基于微流控芯片的體外腸道吸收模型構建及其應用進展

陳 蘭，何曉莉，游飄雪，王 輝，洪戰英,

（1.福建中醫藥大學藥學院, 福建 福州 350122；2.海軍軍醫大學藥學系，上海 200433；3.上海市藥物（中藥）代謝產物研究重點實驗室, 上海 200433）

口服給藥是最簡單的給藥方式，藥物是否適合口服給藥取決于其在胃腸道中的有效吸收，因此，開發能準確預測口服藥物吸收的方法對藥物研發相關研究具有非常重要的意義。近幾十年來，為了評估臨床前開發過程中的口服藥物吸收，研究人員們已經建立了多種藥物腸吸收的研究方法，主要有體外試驗法（in vitro）、在體試驗法（in situ）和體內試驗法（in vivo）等。動物模型可以模擬整個有機體的生理，但動物模型在腸道生理學以及腸道轉運蛋白的表達模式和底物特異性方面與人類有很大不同[1]。2004 年，美國FDA 估計，92%通過動物試驗的藥物未能進入市場，原因是動物試驗沒有預測到的有效性和安全性問題。此外，動物模型往往具有倫理學爭議。與動物模型相比，體外培養細胞模型具有操作簡便、成本低、無倫理問題等優點[2],研究人員開發了Boyden Chamber 和Transwell 等模型來模擬腸道的復雜結構和功能。然而，傳統的體外培養細胞模型通常缺乏體內特性，例如，流體流動、周期性蠕動、宿主與微生物之間的串擾以及組織之間的串擾[3]。隨著微制造和3D 打印技術的發展，腸芯片（gut-on-a-chip, GOC）為體外研究腸道疾病提供了新方法[4]?；谀c道功能，腸芯片引入了具有不同部件的模塊，例如，用于流體流動的注射泵和用于機械變形的壓力系統[5]，用于模擬一些腸道功能，使其更具生理相關性。腸芯片突破了傳統細胞培養和動物實驗的局限性，具有體積小、高度集成化和高通量等特點。本文綜述了目前國內外腸芯片模型以及與腸道相關的多器官耦合芯片模型的研究進展，介紹了基于微流控芯片的腸道模型在疾病建模、藥物吸收和轉運方面的應用。

1 腸道基本結構與功能

1.1 小腸的結構

腸道是人體重要的消化器官，是從胃幽門至肛門中最長的一段，主要器官功能是進行消化、吸收、分泌和免疫[6]。腸上皮是人體最大的黏膜表面，覆蓋約400 m2的表面積，單層細胞組織形成隱窩和絨毛結構[7]。隱窩和絨毛是腸道基本的、具有自我更新功能的結構單位。人體小腸和大腸體內腸隱窩的實際深度分別為135 μm 和400 μm，小腸絨毛的高度為600 μm[8]。隱窩和絨毛分別包括干細胞增殖和分化細胞區域。在腸上皮的分化絨毛區域中，發現了3 種主要類型的分化腸上皮細胞（IEC）：腸上皮細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞[9]。腸上皮細胞是腸上皮中最常見的細胞，負責消化和吸收腸腔中的營養物質[10]。杯狀細胞分泌的黏液在腸上皮上維持一層連續的黏液，提供保護屏障并有助于潤滑腸道內壁[11]。腸內分泌細胞產生多種激素并調節許多不同的功能[12]。

1.2 腸道屏障

腸道屏障是機體內部和外部之間的屏障，允許營養素和液體的吸收，同時阻止有毒、有害物質的侵入，對人體的健康起著重要作用。腸道屏障分為四類：機械屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障[7]。機械屏障又稱為物理屏障，它能有效阻止有害物質，如細菌、毒素等透過腸黏膜進入機體的其他部位造成腸道損傷引發各類疾病，是人體腸道的第一道防線[13]。物理屏障主要通過細胞間的緊密連接復合構成，維持腸上皮細胞的完整性和滲透性[14]?；瘜W屏障由胃腸道各種分泌物包括黏液、胃酸以及各種消化酶、溶菌酶等組成[15-16]。生物屏障是腸黏膜屏障的重要組成部分，由腸道微生物群附著在腸黏膜層上形成的一個動態穩定的微生物屏障[15]。免疫屏障由腸道相關淋巴組織及腸上皮固有層中的免疫細胞組成，如潘氏細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞等，可分泌各種抗菌肽、IgG 和細胞因子，維持腸道內穩態[17]。

