魚腥草破壁飲片單次和重復給藥毒性試驗

雷夏凌,鄧雯,陳煒璇,戴錦龍,郭健敏,黃遠鏗,張前亮,成金樂,楊威

(1.廣州灣區生物醫藥研究院,廣東萊恩醫藥研究院有限公司,廣東省藥物非臨床評價研究企業重點實驗室,國家中藥現代化工程技術研究中心中藥非臨床評價分中心,廣東省創新藥物評價與研究工程技術研究中心,廣東 廣州 510990;2.中山市中智藥業集團有限公司,廣東 中山 528437;3.國家企業技術中心,廣東 中山 528437;4.中藥破壁飲片國家地方聯合工程研究中心,廣東 中山 528437)

在2017年10月,美國的權威醫學期刊《科學轉化醫學》發表了一篇論文,指出大部分馬兜鈴科的中草藥含有馬兜鈴酸(aristolochic acids,AAs),馬兜鈴酸不論劑量大小,都對腎臟造成不可逆的損傷[1],持續引發了業界對馬兜鈴酸是否引起腎毒性的激烈爭論。魚腥草非馬兜鈴科,但其含馬兜鈴酸在體內的代謝產物馬兜鈴內酰胺(aristololactam,AL)成分,馬兜鈴內酰胺作為馬兜鈴酸類似物(aristolochic acids)其安全性一直備受爭議。魚腥草為三白草科蕺菜草本植物的新鮮全草和地上干燥部分,揮發油、黃酮類、生物堿、多糖化合物為魚腥草的主要成分,其中生物堿類分離所得的馬兜鈴內酰胺有AⅡ、BⅡ、FⅠ、FⅡ,目前無相關報道證明魚腥草中含具有腎臟毒性成分的馬兜鈴酸Ⅰ、Ⅱ(AAⅠ、AAⅡ)和馬兜鈴內酰胺Ⅰ(ALⅠ)[2]。馬兜鈴酸的主要毒性表現為腎小管上皮細胞壞死及凋亡、腎小管功能障礙、腎間質纖維化[3-5];馬兜鈴酸在人體內代謝成馬兜鈴內酰胺,進而與DNA結合,損害腎臟纖維化導致尿路上皮癌,造成不可逆的腎損傷,但報道顯示有毒性的僅僅是馬兜鈴內酰胺AⅠ,多認為其馬兜鈴內酰胺AⅡ的腎毒性不明確[6-8]。腎臟機體功能完整性對整體的穩態極為重要,發生腎臟中毒后果可能很嚴重,但魚腥草的腎臟毒性的報道較少,因此亟須進行相關的研究。

新型飲片魚腥草破壁飲片經破壁技術處理,基本實現了對原飲片全成分的轉移[9],中藥材經破壁粉碎后,有效成分、無效成分的暴露水平增加,繼而可能存在不良反應增大的風險。鑒于目前對魚腥草的安全性及其所含馬兜鈴內酰胺類成分的腎毒性研究仍不夠充分,本研究通過對魚腥草破壁飲片進行單次和重復給藥毒性試驗研究,并針對馬兜鈴酸、馬兜鈴內酰胺AⅠ的腎毒性特征,檢測相關腎毒性標志物的表達水平,評論其非臨床安全性及與傳統丹參飲片的差異,以期為魚腥草破壁飲片臨床應用的安全性及魚腥草中馬兜鈴內酰胺類成分的腎毒性研究提供參考依據。

1 材料

1.1 藥物①單次給藥毒性試驗:魚腥草破壁飲片(批號:20180612)、魚腥草飲片(批號:201708P001);②重復給藥毒性試驗:魚腥草破壁飲片(批號:20180612)、魚腥草飲片(批號:20180601)。以上藥物均來源于相同批次原料,執行《廣東省中藥破壁飲片質量標準研究規范(試行)》,中山市中智藥業集團有限公司提供。

1.2 主要試劑①單次給藥毒性試驗:異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,批號:217171101);羧甲基纖維素鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:C1722096)。②重復給藥毒性試驗:異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,批號:217171101、217180101、217180501);羧甲基纖維素鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:E1804105);大鼠腎損傷分子1 ELISA檢測試劑盒(廣州開晨生物科技有限公司,批號:E20180901A、E20181001A、E20181201A);β2-微球蛋白檢測試劑盒(浙江伊利康生物技術有限公司,批號:180603);N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶試劑盒:(浙江伊利康生物技術有限公司,批號:180402);大鼠免疫球蛋白A ELISA檢測試劑盒(廣州開晨生物科技有限公司,批號:E20181001A);大鼠免疫球蛋白E ELISA檢測試劑盒(批號:E20181001A);大鼠免疫球蛋白G ELISA檢測試劑盒(廣州開晨生物科技有限公司,批號:E20180901A);大鼠免疫球蛋白M ELISA檢測試劑盒(廣州開晨生物科技有限公司,批號:E201810901A)。

