中藥復方參麻頸復顆粒治療腦梗死的網絡藥理學研究

徐 熠，何瑞華，黃 瑾

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥劑科, 上海 200437）

參麻頸復顆粒是上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院經典的自制制劑，由丹參、山茱萸、梔子、續斷等10 余味藥物組成，具有活血通絡，寧神安腦，健筋壯骨的功效。通過益氣活血、滋陰降火、補肝益腎、溫脾化痰以達到氣血雙補、上中下統調的治療作用[1]，多用于頸椎病、腦供血不足、頭昏脹痛、夜寐夢擾等。腦梗死屬于中醫“中風”范疇，是指各種原因引起的腦部血液供應障礙，使局部腦組織發生不可逆性損害[2]，主要采用溶栓、抗血小板或抗凝、調脂藥以及腦保護藥等治療手段。參麻頸復顆粒作為上海中醫藥大學附屬岳陽醫院（本院）的特色自制制劑，在數十年的臨床應用中發現其對腦梗死患者的預后有明顯的治療作用，研究表明該方中當歸[3]、川芎[4]、蒺藜[5]、杜仲[6]、天麻[7]等藥味均對腦梗死有一定的療效，但作用機制尚不清楚。本研究借助網絡藥理學方法，對參麻頸復顆粒治療腦梗死的作用機制進行研究，預測可能的活性成分、作用靶點及通路，為該制劑的進一步研發提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 參麻頸復顆?；钚猿煞趾Y選及對應靶點的收集

參麻頸復顆粒共由十二味中藥組成，本研究利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP 數據庫）[8]、中藥百科全書數據庫（ETCM 數據庫）[9]、中醫藥資料庫檢索參麻頸復顆粒中組成中藥的化學成分，TCMSP 數據庫沒有收錄中藥天麻和首烏藤，因此天麻的化學成分從ETCM 數據庫檢索，首烏藤的化學成分從中醫藥資料庫數據庫檢索[10-11]，鑒于不同數據庫中化學成分名稱可能不同，因此將檢索的化學成分根據其CAS 匹配到 TCMSP，找到該化學成分并獲取其作用靶點。其余十味藥通過TCMSP 查找并導出用于篩選活性成分的相應數據，根據參數的口服生物利用度( oral bioavailability,OB) 和類藥性( drug-likeness, DL)[12]，以OB≥30%且DL ≥0.18 作為條件篩選出活性成分，再利用TCMSP，關聯相應的靶點，得到潛在靶點蛋白，并通過UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）[13]匹配靶點蛋白所對應的基因。

1.2 參麻頸復顆?；钚猿煞?預測靶點網絡的構建

將參麻頸復顆粒的活性成分及潛在靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建參麻頸復顆粒的活性成分-預測靶點網絡。

1.3 腦梗死相關靶標蛋白質的收集

基于OMIM 數據庫[14]檢索腦梗死相關靶蛋白基因，以腦梗死（cerebral infarction）和缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke）為關鍵詞進行靶標檢索，所有靶標均通過UniProt 數據庫獲取其UniProt ID 信息。

1.4 參麻頸復顆粒相關的蛋白互作網絡構建

將OMIM 中收集到的與腦梗死相關的所有蛋白質，導入STRING 數據庫，導出分值＞0.7 的高置信度蛋白相互作用數據，用Cytoscape 3.7.2 軟件構建與治療腦梗死有關的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI) 網絡。

1.5 網絡合并

利用Cytoscape 3.7.2 軟件中Merge 功能，將參麻頸復顆?；钚猿煞?預測靶點網絡與腦梗死的蛋白質-蛋白質相互作用網絡合并，確定兩者是否存在交集，通過Cytoscape 3.7.2 軟件構建參麻頸復顆?；钚猿煞?潛在靶點網絡，系統分析參麻頸復顆粒治療腦梗死的潛在作用靶點。

1.6 參麻頸復顆粒治療腦梗死預測靶標富集分析

采用DAVID 數據庫( https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[15-17]，對與腦梗死相關的參麻頸復顆?；钚猿煞?潛在靶點網絡中的蛋白進行基于KEGG 的生物通路富集分析，并利用OmicShare 對通路進行可視化，采用DAVID 數據庫，對與治療腦梗死相關的參麻頸復顆?；钚猿煞?潛在靶點網絡中的蛋白進行GO 功能富集分析。

