替加氟-焦脫鎂葉綠酸A膠束的制備

李逸龍,郭藝彬,王琛,段美濤,張志強

(廈門醫學院藥學系,福建 廈門 361023)

目前,應用于臨床的癌癥治療方式主要有手術、化療、放療[1]。其中化療藥物氟尿嘧啶及其衍生物(如替加氟,TF)相對于其他化療藥物心臟毒性較小,腎毒性和骨髓抑制較弱[2]。然而,氟尿嘧啶類藥物給藥劑量較大,存在一定副作用。對氟尿嘧啶藥物進行結構修飾可以提高其抗腫瘤活性并減少副作用,進而改善其臨床應用[3-4]。

光動力療法是一種新興的抗腫瘤療法,由于其非侵入性、靶向治療特性和低毒或無毒性而備受關注[5],化療藥物與光敏劑共同負載的遞藥系統可實現化療與光動力治療聯合抗腫瘤效果。光動力治療不僅可輔助化療,增強靶向特異性,二者協同作用還可清除殘余腫瘤細胞并抑制損傷血管的再生,能夠有效增強抗腫瘤效果并降低副作用[6]。但是化療藥物與光敏劑共同負載的遞藥系統存在一定局限性,化療藥物的突釋往往導致化療失敗或副作用增強,光敏劑的突釋導致光毒性和光動力治療無效[7]。國內外研究表明通過化學鍵將化療藥物與光敏劑連接不僅可以提高藥物半衰期以增加藥效,還可實現藥物緩釋、按需藥物釋放、降低副作用等優勢[8]。

焦脫鎂葉綠酸A(PPA)為第二代光敏劑,常用作光動力治療的光敏材料。相較于第一代光敏劑,其激發波長更長,組織穿透性更強,因此熒光成像效果與活性氧產生量都有所提高。將TF與焦PPA化學鍵合,對于PPA在增加其體內作用時間的基礎上,可避免因聚集引起的熒光淬滅效果;對于TF不僅可實現通過激光照射控制藥物釋放,還可延長其體內循環時間,避免提前釋藥引起的毒副作用[9]。

兩親性聚合物自組裝形成的聚合物膠束具有內部疏水和外部親水的核-殼結構,可同時負載親水性藥物和疏水性藥物,是抗腫瘤藥物的良載體[10]。其中聚合物材料泊洛沙姆、DSPE-PEG等中PEG結構可增加藥物遞送系統在體內的穩定性并延長體內循環時間,常用來延長所負載藥物的體內半衰期[11];聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)不僅具有兩親性結構,不但能形成膠束負載藥物,還可有效抑制p糖蛋白外排作用,進而實現腫瘤多藥耐藥的抑制效果[12]。雖然TF相較于其他種類抗腫瘤藥物副作用較弱,但是仍然具有較明顯的骨髓抑制、胃腸道反應,基于化療藥物和光敏劑化學結合特點和聚合物膠束遞藥系統用于抗腫瘤藥物遞送的優勢,本研究通過Eschweiler-Clarke反應、酸酐開環反應及兩步酯化合成TF-PPA前藥,并將其制備成膠束用于腫瘤化療聯合光動力治療,實現降低副作用的同時增強抗腫瘤效果。目前已有化療藥物與光敏劑化學結合的相關研究,但是針對替加氟化學修飾研究較少,且尚無替加氟與光敏劑結合的其它研究,本研究為改善氟尿嘧啶類化療藥物療效及降低其毒作用提供了有效解決手段與研究思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器C-MAG HS7 digital加熱磁力攪拌器(德國IKA集團);R-100旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司);LCMS-8050三重四極桿質譜儀、LC-20AP制備液相色譜儀、LC-16高效液相色譜儀(日本島津公司);Nano ZS90激光粒度儀(英國馬爾文帕納科公司);HT7700EXALEN透射電子顯微鏡(日本日立公司);Infinite M1000 PRO酶標儀(瑞士帝肯公司)。

1.2 試藥替加氟、丁二酸酐(SA)、甲醛、泊洛沙姆F68、聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;焦脫鎂葉綠酸A(PPA)購自上海源葉生物科技有限公司;CCK-8試劑、小鼠乳腺癌4T1細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司;其他試劑購自廈門市綠茵試劑玻儀有限公司。

