KIF11、β-catenin、GSK-3β在宮頸癌中的表達及臨床意義

張曉靜 經 莉 魏 敏 陸曉媛

宮頸癌發生率居于婦科惡性腫瘤首位,發生機制仍不明確,從分子水平角度對宮頸癌的發生、發展進行研究更易于明確宮頸正常組織惡變過程,對于臨床有效治療宮頸癌意義重大。Kinesin家族成員11(kinesin family member 11, KIF11)是有絲分裂中必需的分子運動蛋白,促進細胞有絲分裂雙極紡錘體形成,并在間期介導細胞質的各種運輸過程[1]。研究表明,KIF11是一種Wnt相關蛋白。Pei等[2]研究發現,KIF11可通過激活Wnt/β-catenin信號通路增強乳腺癌細胞的自我更新,從而增強乳腺癌干細胞的特性。Wu等[3]研究發現,KIF11通過調節Wnt/β-catenin信號通路的活性促進肝細胞癌的惡性進展。β-catenin、GSK-3β作為此通路的主要調控因子發揮著重要作用。對于KIF11是否通過Wnt/β-catenin通路在宮頸癌中發揮作用,相關報道較少。本研究利用免疫組化法初步探究KIF11與Wnt/β-catenin信號通路相關分子在宮頸癌中的表達及臨床意義,旨在探討三者聯合檢測對于宮頸癌診斷的臨床價值及潛在的治療靶點。

資料與方法

1.一般資料:收集2013年12月～2017年5月在徐州醫科大學附屬醫院病理科存檔的宮頸組織蠟塊。標本中宮頸癌患者102例,患者年齡26～69歲,中位年齡為48歲。年齡<50歲55例,≥50歲47例;病理類型為鱗癌86例,腺癌16例;根據國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期,FIGO Ⅰ期69例,Ⅱ期24例,Ⅲ期9例;分化程度為高分化66例,中、低分化36例;無淋巴結轉移53例,有淋巴結轉移30例(102例宮頸癌患者中,83例接受了手術治療,術中行淋巴結清掃術;19例患者接受了放化療等抗腫瘤治療)。同期收集慢性宮頸炎組織40例,患者年齡30～58歲,中位年齡為46歲。低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)組織46例,高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)組織52例,患者年齡28～55歲,中位年齡為45歲。宮頸癌患者納入標準:①病理確診為宮頸癌;②臨床病理資料完整;③患者可進行術后長期隨訪。排除標準:①合并其他系統的惡性腫瘤;②合并其他內外科疾病。本研究經徐州醫科大學附屬醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:XYFY2022-KL224),樣本收集取得患者知情同意。

2.主要試劑與儀器:兔抗人多克隆抗體KIF11購自北京博奧森生物技術有限公司,兔抗人多克隆抗體β-catenin、兔抗人多克隆抗體GSK-3β均購自武漢賽維爾生物科技有限公司,組化筆、試劑盒及二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

3.實驗方法:采用免疫組化法檢測KIF11、β-catenin、GSK-3β在不同宮頸組織中的表達情況,具體實驗操作步驟如下:將組織蠟塊4μm厚度連續切片;切片脫臘至水化;枸櫞酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)進行抗原修復;切片放入3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育25min,以阻斷內源性過氧化物酶活性;膜封閉液(3%BSA)中封閉30min;滴加KIF11、β-catenin、GSK-3β一抗,4℃孵育過夜;滴加二抗,室溫孵育50min;DAB顯色;蘇木精復染細胞核3min;脫水封片;顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

4.結果判定:病理切片由兩名高年資病理科醫師采用雙盲法進行閱片。在高倍鏡(×400)下隨機選取10個視野,每個視野觀察100個細胞。染色強度評分如下:無著色記為0分,淡黃色記為1分,棕黃色記為2分,棕褐色記為3分。陽性細胞百分比評分如下:陽性細胞<5%記為0分,5%～25%記為1分,25%～50%記為2分,50%～75%記為3分,≥75%為4分,根據染色強度×陽性細胞百分比的結果作為最終得分:<3分判為陰性,≥3分判為陽性。