2 結果和分析

2.1 參麻頸復顆?；钚猿煞趾Y選

在TCMSP 數據庫中對十二味藥的活性成分進行檢索，共得到183 個潛在有效成分（表1），其中有13 個為共有成分（表2）。

表1 參麻頸復顆粒中藥對應潛在有效成分個數

表2 參麻頸復顆粒中藥共有潛在有效成分

2.2 參麻頸復顆?；钚猿煞?靶點網絡的構建

將篩選出的參麻頸復顆粒183 個潛在有效成分導入到TCMSP，查找相應的靶點，得到1 785 個潛在靶點蛋白，并通過UniProt 數據庫匹配其蛋白所對應的基因。將結果導入到Cytoscape 3.7.2 軟件中進行網絡構建，得到參麻頸復顆粒主要活性成分靶點網絡（見表1 和圖1）。該網絡共有519 個節點、1 927 條邊，矩形方陣中淺藍色菱形表示單味藥的作用靶點、藍色菱形表示共有的作用靶點、八邊形圖標表示參麻頸復顆?；钚猿煞?、黃色箭頭圖標表示共有活性成分。參麻頸復顆粒的活性成分按度值排序，前四名分別為槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、豆甾醇。該網絡的構建提示參麻頸復顆粒的組成中藥均具有多活性成分、多靶點的特點。

圖1 參麻頸復顆粒主要活性成分-靶點網絡

2.3 腦梗死相關靶點信息的收集和篩選

在OMIM 數據庫檢索與腦梗死相關的基因，共檢索到216 個相關基因靶點。參麻頸復有效成份的1 785 個潛在靶點蛋白，刪除重復項后得到384個相關靶點。將成分靶點和疾病靶點輸入BioVenn在線軟件進行交集分析，繪制韋恩圖，篩選出腦梗死與參麻頸復活性成分共有30 個共同靶點（圖2）。

圖2 參麻頸復活性成分與腦梗死共同靶點韋恩圖

2.4 參麻頸復顆粒治療腦梗死靶標蛋白-蛋白相互作用分析及網絡可視化構建

將參麻頸復顆粒預測所得的基因與腦梗死相關基因進行映射后得到共有靶基因，輸入STRING數據庫進行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析過程中，選取物種為Homosapiens ，并將蛋白-蛋白互作得分＞0.7 的基因輸入Cytoscape 3.7.2 進行網絡可視化，共有30 個節點，253 個連線。應用軟件中的Network analysis plugin 對網絡圖中節點（Node）進行統計，分析其在圖中的作用，自由度（Degree）越大，該節點在網絡中的生物功能則越多。同時，顏色越深代表該節點自由度較大、生物功能較多（圖3）。進一步對與腦梗死潛在靶點網絡進行分析，得到網絡中潛在靶點的度值，網絡中有20 個靶點的度值＞16.86（平均度值），可能為參麻頸復顆?；钚猿煞职l揮作用的潛在靶點。

圖3 參麻頸復顆粒治療腦梗死的PPI 網絡圖

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 平臺進行GO 功能富集分析，對與腦梗死相關的參麻頸復顆?；钚猿煞?潛在靶點網絡中涉及的30 個蛋白在基因功能中的作用進行研究，得到了151 個GO 條目，根據P＜0.05，篩選出117 個GO 條目，針對前10 條BP 分析、CC 分析、MF 分析繪制直方圖（圖4）。其中，生物過程相關的條目最多，有74 個，結果顯示參麻頸復顆粒主要對基因表達的正向調控、白細胞遷移、炎癥反應、一氧化氮生物合成過程的正向調節等方面影響較大；分子功能相關的條目23 個，結果顯示參麻頸復顆粒主要對蛋白質結合、鈣離子結合、受體活性、細胞因子活性等方面影響較大；細胞組成相關的條目20 個，結果顯示參麻頸復顆粒主要對細胞外間隙、質膜、細胞表面、胞外區等方面影響較大。

圖4 參麻頸復顆粒治療腦梗死潛在靶點的GO 富集分析

利用DAVID 平臺的KEGG 通路富集分析功能，對與腦梗死相關的參麻頸復顆?；钚猿煞?潛在靶點網絡中涉及的蛋白信號通路中的作用進行研究，得到19 條信號通路，包括補體和凝血級聯通路、NF-κB 信號通路、HIF-1 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、HTLV-I 感染、神經活性配體受體相互作用等。

