靜注人免疫球蛋白(pH4)對人補體系統的體外影響

柯兵兵,王德蓉,李世興,程夢蘭,郭江紅

(湖北省藥品監督檢驗研究院,湖北省藥品質量檢測與控制工程技術研究中心,國家藥品監督管理局血液制品質量控制重點實驗室,湖北 武漢 430075)

靜注人免疫球蛋白是一種臨床上常用于治療免疫缺陷、重癥感染以及器官移植排斥等疾病的血液制劑,臨床需求量極大。然而,據臨床用藥經驗顯示,本品的不良反應發生率較高[1-4],因此,闡釋本品可能引起不良反應的發生機制,對于安全用藥及患者生命健康具有重要的意義。在前期小鼠耳郭藍染試驗中,動物實驗結果顯示不同企業之間的產品引發小鼠發生類過敏反應的潛力有明顯差異,且多聚體含量高的產品,耳郭藍染發生率以及耳郭藍染面積越高,初步提示靜注人免疫球蛋白制品中的多聚體與本品的類過敏反應有一定的關聯性。

多聚體是一種由球蛋白聚集而成的聚合物,這種高分子聚合物含有多個IgG分子,理論上具有多個Fc端補體結合位點,可以與補體分子結合,進而對補體系統產生重要影響。本研究旨在探討,靜注人免疫球蛋白中的IgG聚合物是否可能模擬免疫復合物,與補體分子結合,激活補體系統,產生具有過敏效應的過敏毒素分子C3a、C5a,進而引發類過敏反應癥狀,考察補體系統是否與本品的不良反應存在關聯性。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器5804R型高速冷凍離心機(Eppendorf公司);TW20型恒溫水浴鍋[優博萊技術(北京)有限公司];PURA22型振搖恒溫水浴鍋(優博萊);XP205型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);GHP-9080型隔水式恒溫培養箱(上海一恒科學儀器廠);Xmark型多通道酶標儀(BioRad公司)。

1.2 試劑與耗材靜注人免疫球蛋白(企業A、B、C、D;規格均為5%,批號分別為20221223、202302004、20230631、202212034);多聚體含量升高的靜注人免疫球蛋白:各企業產品50 ℃恒溫水浴分別加熱10 min、30 min;氯化鈣、氯化鎂、氯化鈉、巴比妥鈉、鹽酸、四乙酸乙二胺二鈉(EDTA-2Na)均為國產分析純。0.9%氯化鈉溶液(批號:220807K01,武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司);人補體分子C3a ELISA試劑盒(批號:ml1980523V,上海酶聯生物科技有限公司);人補體分子C5a ELISA試劑盒(批號:ml1999253V,上海酶聯生物科技有限公司);人補體分子Sc5b～9 ELISA試劑盒(批號:ml062554V,上海酶聯生物科技有限公司);人補體分子Bb ELISA試劑盒(批號:ml038432V,上海酶聯生物科技有限公司);人補體分子C4a ELISA試劑盒(批號:ml935026V,上海酶聯生物科技有限公司)。

1.3 試劑溶液的配制冰PBS溶液:稱取700 mg EDTA-2Na粉末,加PBS溶液(pH=7.4)20 mL使溶解,制成EDTA-2Na濃度為100 mmoL·L-1的溶液,4 ℃冰箱冷藏。鎂-鈣貯備液:稱取氯化鈣1.103 g、氯化鎂(MgCl2·6H2O)5.083 g,加水溶解并稀釋至25 mL。VBS緩沖液:稱取氯化鈉41.5 g、巴比妥鈉5.1 g,加水800 mL溶解。用1 moL·L-1鹽酸溶液調pH值至7.3,加鎂-鈣貯備液2.5 mL,加水稀釋至1 000 mL,用0.45 μm膜濾過,4 ℃保存。臨用前,加水5倍稀釋。

2 實驗方法

2.1 人血清制備使用一次性采血針,從20位健康志愿者左前臂靜脈采血4～6 mL,室溫下靜置30 min,3 000 r·min-14 ℃離心15 min,分離血清,1.5 mL離心管進行分裝,1 mL/管,-80 ℃冰箱保存備用。健康志愿者納入標準:18～55歲,性別不限,無重大疾病及近期急慢性感染病史。

2.2 體外補體孵育試驗量取40 μL靜注人免疫球蛋白制劑,加60 μL VBS緩沖液,再加入200 μL人血清,混勻,置于37 ℃ 80 r·min-1振蕩孵育1 h,孵育結束后,加30 μL冰PBS溶液終止反應,按人C3a、C4a、C5a、Sc5b-9、Bb ELISA試劑盒說明書測定孵育后各反應體系中各相應補體分子的含量。另取40 μL的生理鹽水,同法操作,作為陰性對照。

2.2.1 不同供試品濃度下C3a、C5a、Sc5b-9的變化趨勢為考察供試品濃度對補體系統的影響,設置了不同的供試品濃度,用VBS溶液將靜注人免疫球蛋白制劑稀釋至濃度為50、25、12.5、5、2.5 mg·mL-1的溶液。取上述各溶液100 μL,加入200 μL人血清,置于37 ℃振蕩孵育1 h。孵育結束后,分別測定450 nm波長處C3a、C5a、Sc5b-9的變化趨勢。

2.2.2 不同反應比例對C3a、C5a、Sc5b-9、C4a、Bb含量的影響為考察供試品-人血清體積比對補體系統的影響,設置了不同的反應體積比(供試品/血清比例為1/1、1/2、2/1),置于37 ℃振蕩孵育1小時。孵育結束后,分別測定C3a、C5a、Sc5b-9、C4a、Bb的含量,操作同“2.2”項下。

