);E9組分利用半制備液相色譜(甲醇∶水= 15∶85,8.0 mL/min),分離純化得到化合物10(38.6 mg,tR=5.0 min);E11組分利用半制備液相色譜(甲醇∶水= 25∶75,8.0 mL/min),分離純化得到化合物8(28.6 mg,tR=11.0 min);E12組分利用半制備液相色譜(甲醇∶水= 30∶70,8.0 mL/min),分離純化得到化合物6(2.1 mg,tR=20.0 min)、7(1.7 mg,tR=18.0 min);E13組分利用半制備液相色譜(甲醇∶水= 15∶85,8.0 mL/min),分離純化得到化合物9(9.7 mg,tR=5.0 min)、12(7.3 mg,tR=7.0 min)、13(3.6 mg,tR=7.0 min);E18和E20組分利用半制備液相色譜(甲醇∶水= 15∶85,8.0 mL/min),分別分離純化得到化合物14(11.5 mg,tR=7.0 min)和11(14.2 mg,tR=5.0 min)。

2 結果與分析

化合物1白色粉末,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z235.101 7 [M-H]-(calcd for 235.100 4,C10H19O4S),分子式為C10H20O4S,不飽和度為1;1H NMR和HSQC譜顯示雙鍵的2個CH質子信號分別為δH5.43和δH5.41,在低場處含有1個連氧次甲基CH2質子信號δH3.99,1個甲基CH3質子信號δH0.90;13C NMR和HSQC譜提示10個碳信號,包括雙鍵碳信號(δC132.0和131.2),一個甲基碳信號(δC14.4),7個亞甲基碳信號(δC69.1,33.5,33.3,33.2,30.0,27.0,23.4)(見表1);在HMBC中(見圖1),發現δH3.99(H-1)與δC27.0(C-3)有遠程相關信號,δH0.90(H-10)與δC33.3(C-8)有遠程相關信號,δH1.47(H-3)與δC69.1(C-1),131.2(C-5)有遠程相關信號,δH1.33(H-8,H-9)與33.5(C-7)有遠程相關信號,δH1.99(H-7)與δC23.4(C-9),131.2(C-5)有遠程相關信號,δH5.43(H-5)與δC33.2(C-4),33.5(C-7)有遠程相關信號,δH5.41(H-6)與δC33.2(C-4),33.5(C-7)有遠程相關信號。在1H-1H COSY譜中(見圖1),δH3.99/1.66,δH1.66/1.47,δH1.47/2.02,δH1.99/5.41,δH2.02/5.43,δH0.90/1.33,δH1.33/1.99有相關信號,確定C-1至C-10的連接順序。雙鍵的2個CH質子信號的耦合常數(J)為15.1 Hz,由此確定雙鍵為E構型。綜上所述,確定化合物1結構為(E)-dec-5-en-1-yl sulfate。通過SciFinder、Reaxys和中國知網數據庫對該結構進行檢索,結果顯示化合物1為新化合物?；衔?的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1的1H-1H COSY與HMBC的關鍵信號

化合物2白色粉末,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z235.101 6 [M-H]-(calcd for 235.100 4,C10H19O4S),分子式為C10H20O4S;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.37(1H,dd,J=10.1,5.3 Hz,H-6),5.36(1H,dd,J=10.1,5.3 Hz,H-5),3.99(2H,t,J=6.5 Hz,H-1),2.08(2H,m,H-4),2.06(2H,m,H-7),1.67(2H,m,H-2),1.46(2H,m,H-3),1.33(4H,m,H-8/H-9),0.91(3H,t,J=7.1 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:69.1(t,C-1),30.2(t,C-2),27.2(t,C-3),27.9(t,C-4),130.6(d,C-5),131.4(d,C-6),28.0(t,C-7),33.3(t,C-8),23.5(t,C-9),14.5(q,C-10)。對比分析化合物1和化合物2雙鍵質子信號的耦合常數及C-4和C-7的化學位移的差異,進一步確認化合物2的雙鍵為Z構型,且以上數據與文獻[9]報道一致,故鑒定化合物2為(Z)-dec-5-en-1-yl sulfate。

化合物3白色粉末,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z223.101 9 [M-H]-(calcd for 223.100 4,C9H19O4S),分子式為C9H20O4S;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.99(2H,J=6.6 Hz,H-1),1.66(2H,tt,J=13.1,6.7 Hz,H-4),1.53(1H,dt,J=13.3,6.7 Hz,H-7),1.40(2H,m,H-3),1.32(2H,m,H-5),1.32(2H,m,H-8,H-2),1.19(2H,m,H-6),0.88(6H,d,J=6.6 Hz,H-8/H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:69.3(t,C-1),30.8(t,C-2),27.1(t,C-3),30.6(t,C-4),28.6(t,C-5),40.3(t,C-6),29.3(d,C-7),23.2(q,C-8/C-9)。以上數據與文獻[10]報道一致,故鑒定化合物3為7-methyloctyl sulfate。

