高效液相色譜法同時測定純陽正氣膠囊中3 種成分的含量

文 藝，蒙露露，王寶藝，韋飛雪，鄧 鵬，柳榮英

（1.八加一藥業股份有限公司, 廣西 桂林 541000；2.桂林市食品藥品檢驗所, 廣西 桂林 541012；3.桂林醫學院藥學院, 廣西 桂林 541000）

純陽正氣膠囊是由廣藿香、姜半夏、土木香、陳皮、丁香、肉桂、蒼術、白術、茯苓等十七味中藥制成的膠囊劑，主要用于治療暑天感寒受濕、腹痛吐瀉、胸膈脹痛、頭痛惡寒、肢體酸重。純陽正氣膠囊是藥典中收錄的純陽正氣丸[1]的改良劑型，現代醫學多用于改善腸胃功能、止瀉等急性腸胃炎癥狀，其處方來源于晚清醫書《飼鶴亭集方》，其中的陳皮理氣健脾，活性成分橙皮苷可調節腸道菌群[2]、抑制腸道炎癥[3]；肉桂能改善消化系統，活性成分桂皮醛抗潰瘍、抗菌[4]；丁香溫中、暖腎、降逆，活性成分丁香酚抑菌、鎮痛[5]；各處方藥材藥性相輔相成。純陽正氣膠囊參照純陽正氣丸在質量標準的含量測定項下均只有橙皮苷的測定，不能全面評價該制劑的質量。多組分的定量分析已成為中成藥質量控制的有效手段[6-7]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時對純陽正氣膠囊中的橙皮苷、桂皮醛和丁香酚這3 個活性成分進行測定，完善其質量控制方法，為純陽正氣膠囊質量標準的提升提供了依據。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent1260 Infinity 型高效液相色譜儀、DAD檢測器（Agilent Technologies 公司）；XS205DU 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-600E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

圖1 純陽正氣膠囊HPLC 圖

1.2 試藥

純陽正氣膠囊（ 批號： 200901、 201201、210201、211001，八加一藥業股份有限公司）；橙皮苷對照品（批號：110721-202019）、桂皮醛對照品（批號：110710-201821）、丁香酚對照品（批號：110725-201917）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為去離子水。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm,4 μm）；流動相為乙腈-水，梯度洗脫程序為0 ～5 min，15%乙腈；5 ～10 min，15%～25%乙腈；10 ～12 min，25%～ 50%乙腈；12 ～16 min，50%～15%乙腈；柱溫為35 ℃；檢測波長為284 nm；流速為1.0 ml/min，進樣量為10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

取橙皮苷、桂皮醛和丁香酚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成濃度為1 125、510、991 μg/ml的標準儲備液。精密吸取橙皮苷儲備液5 ml、桂皮醛儲備液1.25 ml、丁香酚儲備液4 ml 置于同一25 ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成混合對照品儲備液。精密吸取上述混合對照品儲備液適量，加甲醇稀釋制成含橙皮苷36 μg/ml、桂皮醛4.08 μg/ml和丁香酚25.37 μg/ml 的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10 粒內容物研磨均勻，取粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲20 min，放冷至室溫，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按純陽正氣膠囊處方及制劑工藝，分別制成缺陳皮、缺肉桂和缺丁香的陰性樣品，取陰性樣品按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性及系統適用性考察

分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖及相關參數。橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的保留時間依次為6.983、10.399、11.729 min，分離度均大于1.5，理論塔板數按橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰計算分別為54 733、59 111 和83 997，且陰性樣品在對照品相應位置沒有吸收峰，表明其他成分對測定無干擾，結果見圖1。

2.6 線性關系考察

分別精密吸取“2.2”項下的混合對照品儲備液0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項下的色譜條件進行測定。以峰面積Y對濃度X（μg/ml）進行線性回歸，結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.7 精密度試驗

取“2.2”項下制備的混合對照品溶液， 按“2.1”項下的色譜條件進行測定，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰面積RSD 分別為1.21%、1.14%、0.96%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取“2.3”項下制備的供試品溶液（批號：210201），分別于0、2、4、6、8、12、24 h 按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄峰面積。結果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚峰面積的RSD 分別為1.28%、1.38%、2.77%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.9 重復性試驗

取同一批次的純陽正氣膠囊（批號：210201）6 份，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算含量。結果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均含量分別為4.14、0.45、3.06 mg/g，RSD 分別為1.43%、1.71%、1.63%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批次的純陽正氣膠囊9 份（批號：210 201），每份約0.1 g，分別精密加入混合對照品儲備液適量，配制成低、中、高3 個不同濃度的回收率溶液，每個濃度3 份，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法操作，按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄峰面積并計算回收率。結果顯示，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均回收率分別為101.9%、98.0%、101.2%，RSD 值分別為2.3%、1.6%、2.3%(n=9)。

2.11 樣品含量測定

取4 批樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算含量，結果見表2。

表2 4 批次樣品含量測定結果(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

對于流動相的選擇，本實驗參考相關研究分別考察了乙腈-0.5%磷酸溶液[8]、甲醇-水[9]、乙腈-水[10]作為流動相時對橙皮苷、桂皮醛、丁香酚色譜峰的影響。其中，乙腈-0.5%磷酸流動相無法使3 種成分分離；甲醇-水流動相峰形矮且不尖銳，基線不平穩；乙腈-水流動相效果最佳，3 種成分分離度均大于1.5，峰形良好。對于檢測波長的選擇，DAD 檢測器全波長掃描顯示橙皮苷、桂皮醛、丁香酚分別在282、290、284 nm 波長處有最大吸收，3 種成分最大吸收波長相近，故選擇284 nm 作為檢測波長，不影響3 種成分的吸收。

3.2 提取條件的考察

純陽正氣丸對橙皮苷的含量測定采用了加熱回流的方法，因此本實驗分別考察了回流和超聲兩種提取方式。加熱回流提取時桂皮醛含量的RSD較大，回收率差，考慮桂皮醛屬于易揮發性物質[11]，受溫度影響大，文獻[12]報道也多以超聲提取為主，最終選擇以超聲作為提取方式，分別考察了超聲時間和提取溶劑。分別比較20、30、40 min 超聲的提取效果，20 min 為最佳提取時間；考慮橙皮苷、桂皮醛和丁香酚在溶劑中的溶解度，分別比較了甲醇、乙醇、稀乙醇和50%乙醇的提取效果，結果顯示甲醇提取時指標成分含量較高，且無峰干擾，提取效果好。最后確定以甲醇作為提取溶劑，超聲提取20 min 的提取方法，簡單便捷、結果準確。

3.3 含量測定結果分析

對4 批純陽正氣膠囊中橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的含量進行分析，結果顯示不同批次樣品橙皮苷和桂皮醛的含量差異較大，丁香酚的含量波動較小，這有可能與不同來源和不同批次藥材的質量有關，這提示我們在制訂含量限度的時候除了要控制工藝，還要充分考慮藥材對終產品的影響，本次試驗只測定了4 批不同批次的純陽正氣膠囊樣品，后續將增加更多不同批次的樣品進行測定研究，提升純陽正氣膠囊的質量標準。