1.3 實驗動物單次給藥毒性試驗SD大鼠60只,5～6周齡,體重180～220 g;重復給藥毒性試驗SD大鼠200只,6～8周齡,體重180～240 g;以上動物為SPF級,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(湘)2016-0002;實驗動物飼養于SPF級動物房,所有環境技術指標均符合GB14925-2010屏障環境技術要求,實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2015-0146,本動物實驗經福利倫理委員會審查批準,倫理審查證書編號:IA-SE2018012-01、IA-SE2018048-02。

1.4 主要儀器SYSMEX XT-2000Ⅳ型全自動血液分析儀(日本SyIMex公司);Uritest-200B型尿液分析儀(桂林市醫療電子儀器廠);日立7180全自動生化分析儀(日本日立公司);ELx808酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);LEICA DM3000生物顯微鏡(德國LEICA公司)。

2 藥物制備與分析

2.1 藥物制備①魚腥草破壁飲片混懸液:稱取魚腥草破壁飲片,加入0.3% CMC-Na溶液至一定體積,倒入破壁草本料理機攪拌1 min,配成所需濃度的混懸藥液。②魚腥草飲片水煎液:稱取魚腥草飲片至全自動煎藥壺中,加水浸泡30 min,第一次武火煮沸,文火再煎煮30 min,過濾出第一次煎煮液;第二次在濾渣中加水,武火煮沸,文火再煎煮20 min,合并,配成所需濃度的魚腥草飲片溶液。

2.2 藥物分析情況以槲皮素為檢測成分,0.045～0.180 g·mL-1濃度范圍內的魚腥草破壁飲片混懸液和0.09～0.36 g·mL-1濃度范圍內的魚腥草飲片溶液,室溫條件下各時間點濃度測定值的RSD均小于3%,保存6 h基本穩定,魚腥草破壁飲片溶液和魚腥草飲片溶液配制系統合格。

3 方法

3.1 單次給藥毒性試驗試驗選用SD大鼠60只,按體重和性別均衡隨機分為3組,分別為陰性對照組、魚腥草破壁飲片組(7.2 g·kg-1、最大給藥劑量)、魚腥草飲片組(7.2 g·kg-1),每組20只動物,雌雄各半。各組均20 mL·kg-1灌胃給藥,魚腥草破壁飲片組1 d給藥2次,2次給藥時間至少間隔5 h;魚腥草飲片1 d內單次灌胃給藥。各組給藥后連續觀察至少4～6 h,以后每天觀察1次,持續觀察2周。進行動物臨床觀察內容:外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、排泄物性狀、飲食情況、中毒反應和死亡情況等[10]。

3.2 重復給藥毒性試驗試驗選用SD大鼠200只,分為陰性對照組、魚腥草破壁飲片高[5.40 g·(kg·d)-1,最大給藥劑量]、中[2.70 g·(kg·d)-1]、低[1.35 g·(kg·d)-1]劑量組、魚腥草飲片組[5.40 g·(kg·d)-1],50只/組,雌雄各半。陰性對照組、魚腥草破壁飲片高、中、低劑量組組均每天給藥2次,魚腥草飲片高、低劑量組組每天給藥1次,連續給藥3個月,恢復期4周。試驗期間,每天進行臨床觀察,每周測定1次動物體重和攝食量,在給藥中期、給藥結束、恢復期分別剖檢20、20、10只動物,進行血液學、凝血功能、血清生化學、病理學、免疫球蛋白、尿常規、生物標志物及病理學等各項檢查[11]。全自動生化分析儀檢測晨尿的谷氨酸脫氫酶(GLDH)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白;采用ELISA法檢測腎損傷分子1(Kim-1)。

4 結果

4.1 單次給藥毒性試驗試驗期間,魚腥草破壁飲片組、魚腥草飲片組、陰性對照品組動物均沒有出現死亡,大鼠的臨床觀察、攝食量、體重及病理大體解剖觀察均未見異常。

4.2 重復給藥毒性試驗

4.2.1 臨床觀察試驗期間,各劑量組及陰性對照組的外觀體征、行為活動、分泌物、對刺激的反應、呼吸、排泄物、中毒反應和死亡情況等均未見異常的改變。

4.2.2 攝食量與體重魚腥草破壁飲片高劑量組雄性動物在給藥期間攝食量普遍減少,但動物體重與陰性對照組比較無明顯差異,其他組別攝食量均未見異常;各劑量組及陰性對照組動物的體重均未發現與受試物相關的異常變化。