5.隨訪:對所有患者進行長期隨訪,采用門診復診、電話等方式隨訪患者的生存狀況,以患者開始治療的時間作為隨訪開始時間,隨訪時間截至2022年7月31日。

6.統計學方法:應用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行統計分析。采用χ2檢驗分析不同宮頸組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β的表達情況及其與宮頸癌臨床病理特征的關系,采用Spearman相關分析法分析KIF11、β-catenin與GSK-3β三者之間的相關性,采用Kaplan-Meier法對宮頸癌患者進行生存分析,COX比例風險模型分析影響宮頸癌患者的獨立預后因素,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.不同宮頸組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β表達情況:KIF11在細胞質中以棕褐色顆粒形式表達,陽性率在慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組和宮頸癌組分別為12.50%、32.60%、44.23%、60.78%,呈逐漸遞增趨勢;β-catenin在細胞質和細胞核中以棕黃色顆粒形式表達,陽性率在4組中分別為15.00%、28.26%、48.08%、62.75%,呈逐漸遞增趨勢;GSK-3β在細胞質和細胞核中以棕黃色顆粒形式表達,陽性率在4組中分別為67.50%、47.83%、36.54%、24.51%,呈逐漸遞減趨勢(P<0.05),詳見表1。

表1 不同宮頸組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β陽性率比較[n(%)]

2. KIF11、β-catenin、GSK-3β表達情況與宮頸癌患者臨床病理特征的關系:在宮頸癌患者組織中,KIF11、β-catenin、GSK-3β陽性表達在FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移方面比較,差異均有統計學意義(P<0.05),在不同年齡及病理類型方面比較,差異無統計學意義(P>0.05),詳見表2。

表2 宮頸癌組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β表達與臨床病理特征的關系(n)

3. 宮頸癌組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β表達相關性分析:在宮頸癌組織中,KIF11與β-catenin的表達水平呈正相關(r=0.461,P<0.05),β-catenin與GSK-3β的表達水平呈負相關(r=-0.692,P<0.05),KIF11與GSK-3β的表達水平呈負相關(r=-0.336,P<0.05)。

4. KIF11、β-catenin、GSK-3β的表達與宮頸癌患者預后的關系:對102例宮頸癌患者進行長期隨訪,其中失訪患者15例,死亡患者20例,隨訪率為85.30%。Kaplan-Meier生存分析曲線顯示,KIF11陽性表達患者的平均生存時間短于陰性表達患者,β-catenin陽性表達患者的平均生存時間短于陰性表達患者,GSK-3β陽性表達患者的平均生存時間長于陰性表達患者(P<0.05),詳見圖1～圖3。

圖1 KIF11陽性和陰性宮頸癌患者生存曲線

圖2 β-catenin陽性和陰性宮頸癌患者生存曲線

圖3 GSK-3β陽性和陰性宮頸癌患者生存曲線

5.影響宮頸癌患者預后的單因素及多因素分析:單因素分析結果顯示,FIGO分期、組織分化程度、淋巴結轉移、KIF11、β-catenin和GSK-3β的表達與患者預后相關(P<0.05)。多因素分析結果顯示,FIGO分期、淋巴結轉移、KIF11、β-catenin為宮頸癌患者預后的獨立危險因素,GSK-3β為獨立保護因素,詳見表3。

表3 COX回歸分析宮頸癌患者的預后影響因素

討 論

正常宮頸組織到惡變是一個受多因素調控的復雜過程。Wnt/β-catenin信號通路是調節腫瘤侵襲和轉移的關鍵通路[4]。Wnt/β-連環蛋白信號轉導途徑由細胞外Wnts啟動,并通過配體與細胞膜上存在的各種受體和輔受體結合轉導,激活細胞內轉錄或非轉錄反應[5]。研究表明,Wnt信號通路在宮頸癌的發生和侵襲中具有重要作用[6]。已有相關研究表明,KIF11可以調控Wnt/β-catenin信號通路[2,3]。

KIF11是一種高度保守的運動蛋白,其結構域通過將ATP的化學能轉化為機械力來結合并跨越微管[1]。由于KIF蛋白(如KIF11)的過表達,在有絲分裂過程中產生額外的力,導致姐妹染色單體過早分離,染色體分布不均,進一步導致子代細胞的非整倍性[7]。有研究發現,KIF11在有絲分裂期間的G2/M期轉變和細胞周期檢查點中發揮重要作用,隨后調節腫瘤進展[8]。鑒于此,收集宮頸癌患者組織中KIF11蛋白表達情況并進行相關研究具有重要意義。Cheng等[9]研究發現,KIF11在宮頸癌中表達增加,并且在宮頸癌進展過程中KIF11介導了胞質分裂。