2 方法

2.1 替加氟-焦脫鎂葉綠酸A復合物的合成及表征通過Eschweiler-Clarke反應將TF與甲醛連接,生成含有末端-OH結構的TF-OH,再通過酯化反應,分別連接丁二酸酐(SA)和乙二醇(EG),生成末端含有-COOH的TF-SA和末端含有-OH的TF-SA-OH,最后,再通過酯化反應使TF-SA-OH與PPA連接,形成含有光敏劑PPA和化療藥物TF的TF-PPA前藥。合成路徑如圖1所示。

圖1 TF-PPA合成路線

2.1.1 TF-SA的合成精密稱取TF 2.0 g,置于厚壁耐壓瓶,加入甲醛溶液10 mL,于60 ℃油浴下反應12 h。反應完成后,加入甲醇旋蒸除水,每次加入50 mL直至水被完全除盡,即得羥基化替加氟衍生物TF-OH。精密稱取TF-OH 5.40 g,以適量四氫呋喃(THF)溶解,精密稱取丁二酸酐(SA)12.50 g,以THF溶解后滴加至TF-OH溶液中,量取三乙胺(TEA)17.50 mL,滴加至上述反應液中,于室溫下攪拌反應24 h,并以薄層色譜法(TLC)監測反應進度。反應完成后,旋蒸除去溶劑,剩余物以10 mL 二氯甲烷(DCM)復溶后,以硅膠色譜柱層析分離,流動相為甲醇∶ DCM = 1∶50 (V/V),收集目標產物,合并之后旋蒸除去溶劑,得替加氟丁二酸衍生物TF-SA 3.48 g,產率37.24%。TF-SA的核磁歸屬如下:1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):12.23(s,1H,COOH),8.02(d,1H,C=CH),5.96(ddd,1H,CH),5.78(q,2H,CH2),4.27(q,1H,CH2),3.82(q,1H,CH2′),2.52(t,2H,CH2),2.46(t,2H,CH2),2.25(m,1H,CH2),2.04(m,1H,CH2′),1.93(m,2H,CH2)。

2.1.2 TF-SA-OH的合成精密稱取TF-SA 400.0 mg,加入15 mL THF溶解。另取EDC·HCl 697.0 mg、DMAP 148.1 mg,以5 mL THF溶解后滴加至TF-SA溶液中,室溫下活化30 min后,量取乙二醇(EG)5.0 mL,加入至反應溶液中,于30 ℃下反應24 h,TLC監測反應進度。反應完成后,旋蒸除去溶劑,以10 mL DCM復溶,以硅膠色譜柱層析分離,流動相比例為甲醇∶DCM=1∶50(V/V),合并目標產物有機相,旋蒸除去溶劑,得TF-SA-OH 298.9 mg,產率為65.93%。TF-SA-OH核磁歸屬如下:1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):8.02(d,1H,C=CH),5.95(ddd,1H,CH),5.78(q,2H,CH2),4.78(t,1H,OH),4.26(q,1H,CH2),4.01(t,2H,CH2),3.82(q,1H,CH2′),3.55(q,2H,CH2),2.57(dt,4H,CH2and CH2),2.26(m,1H,CH2),2.05(m,1H,CH2′),1.93(m,2H,CH2)。

2.1.3 替加氟-焦脫鎂葉綠酸A的合成精密稱取PPA 200.0 mg,以二甲基亞砜(DMSO)1.5 mL溶解,避光備用。精密稱取EDC·HCl 408.8 mg,DMAP 86.9 mg,以DCM溶解后加入至PPA溶液中,室溫下避光孵育30 min。精密稱取TF-SA-OH 531.9 mg,以DCM溶解后加入至上述反應液,室溫下避光反應24 h,以TLC監測反應進度,待反應結束后,旋蒸除去溶劑,以5 mL DCM復溶后,以硅膠色譜柱層析分離,流動相比例為甲醇∶DCM=1∶200(V/V),收集目標產物有機相,合并后旋蒸除去有機溶劑后,再以乙腈將粗產物溶解,使用制備液相進行純化,流動相比例為乙腈∶水(97∶3),流速:15 mL·min-1,制備柱:Inspire HILIC (21.2 mm × 250 mm,5 μm),波長:271 nm和400 nm。收集含目標產物的流動相,合并后旋蒸除去乙腈,經凍干后得到TF-PPA粉末,產率15.3%。TF-PPA的核磁歸屬如下:1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ 9.71(d,1H,PPA),9.43(d,2H,PPA),8.89(s,1H,PPA),8.26-8.16(m,1H,PPA),7.94-7.84(m,1H,TF),6.38(d,1H,PPA),6.21(d,2H,PPA),5.75(s,1H,TF),5.75(s,1H,TF),5.52(q,2H,PPA),5.25-5.08(m,1H,TF),4.58(d,2H,TF),4.33(d,2H,TF),4.24-4.12(m,2H,PPA),3.69(d,2H,TF),3.60(s,3H,PPA),3.43(s,4H,TF),3.29(d,1H,PPA),3.21(d,3H,PPA),2.70-2.61(m,2H,PPA),2.40(d,2H,PPA),2.11(s,3H,TF),1.90(s,1H,TF),1.77(d,6H,TF),1.61(s,3H,PPA),0.23(s,2H,PPA)。