1.3 腸道吸收和轉運與體內外腸道模型

藥物在胃腸道黏膜上皮細胞的吸收過程是藥物在生物膜兩側的跨膜轉運過程，藥物的跨膜轉運方式主要分為被動轉運、轉運體介導的主動轉運和膜動轉運等?？诜幬镌谀c道的吸收不僅是簡單的被動轉運，還通過腸道上皮細胞的藥物轉運體來實現，其中，轉運體參與的主動轉運在藥物吸收過程中起關鍵作用[18]。根據底物的轉運方向，可以將轉運體分為攝入型轉運體和外排型轉運體兩大類，它們控制著腸黏膜屏障的通透性，影響了藥物的生物利用度[19]。

為了研究腸道屏障功能及藥物吸收特征，研究人員開發了各種體外和離體腸道吸收模型。將細胞外基質（ECM）包被腸上皮細胞置于Transwell 培養裝置中，常用于研究腸道屏障功能或藥物吸收。但這種2D 培養模式沒有介質流動或施加機械應變，不能再現腸細胞和組織形態或重建其他關鍵的腸分化功能，腸絨毛無法分化，腸道分泌功能受到抑制[20]。為實現3D 腸道細胞模型的建立，研究人員使用不同支架包埋細胞。Li 等[21]使用膠原凝膠作為支架，將共培養的Caco-2/HT29-MTX 單層細胞和兩種基質細胞（成纖維細胞和免疫細胞）合并到膠原凝膠中，與Caco-2 細胞的單層培養相比，構建的3D 模型顯示出更多的生理相關特征。研究表明，使用膠原凝膠作為支架的3D 腸道模型可能成為研究腸道內藥物轉運的有前景的工具。但其也有一定的局限性，在長時間培養過程中，由于膠原蛋白降解，細胞穿透基質形成多層細胞，導致Caco-2細胞在膠原支架上的培養，絨毛高度縮短[22]。另外一些離體模型，如外翻囊模型[23]、Ussing 腔模型[24]和InTESTineTM[25]在生理學上高度相關，但這些模型的吞吐量和壽命往往有限（最長可達6～8 h）。

2 基于微流控芯片的腸道吸收模型

常規的腸道體外模型缺乏對組織結構的真實模擬、缺乏微生物群，以及腸道功能的復雜性，例如蠕動和流動。隨著微流控技術的飛速發展，基于微流控的腸芯片成為了模擬人體胃腸道的有效途徑。如圖1 所示，腸道微環境的關鍵因素包括腸道的3D 絨毛結構、蠕動運動和腸屏障功能等[26]。為了真實地模擬人體腸道，腸芯片模型應能實現以下功能：①通過體外拉伸細胞培養膜來模擬蠕動樣運動；②通過控制流體來再現腸道復雜的3D 絨毛結構；③通過控制微流體的設計結構和材料的滲透性來產生生理氧梯度：④通過多細胞共培養的方式，研究腸道與其他組織或腸道-微生物之間的互作關系。

圖1 腸道微環境關鍵特征[26]

2.1 腸道芯片設計

在過去的10 年中，腸道芯片平臺已經從簡單的2D 結構發展到包括更全面的功能，例如絨毛結構、腸道蠕動、氧梯度，甚至免疫系統。在腸道器官芯片發展的過程中，腸芯片的類型主要分為兩種：二維夾膜腸芯片和三維絨毛腸芯片。

二維夾膜腸芯片最常見的設備結構包含兩個通道（上部和下部），由半透膜（例如聚碳酸酯或聚酯材料）隔開，在膜上生長的腸上皮細胞形成單層上皮的頂端和基底外側，這種簡單的2D 模型通常用于評估藥物和營養吸收的體外藥動學特性。Kimura 等[27]開發了一種集成泵式循環裝置和光學檢測功能的微流控模型，該模型由被膠原蛋白涂層的半透膜分隔的兩層通道組成，以抗癌藥物環磷酰胺的滲透評價其吸收功能。Shah 等[28]設計了一種基于微流控芯片的人類-微生物共培養模型“人與微生物交互系統”（HuMiX），見圖2。培養基灌注微腔室與人腸上皮細胞培養微腔室之間用微米多孔膜（孔徑1 μm）隔開，人腸上皮細胞培養微腔室與微生物培養微腔室之間用納米多孔膜（孔徑50 nm）隔開，每個微腔室有獨立的進出口，該模型還集成了光電二極管用于監測溶解氧的濃度。2D 腸道芯片模型可以模擬腸道細胞上的流體剪切應力，以減少對細胞和培養基的需求，但該模型仍缺乏模擬腸道組織關鍵特征的功能。