化合物4白色粉末,溶于甲醇;+1.5(c0.39,MeOH),(-)-HR-ESI-MS:m/z223.101 5 [M-H]-(calcd for 223.100 4,C9H19O4S),分子式為C9H20O4S;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.87(1H,dd,J=9.4,5.8 Hz,H-1a),3.78(1H,dd,J=9.4,6.7 Hz,H-1b),1.78(1H,m,H-2),1.55(1H,m,H-6),1.42(1H,m,H-3a),1.35(2H,m,H-4),1.18(2H,m,H-5),1.13(1H,m,H-3b),0.96(3H,d,J=6.7 Hz,H-8),0.89(3H,d,J=1.0 Hz,H-7/H-9),0.88(3H,d,J=1.0 Hz,H-7/H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:74.0(t,C-1),34.5(d,C-2),34.7(t,C-3),25.9(t,C-4),40.5(t,C-5),29.3(d,C-6),23.2(q,C-7/C-9),23.1(q,C-7/C-9),17.3(q,C-8)。對比文獻[11]報道數據發現該化合物為S構型,故鑒定化合物4為(S)-2,6-dimethylheptyl sulfate。

化合物5油狀液體,易溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z236.093 8 [M-H]-(calcd for 236.092 3,C12H14O4N),分子式為C12H15O4N;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.27(2H,m,H-3,H-5),7.22(2H,m,H-4),7.21(2H,m,H-2,H-6),4.70(1H,dd,J=7.7,5.2 Hz,H-8),4.06(1H,q,J=6.8 Hz,H-11),3.24(1H,dd,J=13.9,5.1 Hz,H-7a),3.07(1H,dd,J=13.9,7.8 Hz,H-7b),1.21(3H,d,J=6.8 Hz,H-12);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:138.1(s,C-1),130.6(d,C-2,C-6),129.6(d,C-3,C-5),128.0(d,C-4),38.5(t,C-7),54.2(d,C-8),174.5(s,C-9),177.5(s,C-10),69.1(d,C-11),21.2(q,C-12)。以上數據與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物5為N-lactoyl-phenylalanine。

化合物6白色粉末,易溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z231.113 3 [M + H]+(calcd for 231.113 4,C13H15O2N2),分子式為C13H14O2N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.48(1H,d,J=7.9 Hz,H-5),7.34(1H,d,J=8.1 Hz,H-8),7.14(1H,td,J=7.1,0.9 Hz,H-7),7.05(1H,t,J=7.5 Hz,H-6),4.71(1H,q,J=6.6 Hz,H-1),3.97(1H,dd,J=12.1,5.1 Hz,H-3),3.45(1H,m,H-4a),3.03(1H,m,H-4b),1.75(3H,d,J=6.8 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:51.3(d,C-1),59.9(d,C-3),24.5(t,C-4),119.3(d,C-5),120.7(d,C-6),123.5(d,C-7),112.4(d,C-8),17.3(d,C-10),108.0(s,C-4a),127.6(s,C-4b),138.8(s,C-8a),131.5(s,C-9a),173.8(s,COOH),以上數據與文獻[13]報道基本一致,鑒定化合物6為(1S,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物7白色粉末,易溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z231.113 3 [M + H]+(calcd for 231.113 4,C13H15O2N2),分子式為C13H14O2N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.48(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),7.32(1H,d,J=8.1 Hz,H-8),7.13(1H,m,H-7),7.04(1H,dd,J=11.0,3.9 Hz,H-6),4.89(1H,m,H-1),4.12(1H,dd,J=8.8,5.6 Hz,H-3),3.37(1H,dd,J= 16.4,5.6 Hz,H-4a),3.16(1H,dd,J=16.0,8.6 Hz,H-4b),1.71(3H,d,J=6.9 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:49.1(d,C-1),54.9(d,C-3),24.0(t,C-4),119.3(d,C-5),120.6(d,C-6),123.5(d,C-7),112.3(d,C-8),18.7(d,C-10),106.7(s,C-4a),127.6(s,C-4b),138.6(s,C-8a),131.6(s,C-9a),173.7(s,COOH)。結合文獻[14]報道數據,故鑒定化合物7為(1R,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物8白色粉末,易溶于甲醇;(14.7(c0.36,MeOH),(-)-HR-ESI-MS:m/z164.072 0 [M-H]-(calcd for 164.071 2,C9H10O2N),分子式為C9H11O2N;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.31(5H,m,H-2,3,4,5,6),3.84(1H,dd,J=8.8,4.3 Hz,H-8),3.34(1H,m,H-7a),3.02(1H,dd,J=14.5,9.0 Hz,H-7b);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:137.4(s,C-1),130.6(d,C-2,C-6),130.1(d,C-3,C-5),128.6(d,C-4),38.4(t,C-7),57.7(d,C-8),173.9(s,COOH)。以上數據和文獻[15]報道一致,故鑒定化合物8為L-phenylalanine。