2.2 TF-PPA膠束的制備及測定

2.2.1 膠束的制備采用溶劑揮發法制備載藥膠束:精密稱取DSPE-PEG 10.0 mg、維生素E琥珀酸酯 5.0 mg、泊洛沙姆 F68 15.0 mg,TF-PPA 6.0 mg,溶于3 mL無水乙醇,逐滴滴加至20 mL 60 ℃的去離子水中,避光攪拌24 h,至無水乙醇完全揮發,既得TF-PPA載藥膠束溶液。

2.2.2 粒徑和ζ電位的測定以馬爾文激光粒度儀對所制備的膠束進行粒徑和ζ電位進行測定:吸取膠束溶液1 mL,以去離子水稀釋至濃度為1 mg·mL-1,取稀釋后的溶液1 mL,置于樣品測定池內,以馬爾文激光粒度儀進行掃描測定。

2.2.3 形貌學表征以透射電子顯微鏡對所制備的載藥膠束進行成像分析,具體如下:取TF-PPA載藥膠束1滴,加入磷鎢酸染液適量染色15 min后,滴于銅網,自然晾干后,使用透射電鏡對膠束微觀形態觀測并拍攝記錄。

2.3 體外藥效學評價

2.3.1 體外釋藥研究按“2.2.1”項下方法制備TF膠束,取TF膠束、TF-PPA膠束(2份),置于1 000 kDa透析袋內,并向其中加入5 mL pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。將透析袋浸入30 mL磷酸鹽緩沖液中并開始計時。為考察激光照射條件下TF-PPA膠束產生的活性氧對藥物釋放的影響,使用660 nm激光器對激光照射組進行照射(660 nm,150 mW·cm-2),激光器工作模式為連續模式,每次照射5 min,分別于1、12、36、60 h進行激光照射。分別于1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h取1 mL釋放介質并補充空白釋放介質,于12 000 r·min-1離心10 min后,取20 L上清液使用HPLC檢測。

2.3.2 體外抗腫瘤活性研究將對數生長期的4T1細胞以胰酶消化,離心除去培養基,將細胞重懸于3 mL培養基內,取20 μL細胞懸液,以臺盼藍染色并以細胞計數器計數,計算細胞濃度。將計數后的細胞稀釋至2 × 104mL-1,以每孔100 μL接種于96孔板,置于培養箱內培養12 h至細胞貼壁生長。將細胞分為空白組(含培養基,不含細胞);對照組(含細胞和培養基)和實驗組(含細胞、培養基、藥物),除去培養基,實驗組分別加入200 μL以完全培養基稀釋的TF膠束溶液、TF-PPA膠束溶液、TF-PPA膠束溶液+660 nm激光照射(30 mW·cm-2,100 s)(按照負載TF計濃度為0.015、0.15、0.75、1.5、15、75、150 g·mL-1),其他各組加入200 μL空白培養基。培養24 h后向每孔加入CCK-8試劑10 μL,繼續培養4 h后以酶標儀于450 nm下測定吸光度值。并按照公式(1)計算細胞存活率。

(1)

其中Ae為實驗組吸光度;Ab為空白組吸光度;Ac為對照組吸光度。

3 結果與討論

3.1 TF-PPA的合成結構確證圖2為TF-PPA的1H-NMR圖譜。如圖2所示,芳香區同時出現了PPA的特征峰(8.89、9.43、9.71 ppm)和TF-SA-EG的特征峰(7.90 ppm),在脂肪區同時出現了PPA的特征峰(3.60、4.24ppm)和TF-SA-EG的特征峰(3.69、3.43、2.11、1.90、1.77 ppm)且其積分相對應。譜圖中同時還存在PPA的特征峰 6.21 ppm和6.38 ppm以及TF的特征峰 5.75、5.25 ppm,說明TTP的成功合成。

