UHPLC-MS/MS測定人血漿中的阿普斯特濃度及生物等效性研究

張迅杰,賀美蓮,杭寶建,石峰,鞏麗萍,張乃斌,咸瑞卿,2

(1.山東省食品藥品檢驗研究院,國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室,山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心,產業技術基礎公共服務平臺,山東 濟南 250101;2.山東大學藥學院,山東 濟南 250012)

銀屑病是一種常見的免疫相關的慢性復發性炎癥性皮膚病[1],是一種多基因遺傳和環境相互作用下,主要由細胞免疫異常介導的慢性炎癥性增殖性皮膚病[2]。在世界范圍內有1.25億人患病,中國銀屑病患者達600萬以上[3]。銀屑病關節炎[4]是一種與銀屑病相關的炎性關節病。白塞病[5]是一種復雜的、原因不明的、多系統受累的慢性自身免疫病。

阿普斯特是一種口服的環單磷酸腺苷(cAMP)特異性磷酸二酯酶-4(PDE4)小分子抑制劑。PDE4的抑制能夠升高細胞內的cAMP水平,PDE4降解cAMP可導致免疫細胞激活和促炎細胞因子釋放[6-7]。因此抑制PDE4可能能夠降低PDE4介導的炎癥反應。阿普斯特片,2014年3月21日在美國獲批上市銷售,批準的適應證為活動性銀屑病關節炎[8],適用光療或者系統治療的中度至重度斑塊狀銀屑病和與白塞病相關的口腔潰瘍。2014 年 9 月,FDA 批準阿普斯特用于治療中重度斑塊狀銀屑病[9]。由于其有希望的治療結果和安全性,該藥物分子在皮膚病學中變得非常流行[10]。目前國內有關測定人體內阿普斯特血藥濃度的方法尚未研究,本研究首次建立了一種測定血漿中阿普斯特濃度的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)方法,該分析方法分析速度快,選擇性好,準確度高,靈敏度高,基質效應小等優點。此外,對該分析方法進行了完整驗證,以確保數據測定的準確性。利用此方法進行阿普斯特在中國健康受試者空腹及餐后狀態下體內的藥動學及人體生物等效性研究,為阿普斯特相關制劑一致性評價提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑AB SCIEX Triple Quad 5500液相色譜-質譜聯用系統(美國AB SCIEX公司);3K15臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司);Allegra X-15R臺式高速冷凍離心機(96孔板,美國貝克曼庫爾特公司);Milli-Q Advantage A10超純水器(美國Millipore公司)。數據處理軟件:Analyst 1.6.3(美國AB SCIEX公司);Watson LIMS 7.5 SPS1(美國賽默飛世爾公司)。

阿普斯特對照品(純度99.7%,北京曼哈格生物科技有限公司);阿普斯特-d5對照品(化學純度98.7%,同位素內標純度99.5%,北京曼哈格生物科技有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,德國默克公司);甲酸(色譜純,美國ACS恩科化學);N,N-二甲基甲酰胺[色譜純,賽默飛世爾科技(中國)科技有限公司]。受試制劑:阿普斯特片(規格:30 mg,批號:02007001);參比制劑:阿普斯特片(規格:30 mg,批號:H02366A,Celgene International Sarl 生產)。

1.2 分析條件

1.2.1 UHPLC條件Phenomenex Kinetex C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,2.6 μm);柱溫為40 ℃ ;流動相A相為0.1%甲酸水,B相為0.1%甲酸乙腈;采用梯度洗脫,洗脫程序為:0～0.5 min,流動相A的體積百分含量保持63%,流動相B的體積含量保持37%;0.5～1.3 min,流動相A的體積百分含量從63%下降到0.0%,流動相B的體積百分含量從37%上升到100%;1.3～2.4 min,流動相A的體積百分含量保持0.0%,流動相B的體積含量保持100%;2.4～2.41 min,流動相A的體積百分含量從0.0%上升到63%,流動相B的體積百分含量從100%下降到37%;2.41～3.0 min,流動相A的體積百分含量保持63%,流動相B的體積含量保持37%。流速為0.45 mL·min-1;進樣量為5 μL。

