蟬蛻中甲殼素的提取工藝優化及其抗氧化活性和止血效果評價

雷雨潔,程菁菁,湯 成,孟 燕

湖北中醫藥大學藥學院,武漢 430000

甲殼素又稱殼多糖,它是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖單元通過β-1,4-糖苷鍵連接的線性大分子生物多糖[1],半透明片狀固體,由于多糖鏈間氫鍵相連,導致甲殼素不溶于水、稀酸、稀堿或一般有機溶劑。甲殼素廣泛存在于海洋及陸地上的低等節肢動物、昆蟲外殼及某些藻類、菌類的細胞壁中,其提取方法有酸堿法、酶水解法、EDTA法、微生物發酵法、離子液體法[2-5]等。甲殼素具有抗氧化、止血、抑菌[6]、抗腫瘤[7]、降血糖[8]、降血壓、降血脂[9]、免疫調節[10]等生物活性,憑借其無毒、良好的生物相容性和生物降解性以及酶降解能力[11],被廣泛應用于藥物輸送、組織工程、傷口愈合和癌癥治療等生物醫學領域[12-14]。

蟬蛻(Periostracum Cicadae),為蟬科昆蟲黑蚱羽化后的蛻殼,化學成分主要含有甲殼素、蛋白質、無機鹽、氨基酸、微量元素等[15],其作為我國常用中藥材,具有疏散風熱、利咽、透疹、解痙、明目退翳的功效[16]。有研究表明,蟬蛻作為甲殼素的一種替代來源,其甲殼素具有較低的乙?；?、結晶度、熱性能以及其良好的生態安全性[17],但由于蟬蛻價格昂貴并且甲殼素品質沒有固定的標準,目前關于蟬蛻甲殼素的研究進展緩慢。本研究通過超聲輔助傳統酸堿法提取蟬蛻中甲殼素,縮短了提取周期,并采用單因素和正交試驗對提取工藝進行了優化,還對提取物的抗氧化活性和止血效果進行了測定,對推進蟬蛻甲殼素的相關研究、應用具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟬蛻(批號:220601,湖北楚欣藥業有限公司);鹽酸(批號:20220524,國藥集團化學試劑有限公司);氫氧化鈉(批號:20150310,國藥集團化學試劑有限公司);磷酸(批號:20201207,國藥集團化學試劑有限公司);高錳酸鉀(批號:20180504,國藥集團化學試劑有限公司);亞硫酸氫鈉(批號:20220110,國藥集團化學試劑有限公司);DPPH自由基(批號:1898-66-4,國藥集團化學試劑有限公司);過硫酸鉀(批號:20221019,國藥集團化學試劑有限公司);無水乙醇(批號:20221223,國藥集團化學試劑有限公司);ABTS自由基(批號:30931-67-0,上海阿拉丁試劑有限公司);焦性沒食子酸(批號:H2018158,上海阿拉丁試劑有限公司);牛血清白蛋白(批號:220220,上海如吉生物科技發展有限公司);考馬斯亮藍G-250(批號:HW20G1701-1,北京華威銳科化工有限公司);β-環糊精(批號:CQZ336,畢得醫藥);Tris-HCl(PH=8.2)緩沖溶液(批號:202304080,博爾森生物醫藥科技有限公司);云南白藥(批號:ZAA2209,云南白藥股份集團有限公司)。

冷凍干燥器(CTFD-10PT,青島永合創信電子科技有限公司);馬弗爐(SX-10-12,天津市泰斯特儀器有限公司);紫外可見分光光度計(UV-2550,島津企業管理(中國)有限公司);色差儀(CR-410,日本柯尼卡美能達有限公司)。

1.2 動物

KM小鼠(SPF),體重25～30 g,雌性,遼寧長生生物技術股份有限公司,動物許可證號SYXK(鄂)2021-0089,獲湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準(批準號HUCMS202205003)。

日本大耳白兔(SPF),體重2～3 kg,雌性,湖北逸摯誠生物科技有限公司,動物許可證號SCXK(鄂)2021-0020,獲湖北省疾病預防控制中心實驗動物管理與使用委員會的批準(批準號20232-40115)。