4.2.3 血液學及凝血功能在給藥末期,雌性動物方面,魚腥草飲片高劑量組的WBC有所升高,魚腥草破壁飲片高劑量組的PT有所延長,以上反應在正常變化范圍內,變化幅度小,無毒理學意義。各劑量組動物的血液學指標均未發現有毒理學意義的異常變化。

4.2.4 生化學各劑量組動物的腎功能指標血清尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、尿酸(UA)及其他生化學指標均未發現有毒理學意義的異常變化。

4.2.5 免疫球蛋白各劑量組動物的IgA、IgE、IgG、IgM均未發現異常改變。

4.2.6 臟器重量和系數各劑量組動物的各臟器重量和系數均在正常范圍內,結果見表1。

試驗時間組別臟器重量/g臟體系數(%)臟腦系數(%)肝臟腎臟肝臟腎臟肝臟腎臟雌性雄性陰性對照組7.522±0.8630.963±0.0822.447±0.1970.313±0.0153.713±0.4180.475±0.036魚腥草破壁飲片5.40 g·(kg·d)-1組7.403±0.5330.973±0.1002.372±0.1400.311±0.0203.782±0.2270.498±0.058魚腥草破壁飲片2.70 g·(kg·d)-1組7.045±0.6300.939±0.0912.453±0.1830.327±0.0253.536±0.2950.471±0.039魚腥草破壁飲片1.35 g·(kg·d)-1組7.762±0.9650.965±0.1382.548±0.2500.316±0.0333.854±0.4720.480±0.071魚腥草飲片5.40 g·(kg·d)-1組7.829±0.7491.016±0.0682.536±0.1190.330±0.0223.872±0.3650.503±0.038魚腥草飲片1.35 g·(kg·d)-1組7.842±0.6350.989±0.0792.536±0.2000.320±0.0263.801±0.2820.479±0.038陰性對照組12.663±1.5241.603±0.2162.405±0.1510.305±0.0316.185±0.5050.385±0.050魚腥草破壁飲片5.40 g·(kg·d)-1組11.758±1.3481.652±0.2432.258±0.148*0.318±0.0375.533±0.787*0.428±0.109魚腥草破壁飲片2.70 g·(kg·d)-1組12.869±1.3351.661±0.1662.319±0.1310.300±0.0206.094±0.6930.386±0.034魚腥草破壁飲片1.35 g·(kg·d)-1組12.353±1.1711.579±0.1812.369±0.1390.303±0.0315.996±0.6570.440±0.057*魚腥草飲片5.40 g·(kg·d)-1組12.963±1.3291.691±0.1982.412±0.1210.315±0.0316.160±0.5800.388±0.062魚腥草飲片1.35 g·(kg·d)-1組13.759±1.2961.703±0.1742.424±0.1380.301±0.0306.280±0.5990.387±0.054

4.2.7 尿酶、尿低分子蛋白、Kim-1全自動生化分析儀檢測晨尿的谷氨酸脫氫酶(GLDH)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白;采用ELISA法檢測Kim-1。給藥末期和恢復期,魚腥草破壁飲片及魚腥草破壁飲片各組GLDH、NAG、β2-MG、Kim-1均未見異常,給藥末期結果見表2。

性別組別NAG/U·L-1β2-MG/mg·L-1GLDH/ U·L-1Kim-1/pg·mL-1雌性雄性陰性對照組26.6±15.50.04±0.020.20±0.79155.748±7.689魚腥草破壁飲片5.40 g·(kg·d)-1組54.5±49.50.03±0.021.10±2.18159.816±5.017魚腥草破壁飲片2.70 g·(kg·d)-1組37.3±16.00.03±0.010.20±0.42158.151±5.846魚腥草破壁飲片1.35 g·(kg·d)-1組36.8±16.10.06±0.040.50±0.85164.714±9.211魚腥草飲片5.40 g·(kg·d)-1組38.3±15.10.03±0.020.50±0.53156.025±10.988魚腥草飲片1.35 g·(kg·d)-1組26.6±15.50.04±0.020.20±0.79170.724±27.193陰性對照組75.3±48.30.03±0.012.50±2.99163.698±15.670魚腥草破壁飲片5.40 g·(kg·d)-1組66.4±36.10.04±0.022.10±2.69175.068±10.150魚腥草破壁飲片2.70 g·(kg·d)-1組41.2±29.70.04±0.022.00±5.66175.623±23.380魚腥草破壁飲片1.35 g·(kg·d)-1組63.5±42.80.05±0.040.70±1.06173.681±21.479魚腥草飲片5.40 g·(kg·d)-1組76.5±42.90.03±0.022.20±3.65177.466±33.765魚腥草飲片1.35 g·(kg·d)-1組86.1±44.50.05±0.035.20±12.88177.657±22.101