1.2.2 MS條件采用電噴霧離子源(ESI)負離子模式;離子源溫度參數設置為500 ℃ ;檢測模式采用多反應監測(MRM)模式;離子化電壓參數設置為5 500 V ;入口電壓(EP)參數設置為10 V;碰撞室出口電壓(CXP)參數設置為13 V;噴霧氣(Gas1):50;輔助加熱氣(Gas2):55;氣簾氣:35。監測離子對:阿普斯特:461.2/257.1,碰撞能量(CE):14 V,去簇電壓(DP):190 V;阿普斯特-d5:466.1/262.3,CE:14 V,DP:190 V。

1.3 對照品溶液制備

1.3.1 分析物(阿普斯特)工作溶液的配制精密稱取阿普斯特適量,用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配制成質量濃度為 1.0 mg·mL-1的阿普斯特儲備液Ⅰ,精密量取1 mL阿普斯特儲備液Ⅰ適量置10 mL容量瓶中,加50%乙腈水溶液至刻度,使質量濃度為100 μg·mL-1阿普斯特工作溶液Ⅰ,避光保存于-20 ℃ 冰箱中。

1.3.2 內標(阿普斯特-d5)溶液的配制精密稱取阿普斯特-d5適量,用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配制成質量濃度為2.0 mg·mL-1的阿普斯特-d5儲備液Ⅰ,精密移取阿普斯特-d5儲備液Ⅰ適量,用50%乙腈水溶液稀釋至質量濃度為50.0 ng·mL-1阿普斯特-d5工作溶液Ⅰ,精密移取阿普斯特-d5工作溶液Ⅰ適量,用乙腈溶液稀釋至質量濃度為20.0 ng·mL-1阿普斯特-d5工作溶液,避光保存于-20 ℃ 冰箱中。

1.4 樣品預處理取2 mL深孔96孔板,每孔加100 μL血漿樣品,再加質量濃度為20.0 ng·mL-1內標工作溶液(內標工作溶液稀釋劑為乙腈溶液)300 μL,渦旋混合5 min,置4 ℃臺式高速冷凍離心機(96孔板)中離心10 min(4 750 r·min-1),每孔取100 μL上清液,轉移至另一2 mL深孔96孔板,向新的96孔板中加10%乙腈水溶液100 μL稀釋,渦旋混合5 min,待測。

1.5 試驗設計本次臨床研究篩選24例健康成年受試者,所有受試對象均自愿參加本次臨床試驗,且均已簽署書面知情同意書并理解研究程序,能按試驗方案要求完成本研究項目。

本次臨床研究采用單中心、單次給藥、隨機、開放、雙周期、雙制劑、雙交叉試驗設計,進行空腹及餐后兩種狀態下的制劑間生物等效性研究?？崭菇M12例受試者,餐后組12例受試者,空腹組和餐后組均隨機分為兩組,每組6人,按照給藥順序表分別給予受試制劑和參比制劑。所有受試者給藥方法:空腹或者開始高脂餐后30 min口服,240 mL溫水服用,給藥劑量為30 mg。第Ⅰ周期6例受試者口服阿普斯特片30 mg(受試制劑),另6例受試者餐后口服阿普斯特片30 mg(參比制劑),7 d后進行第Ⅱ周期交叉給藥研究?？崭?餐后試驗: 在給藥 0 h (給藥前 1 h內)和 0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、8、10、12、24、36 h,共 18 個時間點采集靜脈血4 mL,空腹/餐后采集的靜脈血均置EDTA-K2抗凝真空采血管中, 室溫放置, 離心 (條件設定為 2 000 g、4 ℃、10 min),全血樣品于采集完后 1 h內放入離心機。待離心操作結束后, 室溫分離血漿。分離的血漿樣品冷凍保存于超低溫冰箱(冰箱溫度范圍不高于-60 ℃)中,用于檢測血漿中阿普斯特的血藥濃度。

2 方法與結果

2.1 方法學驗證[11]

2.1.1 線性范圍用移液器取285 μL空白血漿,加入15 μL不同濃度的分析物工作溶液,使樣品中阿普斯特的濃度分別為2.00、4.00、10.0、30.0、100、200、480、600 ng·mL-1。分別按“1.4”項下方法處理樣品,按“1.2”項下條件測定。每個分析批的標準曲線采用雙校正樣品擬合,以阿普斯特與阿普斯特-d5的色譜峰面積比為縱坐標(Y),以血漿中阿普斯特的濃度為橫坐標(X,μg·mL-1),采取加權(W=1/X2)最小二乘法進行線性回歸,求得回歸方程為Y=0.014 798 2X-0.004 368 50,決定系數r2為0.997 7,校正樣品回算濃度均在要求范圍之內,說明阿普斯特在2.00～600 ng·mL-1范圍內線性良好,由此計算的藥物濃度準確可靠。本研究方法的定量下限為0.200 μg·mL-1,信噪比S/N>10,滿足定量要求。