所有動物在適宜的環境中飼喂(自然采光,溫度為22±2 ℃),適應一周后開始實驗。

1.3 方法

1.3.1 藥材預處理

將蟬蛻除泥沙,洗凈,反復用水沖洗后烘干、磨碎、過篩。

1.3.2 單因素實驗

1.3.2.1 鹽酸脫除無機鹽的單因素實驗

用鹽酸進行脫鈣處理,分別以鹽酸質量分數濃度、料液比、超聲時間、超聲功率為因素,以經鹽酸處理后的蟬蛻干粉中灰分含量為指標進行單因素實驗。鹽酸質量分數分別采用3%、5%、8%、10%、12%,料液比分別采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,超聲時間分別采用30、60、90、120、150 min,超聲功率分別采用80 、120 、160 、200 、240 W,探討鹽酸質量分數濃度、料液比、超聲時間、超聲功率4個因素對鹽酸脫除無機鹽的影響。

采用干法灰化法測定灰分含量[18],按公式(1)計算灰分含量。

(1)

式中:M1、M2及M3分別為灼燒至恒重時的坩堝質量,坩堝與樣品的總質量,坩堝與灰分的總質量。

1.3.2.2 氫氧化鈉脫除蛋白質的單因素實驗

根據文獻報道中的方法制得脫鈣之后的蟬蛻干粉。

用氫氧化鈉溶液進行脫蛋白,分別以氫氧化鈉質量分數濃度、料液比、超聲時間、溫度、超聲功率為因素,以脫蛋白率為指標進行單因素實驗。氫氧化鈉質量分數分別采用4%、6%、8%、10%、12%,氫氧化鈉溶液溶解時料液比分別采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,超聲時間分別采用30、60、90、120、150 min,氫氧化鈉溶液堿浸溫度分別采用40、50、60、70、80 ℃,超聲功率分別采用80、120、160、200、240 W,探討氫氧化鈉質量分數濃度、料液比、超聲時間、溫度、超聲功率5個因素對氫氧化鈉脫除蛋白質的影響。

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[19],按公式(2)粗略地評價脫蛋白率。

(2)

式中:P總為反復脫蛋白后濾液中蛋白含量,P為每組實驗脫掉的總蛋白。

1.3.3 正交實驗

1.3.3.1 鹽酸脫除無機鹽的正交實驗設計

選擇鹽酸質量分數濃度、鹽酸溶液溶解時料液比、超聲時間、超聲功率4個因素為考察對象,在單因素實驗得到的最適值兩端再各取1個水平,采用四因素三水平正交設計對工藝條件進行優化,因素及水平設置見表1。固定超聲溫度為25 ℃。實驗重復3次。

表1 鹽酸脫除無機鹽因素水平

1.3.3.2 氫氧化鈉脫除蛋白質的正交實驗設計

通過單因素實驗,不同超聲功率下實驗結果無顯著性差異,選擇氫氧化鈉質量分數濃度、氫氧化鈉溶液溶解時料液比、超聲時間、氫氧化鈉溶液堿浸溫度4個因素為考察對象,在單因素實驗得到的最適值兩端再各取1個水平,采用四因素三水平正交設計對工藝條件進行優化,因素及水平設置見表2。固定超聲功率為120 W。實驗重復3次。

表2 氫氧化鈉脫除蛋白質因素水平

1.3.3.3 高錳酸鉀和亞硫酸氫鈉脫色素的正交實驗設計

選擇高錳酸鉀質量分數濃度、亞硫酸氫鈉質量分數濃度、脫色時間、脫色溫度4個因素為考察對象,根據文獻報道中的最適3個因素,采用四因素三水平正交設計對工藝條件進行優化,因素及水平設置見表3。實驗重復3次。

表3 高錳酸鉀和亞硫酸氫鈉脫色素因素水平

利用色差儀測定干燥后的樣品的白度[20],按公式(3)計算樣品白度(WH)。

(3)