圖2 TF-PPA核磁共振氫譜圖

3.2 膠束制備及測定

3.2.1 粒徑和電位由于腫瘤組織部位血管形成速度較快,血管致密性和完整性較差,存在50～400 nm孔隙,當一定粒徑范圍內納米粒子經過該血管部位后,會通過血管孔隙而到達腫瘤部位,并滯留在腫瘤部位,形成高滲透和長滯留(EPR)效應。所制備的膠束粒徑為143.9 nm,可通過EPR效應實現藥物遞送系統的被動靶向效果。

所制備的納米膠束ζ電位為-5.04 mV,為負電位,與血液電性一致,因此有利于保持膠束溶液在給藥后的穩定性。

3.2.2 透射電鏡如圖3所示,所制備膠束粒徑在100～200 nm之間,粒徑較為均一,與馬爾文激光粒度儀測定結果一致,該載藥膠束溶液可通過EPR效應實現腫瘤部位的被動靶向效果。

圖3 TF-PPA膠束透射電鏡圖

3.3 體外藥效學

3.3.1 體外釋藥研究TF半衰期僅為2.6 h[13],將TF與PPA連接并負載于膠束體系后,可通過緩慢釋藥和酯鍵的斷裂釋放TF,延長TF的釋放時間進而延長TF作用時間。TF-PPA膠束在未經激光照射的釋放介質中釋放較為緩慢,72 h內累積釋放量為70.33%,而經激光照射后釋放加速,72 h內釋放82.50%。釋放介質中加入了10 mmoL·L-1的H2O2(腫瘤微環境活性氧濃度約為10 mmoL·L-1),其產生的ROS促進了TF從TF-PPA的解離,使TF-PPA即使在無激光照射條件下也可較快斷裂酯鍵進而釋放TF。經激光照射后,TF-PPA自身產生一定量的ROS,具有自我促進ROS響應性釋藥特點,激光照射產生的ROS在前藥微環境體系內促進酯鍵斷裂,因此進一步加速了藥物的釋放。

3.3.2 細胞毒性試驗PPA、TF-PPA可以在激光照射下產生能夠促進細胞凋亡的ROS,從而可以加速激光照射下的藥物釋放。因此本文研究了TF-PPA膠束在激光照射和非激光照射下的細胞毒性。選擇替加氟膠束作為對照品對載藥膠束體外抗腫瘤能力進行評價。

如圖4和表1所示,TF-PPA膠束對4T1細胞的毒性較替加氟膠束強,且為濃度依賴性,當TF濃度為150 μg·mL-1時,替加氟膠束、TF-PPA膠束、TF-PPA膠束+激光照射與4T1細胞共孵育24 h后的細胞存活率分別為31.56%±2.64%、20.74%±1.39%、2.11%±0.50%。TF-PPA可在細胞內代謝為TF、甲醛和PPA,TF和甲醛具有協同的化療作用[14],因此增加了細胞毒性。相同給藥濃度下,激光照射組TF-PPA膠束較非激光照射組膠束細胞毒性較強,說明激光照射促進ROS的產生,產生的ROS與釋放的TF共同作用促進細胞凋亡,因此在激光照射下,TF-PPA可以發揮PDT和化療的協同抗腫瘤作用,從而促進細胞凋亡。

表1 TF、TF-PPA、TF-PPA+激光照射組IC50值

圖4 TF、TF-PPA、TF-PPA+激光照射組細胞存活率

4 結論

本研究合成了替加氟和光敏劑焦脫鎂葉綠酸A的綴合物前藥,并將其制備成載藥膠束。所制備的膠束粒徑為143.9 nm,可實現血管內給藥后的腫瘤部位被動靶向效果,ζ電位為-5.04 mV,可保證其在血液中保持膠束結構穩定。體外釋藥與抗腫瘤試驗結果表明,TF-PPA膠束可緩慢釋藥,且激光照射可促進TF的釋放,在激光照射下TF-PPA可發揮光動力治療與化療協同抗腫瘤作用。激光照射下的TF-PPA具有以下優點:①光動力促進TF的釋放;②TF-OH在細胞內的代謝產物具有協同化療作用;③化療和PDT協同促進細胞凋亡。

總之,TF-PPA膠束可通過緩慢釋藥、激光照射加速釋藥、被動靶向至腫瘤部位等特性效提抗腫瘤活性并降低對正常組織的副作用。本研究將為化療藥物與光敏劑的偶聯以降低化療藥物毒性并增強抗腫瘤效果提供科研依據和參考。