2.1.2 殘留通過在注射高濃度樣品后注射空白基質樣品(空白血漿)來評價殘留,圖A為阿普斯特在定量上限(600 ng·mL-1)處的選擇離子色譜圖,分析物和內標經色譜分離后,分析物(阿普斯特)的保留時間為 1.2 min,內標(阿普斯特-d5)的保留時間為 1.2 min,并得到較好的響應值與峰形。圖 B為注射定量上限(600 ng·mL-1)阿普斯特樣品后進樣的空白血漿樣品色譜圖。將圖A與圖B進行比較,發現空白血漿樣品的色譜圖在阿普斯特與阿普斯特-d5的色譜峰附近中沒有干擾峰出現,說明該方法的殘留小,對分析物(阿普斯特)及內標(阿普斯特-d5)的定量均無影響。圖C為受試對象服用阿普斯特片4 h后的血漿樣品提取離子色譜圖,結果表明該研究方法在用于測定實際血漿樣品時相應保留時間處無飄移。

A.加標阿普斯特的血漿樣品;B.空白血漿樣品;C.受試者服用阿普斯特片4 h后的血漿樣品 1.阿普斯特;2.內標

2.1.3 精密度與準確度配制含分析物(阿普斯特)定量下限(2.00 ng·mL-1)和低(6.00 ng·mL-1)、中(50.0 ng·mL-1)、高(450 ng·mL-1)水平的質控樣品各 6份,“1.4”項下方法處理樣品,在至少2 d內測定3個不同分析批,評價本研究方法的批內、批間準確度和精密度;結果見表 4。表明該研究方法的精密度、準確度均良好,符合《中國藥典》2020年版(四部)《通則9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則》。

2.1.4 選擇性取6個受試者的空白血漿制備空白基質樣品與定量下限樣品,空白基質樣品除用300 μL 乙腈溶液代替內標工作溶液外,其余步驟按“1.4”項下方法處理樣品,定量下限樣品按“1.4”項下方法處理樣品,采用“1.2”項下條件進樣分析。本研究6個受試者的空白基質干擾組分在阿普斯特與阿普斯特-d5保留時間處的響應均為0,表明該方法具有良好的選擇性,能區分阿普斯特與阿普斯特-d5與基質中的內源性組分。

表4 準確度與精密度(n=6)

2.1.5 基質效應取6個受試者的空白基質、1個高血脂空白基質及1個溶血空白基質制備不添加待測物和內標的空白基質樣品,“1.4”項下方法處理樣品,向處理后的空白基質樣品中分別加入低質控濃度(LQC,6.00 ng·mL-1)和高質控濃度(HQC,450 ng·mL-1)阿普斯特與阿普斯特-d5的混合溶液,配制基質效應評價樣品,采用“1.2”項下條件進樣分析,所得阿普斯特與阿普斯特-d5響應與相同理論濃度的純溶液樣品的阿普斯特與阿普斯特-d5響應比較,用內標歸一化的基質因子的變異系數(CV)評價基質效應,具體結果見表5。結果6個受試者,1個高脂及1個溶血的空白基質樣品的內標歸一化基質因子的CV均小于15%,表明該研究方法的基質效應符合要求。

表5 6批不同來源血漿、高脂及溶血的基質效應

2.1.6 提取回收率取空白基質,按“1.4”項下方法處理樣品,加入阿普斯特與阿普斯特-d5,進樣測定,比較二者的響應均值,考察阿普斯特(低、中、高 3個質控濃度)和阿普斯特-d5的提取回收率。3種質控濃度阿普斯特的提取回收率分別為94.3%、93.2%、 94.0%,阿普斯特-d5的提取回收率為96.7%,說明該研究方法提取回收率較高,在處理過程中不會對結果造成影響。