1.3.4 蟬蛻甲殼素的抗氧化活性分析

根據文獻報道的方法以甲殼素混懸液研究其抗氧化活性。蟬蛻甲殼素混懸劑的制備:將干燥的蟬蛻甲殼素置于燒杯中,量取適量的1%β-環糊精溶液,密封,40 ℃超聲50 min。

1.3.4.1 ABTS自由基清除能力測定

將濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合,室溫避光放置16～24 h,即儲存液,用水稀釋,制得在734 nm處吸光度為0.70±0.02的工作液備用。將提取物稀釋成適宜濃度梯度的溶液,將1 mL待測樣品溶液和9 mLABTS工作液混合,避光反應6 min,在734 nm波長下測定吸光度,每個樣品和對照均重復測定3次[21]。按公式(4)計算ABTS自由基清除率。

(4)

式中:A0為樣品的溶劑與ABTS工作液的混合溶液的吸光度;A1為ABTS工作液與不同濃度樣品混合溶液的吸光度;A2為不同濃度樣品和ABTS的溶劑的吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測定

DPPH溶液的配制(現配現用):準確稱取19.7 mg DPPH,用無水乙醇定容于250 mL容量瓶中,得到0.2 mmol/L的DPPH溶液。將提取物稀釋成適宜濃度梯度的溶液,將2 mL待測樣品溶液和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液渦旋混合后,避光反應30 min,在517 nm波長下測定吸光度[22],每個樣品和對照均重復測定3次。按公式(5)計算DPPH自由基清除率。

(5)

式中:A0為樣品的溶劑與DPPH溶液的混合溶液的吸光度;A1為DPPH溶液與不同濃度樣品混合溶液的吸光度;A2為不同濃度樣品和DPPH的溶劑的吸光度。

(6)

式中:A1為不同濃度樣品與混合溶液的吸光度;A2為樣品的空白溶劑與混合溶液的吸光度;A0為鄰苯三酚溶液的溶劑與混合溶液的吸光度。

1.3.5 蟬蛻甲殼素的體外和體內的止血活性分析

1.3.5.1 體外促凝血活性

用試管法測定甲殼素的體外促凝血活性。取潔凈的試管,分別加入160、80、40、20、10 mg的甲殼素粉末,空白試管作陰性對照,80 mg云南白藥粉末作陽性對照,每樣品設三支試管。使粉末盡量鋪開于試管底部,37 ℃水保溫1 h,用肝素抗凝管自兔耳緣靜脈取血開始計時,依次將1 mL新鮮抗凝兔血加入樣品試管中,平穩地移至37 ℃水浴中,每隔30 s將第一支試管傾斜一次(角度小于30°),其余暫時不動,直至第一支試管緩慢倒置血液不流動為止,以同樣方法觀察其余管內的血全凝后,記下該組凝血時間。凝血時間以60 min為上限,超過即判為不凝血[24]。每樣品重復試驗3次。

1.3.5.2 體表止血活性

用斷尾法測定甲殼素對體表創口的出血時間和出血量的影響。小鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉,給藥容量為5 μL/g體重,待麻醉效果完全后,尾部擦拭碘伏消毒于小鼠尾尖0.5 cm處橫向切斷,血液自動流出第一滴后用濾紙吸去,將出血尾尖分別與10、20、40、80 mg甲殼素粉末與40 mg云南白藥粉末充分接觸,每隔30 s用預先稱量好的濾紙吸去滲出血液,至出血完全停止作為出血時間。稱量吸取血液的濾紙,減去原重記為出血量[25]。每樣品重復3 只小鼠,40 mg云南白藥粉末為陽性對照,對創口不作處理的為陰性對照。每樣品重復試驗3次。