4.2.7 尿常規給藥末期及恢復期,魚腥草破壁飲片及魚腥草破壁飲片各組尿常規指標均未見異常。

4.2.8 免疫球蛋白給藥末期及恢復期,各劑量組動物的IgA、IgE、IgG、IgM均未發現異常改變。

4.2.9 病理學檢查以5.40 g·(kg·d)-1劑量魚腥草破壁飲片和5.40 g·kg-1劑量魚腥草飲片對SD大鼠連續3個月灌胃重復給藥后,均未引起大鼠器官組織異常變化。

5 結論與討論

魚腥草多產于我國中部、東南與西南部各省,于古籍中常稱之為蕺,是我國使用數千年的傳統中藥。魚腥草得到廣泛應用,除傳統飲片外,其現代制劑涵蓋多種劑型[12],口服制劑和外用制劑在臨床上使用出現的不良反應較少[11-15],魚腥草注射劑臨床上的不良反應較多,主要為過敏性皮炎、過敏性休克[13-16],誘發過敏的原因可能與不定量成分、不溶性微粒、原料藥材、制備工藝等相關[17]。關于魚腥草各類制劑的動物毒性實驗文獻資料數量有限,湯杰等[18-20]采用魚腥草鼻用噴霧、魚腥草鮮汁原液、新魚腥草素鈉進行單次給藥毒性試驗,魚腥草煎劑腹腔注射對小鼠的LD50為(51.04±3.63)g·kg-1,經口和鼻腔途徑給藥后動物均未見明顯毒性反應;重復給藥毒性試驗方面,吳苑瀅等[21]取魚腥草桔苓合劑對大鼠連續經口給藥30 d,生藥13、25、51 g·kg-1劑量組無明顯不良影響;但也有研究提示魚腥草醇提物350 mg·kg-1經口13周可引致雌性大鼠腎臟皮髓質腎小管礦化[22];李娟等[23]對魚腥草藥酒進行了小鼠的Ames試驗及精子畸變分析試驗,試驗結果未見發現異常;魚腥草地上部分及根莖醇提取物對斑馬魚胚胎發育研究,存在一定的胚胎腎包膜水腫[24];安丹等[25-28]開展了過敏試驗及免疫毒性試驗,魚腥草注射液均引起被動皮膚過敏、全身主動性過敏反應,并抑制小鼠免疫功能的作用,但過敏反應與輔料吐溫-80相關。綜上,提示魚腥草高濃度醇提物可能引致腎臟損傷,但致癌相關性較小;魚腥草注射液的類過敏反應可能為多因素誘發,其作用機制尚不明確;故魚腥草的安全性存在爭議,仍需深挖細掘。

本研究針對馬兜鈴酸和馬兜鈴內酰胺AⅠ的腎小管損傷特征,設置了FDA、EMA認可的臨床前安全性評價的生物標志物GLDH、NAG及β2-MG、Kim-1,能敏感和穩定的反映腎小管早期腎小管損傷和間質性疾病,Kim-1在受損腎臟上皮細胞表面有高度表達,NAG、GLDH可分別定位到腎小管的溶酶體、線粒體[29-31];并針對魚腥草注射液臨床上出現的過敏性反應,進行了免疫球蛋白的檢測。研究結果顯示,魚腥草破壁飲片以最大給藥量單次給藥,在劑量為1.35、2.70、5.40 g·kg-1和傳統飲片以劑量為1.35、5.40 g·kg-1給藥3個月,腎損傷生物標志物、過敏指標、病理學檢查等各項檢查均未見異常,表明魚腥草破壁飲片的安全性較好,沒有出現腎臟毒性反應,并與傳統飲片比較無明顯差異表明。據文獻報道[32],馬兜鈴酸的硝基是產生毒性的構效關系,其硝基經過還原反應后形成酰胺鍵即馬兜鈴內酰胺,兩者構效一致,魚腥草中所含的含馬兜鈴酸內酰胺AⅡ、BⅡ、FⅡ,由于在其結構中菲環上引入了羥基或甲氧基,菲環被還原開環或取代而毒性消失,因此與本研究的結論吻合。

魚腥草屬于藥食兩用的中藥,被譽為“中藥抗生素”,魚腥草破壁飲片為傳統魚腥草飲片經細胞破壁粉碎加工而成的新型飲片,臨床廣泛應用于上呼吸道感染等疾病,其還具有抗氧化、抗內毒素免疫調節等活性[33-35],市場開發潛力巨大。本文進一步確證了魚腥草破壁飲片和傳統飲片安全性,為其臨床應用推廣提供了有力的依據。