圖2 腸道芯片結構示意圖

三維絨毛結構的實現對于構建體外腸道模型至關重要，腸道內的絨毛微結構不僅是腸上皮層的生理屏障，更重要的是增加了腸表面的吸收面積。雖然有報道稱在平面基質上自發形成絨毛，但缺乏對絨毛尺寸和分布的控制，而且重復性差。微型3D 支架的集成已經成為更好地再現人類腸道結構的解決方案。Shim 等[29]植入了膠原蛋白支架，以重現腸道組織三維絨毛結構，絨毛高度為300 μm，絨毛間距為150 μm。3D 條件下Caco-2 細胞增殖良好，均能形成腸屏障。此外，將細胞置于灌注培養的3D 培養條件下，可顯著提高細胞的代謝活性。Costello 等[30]利用激光雕刻翻模的技術制作了一種腸道芯片，在這種芯片中細胞依附于所制作的絨毛生長；但是激光雕刻在模具的制作中有一定局限性。激光雕刻利用激光垂直切割平面基底，制作出的模型多為柱狀結構，較難制作出更為復雜的3D 模型。張憶恒等[31]通過3D 打印技術與表面微結構轉移方法，成功地模擬了更為復雜的腸道絨毛。

2.2 流體控制

在腸道中，剪切力在細胞分化中起著重要作用，包括增強黏液產生、增加線粒體活性和提高藥物吸收[32]。2D 培養時細胞保持在靜態條件下，動態參數不容易模擬。在微流控裝置中，流體流動可以通過蠕動泵、注射器泵、重力或靜水壓力以及壓力發生器產生，模擬體內液體流動的范圍及其在細胞表面的相關剪切應力。與靜態條件相比，在連續流動和循環應變下，Caco-2 細胞經歷細胞分化、極化、絨毛形成、屏障完整性維持、黏液產生等。GOC器件的剪切應力一般取值在0.01 ～ 0.06 dyn/cm2之間，大多數模型中的剪切應力是使用蠕動泵引入的，但這些裝置體積龐大且吞吐量低。Tan 等[33]用2 個微型蠕動泵克服了低吞吐量的限制，每個泵有8 個泵管路，允許流體通過16 個微通道輸送，通過測量微流控芯片中培養的Caco-2 細胞氨肽酶活性評估其生長和分化速度，與第21 天的靜態培養的Transwell 系統相比，微流控裝置中的Caco-2 細胞在第5 天顯示出更高的氨肽酶活性。盡管該系統具有簡單、高通量的特點，但這些模型在重現定義的流速方面是有限的。Kim 等[34]開發了一個具有流體流動和施加循環機械應變的腸芯片模型。該裝置由兩個微通道組成，兩側有兩個空心腔室，在空心腔室中施加真空，使分離通道的多孔膜單向延伸。該研究發現，流體流動和周期性機械應變的結合導致了褶皺的形成，這些褶皺再現了腸絨毛的結構，并且該系統中使用的Caco-2 細胞顯示出極化柱狀形態，大小與體內上皮細胞相似。