1.3.5.3 體內止血活性

小鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉,給藥濃度為5 μL/g體重,待麻醉效果完全后,用脫毛膏去除術區毛發并用碘伏消毒,隨后用酒精進行脫碘處理。待小鼠完全處于麻醉狀態后,仰臥固定,腹中部作約2 cm縱行切口,清理腹腔液,將濾紙墊置于充分顯露的小鼠肝臟下,在肝中部快速用手術刀制造約1.0 cm×1.0 cm的滲血創口,待傷口出血時開始計時。敷上10、20、40、80 mg甲殼素粉末、40 mg淀粉粉末(陰性對照)及40 mg云南白藥粉末(陽性對照),每隔30 s用濾紙片輕輕擦拭傷口處,直至其不再出血為止,記錄停止出血的時間[26]。小鼠肝創口出血的時間即為小鼠從開始出血到停止出血的時間間隔。每樣品重復試驗3次。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 鹽酸脫除無機鹽的單因素實驗

2.1.1.1 鹽酸質量分數濃度的確定

不同質量分數濃度鹽酸溶液處理后的灰分含量如圖1所示,鹽酸質量分數濃度為8%時,灰分含量低至2.46%。由單因素方差分析結果可知,鹽酸質量分數濃度為8%、10%、12%與鹽酸質量分數濃度為3%有顯著差異。隨著鹽酸質量分數濃度的增加,灰分含量降低,無機鹽的脫除效果顯著。當鹽酸質量分數濃度高于8%后,灰分含量減少相對較小并趨于平緩。選擇鹽酸質量分數濃度為8%、10%、12%三個水平進行正交實驗。

圖1 不同質量分數濃度鹽酸溶液處理后的灰分含量

2.1.1.2 料液比的確定

鹽酸溶液脫鈣時不同料液比處理后的灰分含量如圖2所示,當料液比為1∶25時,灰分含量低至2.00%。由單因素方差分析結果可知,料液比為1∶20、1∶25、1∶30與料液比為1∶10有顯著差異。隨著鹽酸溶液溶解時料液比的增加,灰分含量降低,無機鹽的脫除效果顯著。當鹽酸溶液溶解時料液比高于1∶20后,灰分含量減少相對較小并趨于平緩。選擇料液比為1∶20、1∶25、1∶30三個水平進行正交實驗。

圖2 鹽酸溶液溶解時不同料液比處理后的灰分含量

2.1.1.3 超聲時間的確定

鹽酸溶液脫鈣時不同超聲時間處理后的灰分含量如圖3所示,當超時時間為150 min時,灰分含量低至1.50%。由單因素方差分析結果可知,超聲時間為150 min與超聲時間為30 min有顯著差異(P<0.05)。隨著超聲時間的增加,灰分含量降低,無機鹽的脫除效果顯著。當超聲時間大于120 min后,灰分含量減少相對較小并趨于平緩。選擇超聲時間90、120、150 min三個水平進行正交實驗。

圖3 不同超聲時間處理后的灰分含量

2.1.1.4 超聲功率的確定

鹽酸溶液脫鈣時不同超聲功率處理后的灰分含量如圖4所示,當超時功率為120 W時,灰分含量低至1.69%。由單因素方差分析結果可知,超聲功率為120、160、200、240 W與超聲功率為80 W均有顯著差異。隨著超聲功率的增加,灰分含量降低,無機鹽的脫除效果顯著。當超聲功率高于120 W后,灰分含量減少相對較小并趨于平緩。選擇超聲功率為120、160、200 W三個水平進行正交實驗。

圖4 不同超聲功率處理后的灰分含量

2.1.2 氫氧化鈉脫除蛋白質的單因素實驗

2.1.2.1 氫氧化鈉質量分數濃度的確定

不同質量分數濃度氫氧化鈉溶液的脫蛋白率如圖5所示,當氫氧化鈉質量分數濃度為6%、8%、10%、12%時,脫蛋白率都高達95%以上。隨著氫氧化鈉質量分數濃度的增加,脫蛋白率升高,但堿濃度越大,更易造成脫乙?；?。選擇氫氧化鈉質量分數濃度為6%、8%、10%三個水平進行正交實驗。

圖5 不同質量分數濃度氫氧化鈉溶液處理的脫蛋白率

2.1.2.2 氫氧化鈉溶液溶解時料液比的確定

氫氧化鈉溶液脫蛋白時不同料液比處理后的脫蛋白率如圖6所示,當料液比為1∶20、1∶25、1∶30時,脫蛋白率都高達95%以上。隨著料液比的增加,脫蛋白的效果也越顯著。當料液比高于1∶20后,脫蛋白率的增大趨于平緩。選擇料液比為1∶20、1∶25、1∶30三個水平進行正交實驗。