2.6 藥物-化合物-靶點-通路圖的構建

基于上述信息，構建活性成分-靶點-通路圖，以全面闡述參麻頸復顆粒腦梗死的作用機制（圖5、表3），圖中有74 個節點和188 條邊，黃色菱形代表參麻頸復顆?；钚猿煞?，綠色圓形代表潛在靶點，紅色箭頭代表信號通路，邊代表三者之間的相互作用。從結果可以看出參麻頸復方中槲皮素、β-胡蘿卜素、柚皮素、西紅花酸、大黃素、報春色素苷、表兒茶素等活性成分可能是參麻頸復治療腦梗死的關鍵成分。

圖5 參麻頸復顆粒治療腦梗死的“活性成分-靶點-信號通路”網絡圖

表3 參麻頸復顆?；钚猿煞謱φ毡?/p>

3 討論

中藥復方具有多活性成分、多作用靶點的特性，通過網絡藥理學手段，可以有效預測參麻頸復顆粒治療腦梗死的作用機制。通過藥物-化合物-靶點-通路網絡的構建，可以發現參麻頸復顆粒中的陳皮、川芎、梔子、蒺藜、杜仲、天麻、首烏藤、山茱萸等藥味中的槲皮素[18]、β-胡蘿卜素[19]、西紅花酸、柚皮素[20]、大黃素、報春色素苷、表兒茶素等活性成分可改善腦梗死患者的預后情況。研究顯示槲皮素可通過抑制細胞凋亡和氧化應激水平，改善腦梗死受損神經功能，改善腦纖溶功能。β-胡蘿卜素能阻止腦組織因自由基激活的氧化損傷，保護低密度脂蛋白免遭氧化損傷，在降低腦血管病危險因素方面有一定的作用。柚皮素可降低缺血再灌注損傷側腦組織含水量、縮小腦梗死體積、降低腦組織MDA 含量，提高SOD 活性，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。通過GO 功能富集結果提示，參麻頸復顆?？赡芡ㄟ^作用于纖溶酶原激活物抑制物1、血栓調節蛋白、凝血因子Ⅶ、血管內皮生長因子A 等多個靶點，干預血小板激活、改善受損神經功能、保護腦缺血再灌注損傷，從而有助于腦梗死患者的恢復。

腦梗死后出現的炎癥反應與腦損傷存在一定的關系，KEGG 生物通路富集分析結果提示參麻頸復顆粒在干預腦梗死相關通路中，TNF 信號通路和NF-κB 信號通路起到了治療腦梗死后炎癥反應的重要作用。 IL-6 靶點和TNF 信號通路是腦梗死后重要的炎癥反應通路[21]。NF-κB 信號通路對炎癥反應具有顯著的影響，是腦缺血后炎性級聯反應的始動因素[22]，NF-κB 被激活，使其調控的靶基因轉錄活性升高，可誘導TNF 和IL-6 等炎癥因子的產生，促進炎癥發生發展和誘導細胞凋亡加重腦缺血的損傷。因此，參麻頸復顆?？赡苁峭ㄟ^抑制NF-κB、TNF 等炎癥信號通路，起到保護腦血管損傷的作用。

HIF-1 信號通路參與腦缺血組織的血管再生和血腦屏障的維持[23]，可以通過調控下游基因的轉錄，對抗低氧造成的細胞功能紊亂。HIF-1 可以調控10 余種下游基因的表達和轉錄，進而對多種細胞的多種生物學活動有重要影響[24]。因此，參麻頸復顆?？赡芡ㄟ^調節HIF-1 信號通路促進對腦血管組織的再生，維持腦梗死患者的血腦屏障，改善腦梗死患者的預后情況。

本研究運用網絡藥理學的技術和方法，通過中藥活性成分的篩選、靶點預測、網絡構建與分析，從“藥物-化合物-靶點-疾病”的關聯性對中藥復方參麻頸復顆粒治療腦梗死的相關作用機制進行分析，預測參麻頸復顆粒治療腦梗死的主要活性成分、作用靶點及信號通路，為進一步的實驗驗證提供依據。