本研究中,隨著宮頸病變進展,KIF11陽性率呈上升趨勢,推測KIF11高表達預示宮頸癌組織惡化進程。此外,KIF11陽性患者生存時間低于陰性患者,認為KIF11在宮頸癌中充當癌基因,與患者預后不良相關。眾所周知,HPV感染是宮頸癌的危險因素。研究表明,HPV相關性宮頸癌的發病機制與病毒癌蛋白E6和E7的高表達相關,通過抑制多種細胞蛋白(如p53、pRb、p21和p27),從而影響細胞增殖、細胞周期和凋亡等生物學過程[9]。由此可見,HPV和KIF11均可通過影響細胞增殖及細胞周期過程參與宮頸癌的發生、發展,且兩者表現為協同作用,均是宮頸組織惡變的危險因素。

β-catenin是Wnt信號通路中重要的蛋白質分子,其在宮頸癌組織中的表達水平直接影響Wnt/β-catenin信號通路的激活程度。β-catenin主要涉及兩種細胞活動:細胞-細胞黏附和信號轉導[10]。研究表明,HPV16 E6激活Wnt/β-catenin通路,對HPV轉化、上皮細胞永生、平衡組織穩態和病理表型至關重要[11]。本研究中,隨著宮頸病變進展,β-catenin陽性率上升,表明β-catenin高表達預示宮頸癌的發生。本研究將患者按照β-catenin表達情況進行分組發現,β-catenin陽性患者生存時間顯著低于陰性患者,這與相關研究認為HPV可通過誘導Wnt/β-catenin通路活化并促進宮頸癌惡性進展的結論具有相似之處,由此認為β-catenin在宮頸癌中充當癌基因作用,并影響患者預后[12]。Bulut等[13]研究發現,在雙轉基因小鼠模型中,HPV16 E7和組成型活性β-catenin的共表達可加速宮頸癌的發生。Wnt/β-catenin通路參與HPV相關性宮頸癌的發生,且β-catenin高表達可與HPV共同參與宮頸癌患者的癌變過程。

GSK-3β作為一種細胞內絲氨酸-蘇氨酸激酶,其活性可以通過底物特異性的方式調節[14]。磷酸化作為GSK-3β最重要的調控機制,可影響參與DNA修復的相關信號通路的因子,以促進DNA修復。在DNA損傷的研究中,細胞核和線粒體中GSK-3β的不斷激活促進腫瘤抑制蛋白p53的表達,并與p53形成復合物,增強p53誘導的凋亡反應[15]。作為β-連環蛋白的上游基因,GSK-3β通過控制Wnt信號轉導,在細胞增殖、遷移、轉移和分化中擔負重要作用[17]。在不同類型的腫瘤中,GSK-3β作為腫瘤抑制因子或腫瘤啟動因子仍具有爭議[16]。

本研究發現,隨著宮頸病變進展,GSK-3β陽性率減低,這可能與GSK-3β異常表達通過使細胞內代謝調控異常、延緩組織惡化過程有關。Abudula等[17]研究發現,宮頸癌發生及HPV感染伴有腫瘤組織內糖脂和氨基酸分解代謝加劇,能量代謝增強,處于物質代謝紊亂的病理狀態,與HPV陰性對照比較,GSK-3β在HPV16陽性宮頸癌或癌前病變中表達減少,由此認為,通過影響GSK-3β表達參與宮頸組織病變過程,可能是HPV促進宮頸癌發生的重要因素之一。此外,GSK-3β陽性患者生存時間高于陰性患者,推測GSK-3β可能在宮頸癌中充當抑癌基因作用,在臨床病例中此類患者預后更好。

本研究中宮頸癌患者組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β陽性表達顯著影響FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移,而不受年齡及病理類型影響,三者不僅在宮頸組織向惡化轉變過程中擔負重要作用,而且有助于評估腫瘤惡性程度進展及預后;其中KIF11及β-catenin陽性表達互為影響,兩者共同參與宮頸癌的發生、發展,在宮頸組織惡變進程中發揮協同作用,GSK-3β分別與KIF11、β-catenin起相互抑制作用,在宮頸癌中發揮負性作用,推測三者可作為宮頸癌的有效預測指標。β-catenin、GSK-3β作為Wnt信號通路的重要分子,KIF11可能通過激活該信號通路來調控宮頸癌的惡性進展。但本研究受研究樣本量限制,且為單中心研究,今后將收集更大樣本量,采用多中心研究予以驗證本實驗結論。

綜上所述,KIF11、β-catenin與GSK-3β異常表達與宮頸癌的發生、發展及預后相關,三者聯合檢測為宮頸癌的診斷及預后提供了新的參考。