2.3 機械力刺激

在消化過程中，蠕動是由平滑肌與腸神經系統協同作用，在整個胃腸道內產生的食物的不自主的、周期性的推進。蠕動有助于食物消化、營養吸收和腸排空，但也對上皮產生剪切力和徑向壓力。研究表明，機械拉伸對于準確模擬人體腸道生理、允許細胞分化和防止細菌過度生長至關重要[35]。Jing 等[36]提出并構建了一種基于循環變化流體壓差原理的新型蠕動腸模型，通過使用多通道、計算機控制的氣動泵同時實現了腸道微系統的流體流動和蠕動，考察了蠕動和流體流動對該裝置腸上皮細胞生長和分化的影響。結果表明，微流體裝置中的周期性蠕動加上流體流動顯著促進了腸上皮細胞的增殖以及糖萼和微絨毛的分泌。此外，腸上皮細胞的屏障、吸收和代謝功能以及細胞分化也受到芯片上周期性蠕動和流體流動的影響。Fang 等[37]開發另一款包含200 個依次連接的橫向微孔陣列芯片，通過調節微孔周圍的氣道內部氣壓，從而實現孔內類器官的周期性收縮與舒張，模擬腸道的蠕動。研究結果發現，在蠕動環境中長成的人結腸腫瘤類器官具有更均勻的尺寸分布，對該納米膠束的攝入量顯著降低。Grassart 等[38]通過循環拉伸模擬腸道蠕動，研究蠕動狀態是否會影響人類志賀菌在3D 結腸上皮內的傳染性。研究表明，與非機械刺激條件相比，拉伸力（蠕動）的應用顯著提高了約50%的感染率，蠕動運動促進了細菌入侵。

2.4 氧氣梯度產生

腸上皮富含含氧血液，對于增強絨毛的營養吸收和加速針對病原體的免疫反應至關重要。人體腸道是多種微生物群落的宿主，腸道微生物群在腸道的消化和吸收功能中發揮著重要作用[39]。HuMiX實現了腸道模型中氧氣濃度梯度的變化，允許Caco-2 細胞和厭氧菌之間的共培養，在體內重現轉錄、代謝和免疫特征[28]。Shin 等[40]開發了一種缺氧-氧氣接口（AOI 芯片），將缺氧培養基從細菌生長的上通道灌注到腸細胞生長的下通道。實驗結果表明，上皮細胞層的存在和管腔微通道中的流量依賴性調節對于在AOI 芯片中產生穩態垂直氧梯度是必要且充分的。另一個包含高分辨率溶解氧監測的GOC 模型是腸芯片，它有6 個傳感器盤，在模型的頂部和底部固定有氧淬滅熒光顆粒，允許實時監測氧水平。這種GOC 模型有一個中央厭氧室，經常用飽和的5% CO2沖洗，維持上腔內低氧水平。使用這款厭氧腸道芯片，Jalili-Firoozinezhad等[41]也證明厭氧條件比好氧條件在生理上能保持更高的微生物多樣性。表1 概括了常見的腸道吸收芯片模型及其應用。

表1 腸芯片模型的主要組成和應用

3 腸道芯片模型的應用

3.1 腸炎模型的構建

腸炎是一種在發達國家和發展中國家都具有高發病率的疾病，炎癥性腸?。↖BD）已成為全球性問題，主要包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病兩大類。研究人員發現通過添加細胞因子混合物，例如，白介素-1β、腫瘤壞死因子-α 和干擾素γ[46-47]，或通過與外周血單核細胞共培養可以在體外模擬腸道炎癥[35]。

Kim 等[35]在腸芯片中引入致病性大腸桿菌和人單核巨噬細胞構建了相應的腸炎病理模型，并且觀察到黏液層損傷、屏障損傷及炎性因子大量表達等炎癥反應。之后Shin 等[48]又通過在腸腔引入葡聚糖硫酸鈉（DSS），首次在體外構建了DSS 腸炎損傷及恢復模型，利用該模型作者證明了氧化應激反應是炎癥損傷的前提。研究發現蠕動的微流體模型可以重現在小鼠模型中相應的結腸炎，并能觀察到的屏障完整性和絨毛結構的破壞。使用來自致病性大腸桿菌的脂多糖激活單核細胞，Caco-2 細胞被誘導分泌促炎細胞因子，進而損害屏障完整性，從而模仿IBD 病理學特征。此外，促炎信號可以促進中性粒細胞的募集，從而進一步加劇腸道損傷。重要的是，研究人員發現DSS 暴露前給予益生菌可以維持腸道屏障，而在DSS 后添加細菌時，腸道屏障功能會喪失[49]。這些結果表明，利用體外腸芯片建立腸炎病理模型，可以為腸炎病理機制研究及其治療藥物篩選提供更接近體內腸道環境的研究平臺。