2.1.7 穩定性用新鮮制備的標準曲線及質控樣品,考察放置不同儲存條件下的樣品中阿普斯特的穩定性,分別考察了含阿普斯特的血漿樣品反復凍融循環5次的穩定性、血漿樣品在室溫條件下放置25 h的穩定性、處理過的血漿樣品在自動進樣器溫度(8 ℃)條件下放置96 h的穩定性及血漿樣品在冷凍條件下(-80 ℃,-20 ℃)放置62 d的穩定性。結果見表6。結果表明阿普斯特血漿樣品在考察條件下穩定。

表6 不同條件下的穩定性考察結果

2.2 阿普斯特片藥代動力學及生物等效性研究使用本研究建立的UPLC-MS/MS方法對血漿中阿普斯特濃度進行測定,評價空腹和餐后條件下兩制劑之間是否具有生物等效性。以時間為橫坐標、測定的阿普斯特血藥濃度為縱坐標,分別繪制空腹及餐后條件下受試制劑與參比制劑的阿普斯特平均血藥濃度-時間曲線(見圖2)。

圖2 在空腹(A,n=12)和餐后(B,n=12) 條件下阿普斯特的平均血藥濃度-時間曲線圖

用Phoenix WinNonlin 8.2軟件計算兩種阿普斯特片劑的藥代動力學參數(AUC0～t、 AUC0～∞、Cmax、λz、 t1/2、Tmax),結果見表7。主要藥代動力學參數(AUC0～t、 AUC0～∞、Cmax)經對數轉換后進行多因素方程分析,同時采用(1-2ɑ)計算兩種制劑的主要藥代動力學參數的幾何均值的90%置信區間(CI),評價兩種制劑的生物等效性。12例受試者空腹口服阿普斯特片受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞幾何均值比的90%置信區間分別落在92.52%～112.38%、96.25%～110.28%和96.15%～110.52%范圍內,30例受試者餐后口服阿普斯特片受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞幾何均值比的90%置信區間分別落在93.56%～114.85%、96.57%～116.20%和99.73%～114.38%范圍內。此外,本實驗中空腹給藥后阿普斯特Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的個體內變異CV分別為13.25%、9.55%、9.48% ;餐后給藥組的個體內變異CV分別為15.66%、14.21%、14.62%。AUC0～t、 AUC0～∞和Cmax經對數轉換后多因素方差分析結果顯示給藥周期、給藥序列、個體間、制劑間的差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表7 在空腹和餐后條件下阿普斯特片受試制劑和參比制劑藥動學參數(n=12)

3 結論

本研究建立的測定人血漿中阿普斯特含量的方法具有靈敏度高、準確可靠、選擇性好、基質效應小、快速簡便等優點。該方法使用乙腈對血漿樣品進行蛋白沉淀,內標工作溶液直接配制到沉淀劑中,減少了操作步驟,使操作更簡化,并且有機試劑消耗少,大大提高了臨床適用性和工作效率;選用0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈為流動相,提高靈敏度,出峰位置穩定,且縮短了單針檢測時間;該方法使用同位素標記的內標,方法的耐用性大大提高;此外為了減小該分析方法的基質效應,將蛋白沉淀離心后的上清進行1∶1稀釋(稀釋液:10%乙腈水)。經方法學驗證該方法符合生物樣本分析要求,實際樣本再分析的通過率為100%,將該方法成功應用于臨床血藥濃度檢測,結果可靠。本試驗為阿普斯特相關制劑的生物等效性研究提供了數據參考,適用于阿普斯特的血藥濃度檢測及其藥代動力學研究,為阿普斯特制劑一致性評價提供依據。

研究結果表明,空腹和餐后口服阿普斯特片受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞幾何均值比的90%CI均在80.00%～125.00%等效區間內(包括邊界值),符合生物等效性評價標準。此外,本試驗中空腹和餐后給藥后阿普斯特Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的個體內變異CV均小于30%,不屬于高變異藥物。Cmax、AUC0～t、AUC0～∞經對數轉換后的多因素方差分析結果顯示給藥周期、給藥序列、個體間、制劑間的差異均具有統計學意義(P<0.05)。研究結果表明兩種制劑在空腹和餐后條件下口服給藥符合生物等效。另外,由藥動學參數AUC0-t可知阿普斯特餐后條件下口服給藥生物利用度較空腹條件下高,為臨床提供更合理的用藥指導,為患者提供更好的治療效果。