圖6 氫氧化鈉溶液溶解時不同料液比處理的脫蛋白率

2.1.2.3 超聲時間的確定

氫氧化鈉溶液脫蛋白時不同超聲時間處理后的脫蛋白率如圖7所示,當超聲時間為60、90、120、150 min時,脫蛋白率都高達95%以上。當超聲時間大于60 min后,脫蛋白率的增大趨于平緩。選擇料液比為60、90、120 min三個水平進行正交實驗。

2.1.2.4 氫氧化鈉溶液堿浸溫度的確定

氫氧化鈉溶液脫蛋白時不同堿浸溫度處理后的脫蛋白率如圖8所示,當堿浸溫度為60、70、80 ℃時,脫蛋白率都高達95%以上。由單因素方差分析結果可知,堿浸溫度為60、70、80 ℃與堿浸溫度為40 ℃有顯著差異。選擇堿浸溫度為60、70、80 ℃三個水平進行正交實驗。

2.1.2.5 超聲功率的確定

氫氧化鈉溶液脫蛋白時不同超聲功率處理后的脫蛋白率如圖9所示,由單因素方差分析結果可知,各組組間都無顯著差異。

圖9 不同超聲功率處理的脫蛋白率

2.2 正交實驗

2.2.1 鹽酸脫除無機鹽的正交實驗

由表4可知,四種影響蟬蛻脫無機鹽效果的因素順序為:C、D、B、A,超聲時間對脫除無機鹽效果影響最大,超聲功率次之,鹽酸質量分數濃度影響最小。通過對正交實驗結果的分析,可以得出最優脫鈣條件是A1B2C3D2,即:HCl質量分數濃度為8%、固液比為1∶25、超聲時間為150 min、超聲功率為160 W。

表4 鹽酸脫除無機鹽的正交實驗方案與結果

2.2.2 氫氧化鈉脫除蛋白質的正交實驗

由表5可知,四種影響蟬蛻脫蛋白效果的因素順序為:C、A、D、B,超聲時間對脫除蛋白效果影響最大,氫氧化鈉質量分數濃度次之,料液比影響最小。

表5 氫氧化鈉脫除蛋白質的正交實驗方案與結果

通過對正交實驗結果的分析,可以得出最優脫鈣條件是A3B2C2D1,即:NaOH質量分數濃度為10%、固液比為1∶25、超聲時間為90 min、堿浸溫度為60 ℃。

2.2.3 高錳酸鉀和亞硫酸氫鈉脫色素的正交實驗

由表6可知,四種影響脫色素效果的因素順序為:A、C、D、B,高錳酸鉀質量分數濃度對脫除色素效果影響最大,脫色時間次之,亞硫酸氫鈉質量分數濃度影響最小。通過對正交實驗結果的分析,可以得出最優脫鈣條件是A3B2C1D2,即:KMnO4質量分數濃度為5%、NaHSO3質量分數濃度為8%、脫色時間組合為60+90 min、脫色溫度為90 ℃。

表6 高錳酸鉀和亞硫酸氫鈉脫色素的正交實驗方案與結果

2.3 蟬蛻甲殼素的抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除能力

當蟬蛻甲殼素混懸液濃度為18 mg/mL時,ABTS自由基的清除率為91.31%(見圖10),表現出較強的自由基清除能力。

圖10 蟬蛻甲殼素對ABTS自由基清除能力

2.3.2 DPPH自由基清除能力

當蟬蛻甲殼素混懸液濃度為15 mg/mL時,DPPH自由基的清除率為35.19%(見圖11)。

圖11 蟬蛻甲殼素對DPPH自由基清除能力

圖12 蟬蛻甲殼素對自由基清除能力

2.4 蟬蛻甲殼素的體外和體內的止血活性

2.4.1 體外促凝血活性

如圖13所示,不同劑量的蟬蛻甲殼素粉末均有一定的體外促凝血能力,且其活性隨劑量的增大而升高,樣品的促凝血活性呈現一定的劑量相關性,而空白組的抗凝兔血在60 min內完全不凝,與空白對照組相比,40、80、160 mg蟬蛻甲殼素的凝血時間極顯著地縮短,同時,與陽性對照組相比,80、160 mg蟬蛻甲殼素的凝血時間極顯著地縮短。甲殼素體外促凝血能力優于云南白藥粉末。