化合物9白色粉末,易溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z138.091 9 [M + H]+(calcd for 138.091 9,C8H12ON),分子式為C8H11ON;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.77(2H,d,J=8.5 Hz,H-3,5),3.11(2H,t,J=7.5 Hz,H-8),2.87(2H,t,J=8.2 Hz,H-7);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:128.6(s,C-1),131.0(d,C-2,C-6),116.8(d,C-3,C-5),157.8(s,C-4),33.9(t,C-7),42.4(t,C-8)。以上數據與文獻[16]報道基本一致,故鑒定化合物9為tyramine。

化合物10白色結晶,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z159.093 0 [M-H]-(calcd for 159.092 2,C10H11N2),分子式為C10H12N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J=7.9 Hz,H-4),7.38(1H,d,J= 8.1 Hz,H-7),7.19(1H,s,H-2),7.12(1H,m,H-6),7.04(1H,m,H-5),3.23(2H,t,J=7.2 Hz,H-9),3.13(2H,t,J=7.3 Hz,H-8);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:124.5(d,C-2),110.4(d,C-3),119.0(d,C-4),120.1(d,C-5),122.8(d,C-6),112.7(d,C-7),24.6(t,C-8),41.9(t,C-9),128.3(s,C-3a),138.4(s,C-7a)。以上數據和文獻[17]報道基本一致,故鑒定化合物10為tryptamine。

化合物12白色粉末,溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z175.087 0 [M + H]+(calcd for 175.087 1,C10H11ON2),分子式為C10H10ON2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:8.27(1H,s,H-2),8.23(1H,m,H-4),7.49(1H,dd,J=7.0,1.1 Hz,H-7),7.26(2H,tt,J=7.2,5.9 Hz,H-5,H-6),4.44(1H,s,H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:135.2(d,C-2),115.1(s,C-3),124.9(d,C-4),122.7(d,C-5),123.8(d,C-6),113.3(d,C-7),187.2(s,C-8),45.5(t,C-9),126.8(s,C-3a),138.5(s,C-7a)。以上數據與文獻[18]報道基本一致,故鑒定化合物12為8-oxo-tryptamine。

化合物13白色粉末,溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z193.097 9 [M + H]+(calcd for 193.097 7,C10H13O2N2),分子式為C10H12O2N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.38(1H,dd,J=7.4,0.6 Hz,H-4),7.29(1H,td,J=7.7,1.2 Hz,H-6),7.09(1H,td,J=7.6,0.9 Hz,H-5),6.92(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),3.32(1H,m,H-8a),3.20(1H,m,H-8b),2.26(1H,dt,J=14.4,7.2 Hz,H-9a),2.03(1H,ddd,J=14.4,7.3,6.2 Hz,H-9b);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:181.6(s,C-2),76.1(s,C-3),125.0(d,C-4),124.2(d,C-5),133.0(d,C-6),111.7(d,C-7),35.9(t,C-8),36.6(t,C-9),131.2(d,C-3a),142.4(s,C-7a)。文獻[19]報道該化合物在200-500 nm之間沒有CD吸收峰,因此無法確定構型。以上數據和文獻[19]報道基本一致,故鑒定化合物13為3-(2-aminoethyl)-3-hydroxyindolin-2-one。

化合物14白色粉末,溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z169.076 3 [M + H]+(calcd for 169.076 6,C11H9N2),分子式為C11H8N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:8.84(1H,s,H-1),8.31(1H,d,J=3.9 Hz,H-3),8.22(1H,d,J=7.9 Hz,H-5),8.18(1H,d,J=5.3 Hz,H-4),7.60(2H,d,J=3.7 Hz,H-7,8),7.30(1H,dt,J=8.0,4.0 Hz,H-6);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:133.3(s,C-1),137.4(d,C-3),116.6(d,C-4),123.1(d,C-5),121.3(d,C-6),130.4(d,C-7),113.1(d,C-8),131.3(s,C-4a),122.2(s,C-4b),143.3(s,C-8a),137.4(s,C-9a)。以上數據和文獻[20]報道基本一致,故鑒定化合物14為β-carboline。

化合物1～14的結構見圖2。

圖2 化合物1～14的化學結構

3 結論

從仿刺參內臟中分離得到14個單體化合物,化合物1為新化合物,化合物1和2互為順反異構體,同屬硫酸酯化烯烴,化合物3和4為硫酸酯化烷烴。硫酸酯類化合物是海洋棘皮動物產生的重要次級代謝產物,目前,已有文獻報道從海星、海參、海綿、海蛇尾、海膽等海洋動物中分離得到系列硫酸酯取代的烴類化合物,對硫酸酯化烴類分子的活性研究表明該類分子具有抗菌活性、抗真菌活性、細胞毒性和抑制基質金屬蛋白酶2的作用[14]?；衔?是一種由乳酸和苯丙氨酸組成的二肽類化合物,是一種新型的“運動因子”,是人在運動期間產生的代謝產物,可以降低肥胖小鼠的體重和脂肪組織的含量[12]?；衔?～14為含氮化合物。該研究成果深化了仿刺參化學成分的認識,為深入開發仿刺參內臟保健及藥用價值提供參考。