3.2 藥物吸收和轉運

與傳統體外腸道模型相比，腸芯片具有高度還原人體腸道微環境、連續的液體流動和高通量篩選的優勢[50]。Imura 等[42]開發了一種基于微流控芯片的模擬腸道的系統，該芯片由載玻片、半透膜和PDMS 組成。以熒光測定結果評價藥物滲透性試驗，結果顯示環磷酰胺能滲透腸屏障，其滲透系數較高，而路西法黃不能在腸壁吸收，其滲透系數較低。這些結果與傳統方法的結果一致，證明了該款芯片評估藥物吸收的可行性。

Kulthong 等[51]分別使用傳統的Transwell（靜態）和腸芯片（動態）模型，比較高滲透性化合物（安替比林、酮洛芬和地高辛）和低滲透性化合物（阿莫西林）的轉運，并使用HPLC 或LC-MS 測定這些化合物在靜態和動態條件下的轉運結果。結果顯示，相對于靜態條件，腸芯片的藥物攝取較低，其滲透性值與生物制藥分類系（BCS）一致。同樣，在接種Caco-2 細胞的微流體裝置中，幾種化合物（姜黃素、甘露醇、葡聚糖、咖啡因和阿替洛爾）的吸收率與體內吸收的研究數據相當。

抗癌藥物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）是伊立替康經羧酸酶轉換后的活性代謝物，其抑制拓撲酶Ⅰ的活性遠大于伊立替康，但其具有低水溶性和低跨黏膜通透性的缺點。研究人員發現將其合成為親脂性前體藥物能解決低口服生物利用度問題。Pocock 等[52]開發了一款基于微流體的腸道芯片（IOAC）模型，該模型可用于研究親脂性前藥的結構-滲透性的關系（見圖3）。IOAC 模型利用外部機械力作用，誘導上皮細胞單層產生特異性分化，使細胞表面呈現微絨毛表達起伏形態的屏障功能，這比傳統的Transwell 模型更具生物相似性。用不同鏈長和不同分子位置的脂肪酸酯修飾SN-38，觀察到SN-38 前藥溶解度與滲透性系數之間有良好的相關性。論證了模仿腸道上皮關鍵特征的IOAC模型在篩選親脂性前藥方面具有顯著潛力[52]。

圖3 IOAC 裝置及對難溶SN38 和前藥的體外滲透系數與計算的油-水分配系數比較[52]

4 結論和展望

近年來，腸道芯片模型在芯片設計、微環境、微流體操控和細胞培養技術方面已經取得了重大進展，為胃腸道疾病機制研究和個體化治療的發展提供了新的模型。但該技術本身仍然面臨許多挑戰。

腸上皮細胞的來源對于腸芯片的研究至關重要，Caco-2 是目前應用最廣泛的模擬腸上皮屏障的細胞系，但Caco-2 細胞缺乏黏液生成層，很難控制其分化[53]。此外，Caco-2 細胞表現出與人類腸道組織不同的轉運蛋白表達[54]。因此，腸芯片還需要進一步研究，以確保上皮細胞系的代謝和轉運蛋白活性與在體內觀察到的相似。盡管微流控腸芯片模型模擬了人類腸道的許多不同表型和反應，但缺乏在某些疾病中發揮重要作用的特征。例如，平滑肌細胞表達Toll 樣受體，并且可以通過調節神經膠質源性神經營養因子的產生來調節神經元的完整性。因此，未來的腸道芯片模型構建中應考慮更多因素，例如肌肉和神經系統細胞[20]，使得模型具有更多的腸道特征和功能，更接近真實的生理環境。腸芯片研究的另一個挑戰是材料的選用。盡管PDMS 在微流控器官裝置制備方面具有明顯的優勢，但PDMS 可能吸附介質中存在的小分子、藥物或其他熒光標記物，從而降低溶質分子濃度的重現性[55]。為了克服這一點，PDMS 及其替代聚合物（例如聚氨酯、苯乙烯嵌段共聚物）的表面改性或基于ECM 的材料更適用于預測藥物生物利用度或吸收的研究[20]。目前，水凝膠廣泛應用于腸道微流控模型，可以提供類似于體內細胞-細胞外基質相互作用的機械和生化環境，促進類組織結構的形成[55]。但其同時存在一些問題，如不穩定、易降解等。因此在未來的腸芯片研究中，尋找開發更優的PDMS替代材料也是非常有必要的。