圖13 兔血凝固時間

2.4.2 體表止血活性

如圖14、15所示:在小鼠斷尾實驗中,各劑量的蟬蛻甲殼素粉末及云南白藥粉末陽性對照與空白對照組相比均可顯著縮短出血時間,且樣品的止血活性呈現一定的劑量相關性。10、20、40、80 mg蟬蛻甲殼素可以將鼠尾出血時間縮短31.7%、70.2%、81.5%和83.8%,40 mg云南白藥陽性對照可將鼠尾的出血時間縮短49.7%;10、20、40、80 mg蟬蛻甲殼素可以將鼠尾出血量降低35.7%、35.7%、49.0%和56.1%,40 mg云南白藥陽性對照可將鼠尾出血量降低41.8%。同時,相同劑量的蟬蛻甲殼素粉末與云南白藥粉末相比,蟬蛻甲殼素的出血時間以及出血量都有顯著差異,說明蟬蛻甲殼素止血能力優于云南白藥粉末。

圖14 鼠尾出血時間

圖15 鼠尾出血量

2.4.3 體內止血活性

如圖16所示:蟬蛻甲殼素可顯著縮短肝創口的出血時間,10、20、40、80 mg蟬蛻甲殼素對肝創口的出血時間分別縮短37.4%、42.9%、70.2%和77.2%,40 mg云南白藥陽性對照可將肝創口的出血時間縮短49.6%,相同劑量的蟬蛻甲殼素數據更優于云南白藥陽性對照,說明蟬蛻甲殼素對體內含血量較豐富的臟器的出血性創口有較好的止血作用。

圖16 肝臟出血時間

3 討論與結論

通過單因素試驗結合正交試驗得到超聲輔助酸堿提取蟬蛻中甲殼素的最佳工藝參數為:脫鈣:質量分數:8%鹽酸,溫度:室溫,料液比:1∶25,超聲功率:160 W,超聲時間:150 min;脫蛋白:質量分數:10%氫氧化鈉,溫度:60 ℃,料液比:1∶25,超聲功率:無顯著差異,超聲時間:90 min;脫色:質量分數:5%高錳酸鉀、8%亞硫酸氫鈉,溫度:90 ℃,時間:高錳酸鉀反應60 min、亞硫酸氫鈉反應90 min。脫鈣和脫蛋白時以超聲輔助,增加溶劑的穿透力,有效地縮短了提取時間。

試管法測定不同劑量甲殼素粉末對兔血體外凝血時間結果表明:蟬蛻甲殼素粉末的體外促凝血能力隨蟬蛻甲殼素劑量的增大而增強,相同劑量的蟬蛻甲殼素粉末與云南白藥粉末相比,蟬蛻甲殼素體外促凝血能力顯著優于云南白藥粉末。斷尾法測定不同劑量蟬蛻甲殼素粉末對小鼠斷尾出血時間和出血量結果表明:各劑量的蟬蛻甲殼素粉末及云南白藥粉末陽性對照與空白對照組相比均可顯著縮短出血時間,相同劑量的蟬蛻甲殼素粉末與云南白藥粉末相比,甲殼素的出血時間以及出血量都有顯著差異,說明蟬蛻甲殼素止血能力優于云南白藥。建立小鼠肝臟出血模型,測定創口出血時間,結果表明:蟬蛻甲殼素可顯著縮短肝創口的出血時間,且相同劑量的蟬蛻甲殼素數據更優于云南白藥陽性對照,蟬蛻甲殼素對體內含血量較豐富的臟器如肝臟的出血創口有較好的促進血液凝固的作用,具有開發成手術切除部分臟器后創口止血材料的潛力。