2.2.3 不同企業產品對C3a、C5a、Sc5b-9、C4a、Bb含量的影響為考察不同企業產品對補體系統的影響,分別選取4家企業產品以及加熱處理的產品與人血清反應,置于37 ℃振蕩孵育1 h,孵育結束后,分別測定C3a、C5a、Sc5b-9、C4a、Bb的含量,操作同“2.2”項下。

3 結果

3.1 不同供試品濃度下C3a、C5a、Sc5b-9的變化趨勢與生理鹽水組相比,隨著供試品濃度增加,補體分子C3a和Sc5b-9的吸光度值幾乎無變化,呈一條直線,而補體分子C5a隨著供試品濃度增加,吸光度值呈緩慢下降趨勢,結果見圖1。結果初步表明,不同濃度下供試品溶液對補體系統無激活作用,相反,可能存在抑制作用。

圖1 不同供試品濃度下補體分子C3a、C5a、Sc5b-9的吸光度變化(n=2)

圖2 不同企業產品與人血清孵育后補體分子的變化(n=3)

3.2 不同反應比例條件下C3a、C5a、Sc5b-9、C4a、Bb的變化趨勢供試品與人血清在體外共同孵育時,當兩者體積比分別為1∶2、1∶1、2∶1時,與相應體積比的陰性對照相比,所有組中C3a、C5a、Sc5b-9、C4a、Bb的含量均出現下降(除2∶1體積比組中Bb略有上升外),結果見表1。表明在上述3種體積比條件下,供試品均不能激活補體系統,且呈現出一定程度抑制。

表1 不同反應體積比條件下補體分子C3a、C5a、Sc5b-9、C4a、Bb的變化趨勢

3.3 不同企業產品對補體系統的影響4家企業的靜注人免疫球蛋白制劑與人血清體外孵育時,相比于生理鹽水對照組,補體分子C3a(3/4組)、C5a(4/4組)、C4a(4/4組)、Bb(4/4組)、Sc5b-9(2/4組)出現下降,僅A企業產品組中C3a、Sc5b-9以及B企業產品組中Sc5b-9有一定程度上升,但差異不具有統計學意義(P>0.05)。

4家企業的靜注人免疫球蛋白制劑經50 ℃加熱處理后,與人血清體外孵育,相比于生理鹽水對照組,補體分子C3a(3/4組)、C5a(4/4組)、C4a(2/4組)、Bb(4/4組)、Sc5b-9(3/4組)出現下降,僅部分企業產品組中C3a、C4a以及Sc5b-9有一定程度上升。與相應的未加熱產品組相比,在經過加熱的產品組中,上述補體分子并未出現統計學意義變化。

3 討論

靜注人免疫球蛋白是一種在臨床上廣泛應用的血液制品,需求量較大,臨床用藥過程中,絕大部分不良反應報告發生在給藥后30 min內。與補體系統激活相關的類過敏反應(complement activation-related pseudoallergy,CARPA)被認為是速發型藥物過敏反應的重要類別之一[5-6],其機制是補體系統激活后,產生了諸如C3a、C5a等過敏毒素,與相應的細胞受體結合后,繼而引發一系列的類過敏反應癥狀[7-8]。體外補體孵育試驗是一種快速評價藥物類過敏反應的非臨床研究方法[9-13],通過將供試品與正常人血清按一定比例混合,在37 ℃孵育一段時間后,采用ELISA試劑盒檢測血清中補體分子及補體終末產物的變化,由此判斷供試品是否具有激活補體系統進而引發類過敏反應的能力。

在本研究中檢測了補體系統激活及效應階段的多個補體分子。C3a/C5a是補體系統激活的中間代表性產物,具有強烈的過敏效應。Sc5b-9是補體激活的最終產物,反映補體系統最終激活程度。C4a是經典激活途徑、甘露糖凝集素途徑的特征性中間產物,Bb是旁路途徑的特征性中間產物。孵育后,通過分析各指標的變化趨勢,可進一步確定供試品是通過何種途徑激活補體以及激活程度。本研究通過考察供試品濃度、供試品/血漿比例、孵育時間(1 h和4 h,結果未顯示)對上述補體分子的影響。發現在所考察的影響因素范圍內,與相應的生理鹽水對照組相比,補體分子濃度基本呈降低趨勢,未出現顯著升高現象,表明供試品與補體體外孵育后,并未激活補體。

本研究中的體外補體孵育評價實驗包括兩個關鍵影響因素:一是供試品與血漿比例,二是補體系統激活所需的鈣鎂離子。研究顯示,不同供試品/血漿比例條件下,與生理鹽水對照組相比,絕大部分補體分子均呈下降趨勢(2∶1比例時Bb分子除外)。為最大程度模擬體內給藥比例,根據藥品說明書,70 kg體重成人的劑量為400 mg·kg-1,人體血漿體積約為2.75 L,折合給藥比例為10 mg∶1 mL血漿。同時考慮到鈣鎂離子是補體系統激活所必需的離子,因此采用VBS稀釋液稀釋供試品,使供試品與血漿接近臨床用藥比例。

保障血液制品用藥安全,降低用藥過程中的不良反應發生率是臨床用藥安全的關注重點。本研究以靜注人免疫球蛋白為研究對象,考察產品對補體系統的影響,并驗證所提出的假設“IgG聚合物可能通過激活補體系統引發類過敏反應”。結果提示,靜注人免疫球蛋白不能激活補體系統,同時IgG聚合物增加后,補體系統并未出現激活增加現象。結合免疫球蛋白濃度增加,C5a濃度隨之出現下降,提示存在劑量依賴性抑制作用。至于靜注人免疫球蛋白是否與補體系統結合但不激活,值得進一步深入探討。