九味生化顆粒制劑的穩定性試驗研究

趙麗萍 任建花

（酒鋼醫院藥學部，甘肅 嘉峪關 735100）

九味生化顆粒是酒鋼醫院根據臨床需要而創新研發的純中藥制劑，前期已對其主要成分川芎、益母草、山楂、紅花、桃仁、甘草進行了薄層色譜法鑒別，對其主要成分阿魏酸采用高效液相色譜（HPLC）法進行含量測定。本次研究主要為保證九味生化顆粒成品質量，對本品的吸濕性、高溫、強光照射、加速及長期穩定性開展試驗研究，考察不同批次的樣品外觀、性狀、鑒別、水分、含量的變化，分析藥品穩定性試驗數據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器AUW220D 型電子分析天平（十萬分之一）；ZF-20A 型暗箱四用紫外分析儀；LC-2010AHT 型高效液相色譜儀。

1.2 試劑與藥品對照品：阿魏酸，批號：110773-201614；對照藥材：川芎、益母草、紅花、桃仁、山楂，批號依次為：120918-201612、120912-201209、120907-201713、120953-201407、編號YJ-121626，均購自中國食品藥品檢定研究院。試劑：乙腈為色譜純，磷酸，超純水。3 批樣品批號分別為：20180325、20180326、20180327。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 試驗色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP，規格：150 mm×4.6 mm、5 μm；流動相：0.085%磷酸水溶液-乙腈（83∶17），流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測波長：316 nm。

2.1.2 對照品、供試品、陰性溶液的制備

2.1.2.1 阿魏酸對照品溶液的制備 精密稱取適量阿魏酸對照品，加70%甲醇溶解成8 μg/mL的溶液，即得阿魏酸對照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品粉末10.0 g（過80 目篩），置于錐形瓶（250 mL）中，加入100 mL甲醇溶液，稱定重量；水浴回流提?。?0 min），放冷至室溫；用甲醇補足回流損失，震蕩均勻；用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，收集續濾液。

2.1.2.3 陰性對照品溶液的制備 取陰性對照樣品粉末（不含當歸）10.0 g，制備方法參考“2.1.2.2”。

2.1.3 線性關系考察采用高效液相自動進樣器分別吸取上述對照品溶液10 μL 注入液相色譜儀。以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，阿魏酸在進樣量0.081～1.620 μg線性關系良好，回歸方程為Y=58 429X-0.2199，r=0.996。

2.1.4 穩定性試驗取同一供試品溶液，每隔1 h 進樣10 μL，測定峰面積并計算阿魏酸的相對標準偏差（RSD）。阿魏酸RSD 值為1.48%，供試品溶液12 h 內穩定。

2.1.5 回收率試驗稱取6 份已知含量的樣品約10 g，分別精密加入阿魏酸對照品溶液，制備方法參考“2.1.2.2”，計算出回收率平均值為97.9%。

2.2 定性鑒別方法與結果

2.2.1 川芎鑒別稱取樣品15 g 置于圓底燒瓶，加入40 mL 乙醚溶解；回流60 min，濾紙濾過；濾液揮干成殘渣，再加入2 mL乙酸乙酯溶解，作供試品溶液。取陰性樣品（缺川芎）15 g，取1 g 川芎對照藥材，同法制成對照溶液（陰性對照、川芎對照）。

照薄層色譜法（TLC）（《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗，取10 μL 點樣管吸取上述3種溶液，分別點在同一硅膠G薄層板（GF254），展開劑為正己烷-乙酸乙酯（3∶1）；展開距邊緣線1 cm 時取出，晾干，置ZF-20A型暗箱四用紫外分析儀中檢視（波長254 nm）。見圖1。3批樣品與川芎對照藥材的色譜位置上，顯相同顏色的暗色斑點，而陰性相應位置無斑點[1]。

圖1 川芎的薄層色譜圖

2.2.2 益母草鑒別稱取樣品20 g 研磨成粉末后，加入50 mL 乙醚，振搖提取10 min，提取液用濾紙濾過；揮干至殘渣，再加入1 mL甲醇溶解，作供試品溶液。取益母草對照藥材1 g，取陰性樣品（缺益母草）20 g，同上法制成對照溶液（陰性對照、益母草對照）。

取5 μL 點樣管吸取上述3 種溶液，分別點在同一硅膠G 薄層板上，展開劑為正己烷-乙酸乙酯（4∶1）；展開距邊緣線0.5 cm 時取出，晾干，置ZF-20A 型暗箱四用紫外分析儀中檢視（波長365 nm）。見圖2。3 批樣品與益母草對照藥材的色譜位置上，顯相同顏色的淡藍色熒光斑點，而陰性相應位置無斑點[1]。

圖2 益母草的薄層色譜圖

2.2.3 山楂鑒別稱取樣品20 g 研磨成粉末后，加入50 mL 乙醚，浸泡30 min，超聲處理5 min，濾紙濾過；濾液濃縮至殘渣，再加入1 mL甲醇溶解。取山楂對照藥材1 g，陰性樣品（缺山楂）20 g，同上法制成對照溶液（陰性對照、山楂對照）。

取5 μL 點樣管吸取上述3 種溶液，分別點于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10∶2∶0.5）；展開距邊緣線1.5 cm 時取出，晾干，置ZF-20A 型暗箱四用紫外分析儀中檢視（波長365 nm）。見圖3。3批樣品與山楂對照藥材的相同色譜位置上，顯相同顏色的淡藍色熒光斑點，而陰性對照相應位置無斑點[1]。

圖3 山楂的薄層色譜圖

2.2.4 紅花鑒別稱取樣品25 g 研磨成粉末后，加入50 mL的80%丙酮溶液，振搖提?。?0 min）；室溫0 ℃以下（室內溫度為零下）放置約20 min，濾紙濾過，收集初濾液作為供試品溶液。取紅花對照藥材0.5 g，取陰性樣品25 g（缺紅花），同上法制成對照溶液（陰性對照、紅花對照）。

按照TLC《中華人民共和國藥典》2015 年版一部附錄Ⅵ B 試驗，取5 μL 點樣管吸取上述3 種溶液，分別點在同一硅膠G 薄層板（GF254），展開劑為正己烷-乙酸乙酯（3∶1）；展開距邊緣線2 cm 時，取出晾干，置于ZF-20A 型暗箱四用紫外分析儀中檢視（波長254 nm）。見圖4。3批樣品與紅花對照藥材的相同色譜位置上，顯相同顏色的暗色斑點，而陰性對照相應位置無斑點[1]。

圖4 紅花的薄層色譜圖

2.2.5 桃仁鑒別圓底燒瓶中稱取樣品10 g，加入50 mL 石油醚（60～90 ℃），回流60 min；濾過，留取藥渣，再加入25 mL 石油醚洗滌；棄去石油醚，藥渣揮干后加入30 mL 甲醇溶解，水浴加熱回流60 min；放冷至室溫后濾過，收集濾液作為供試品溶液。另取桃仁對照藥材2 g 和陰性樣品（缺桃仁）20 g，同上法制成作為對照溶液（陰性對照、桃仁對照）。

參照TLC（（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，取5 μL 點樣管吸取上述3 種溶液，分別在同一硅膠G薄層板上條帶狀點樣，將三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）配好后置于5～10 ℃冰箱12 h，待分層后分取下層溶液作為展開劑；展開距邊緣線2 cm時取出，立即噴以磷鉬酸硫酸溶液（磷鉬酸2 g，加水20 mL 溶解，再緩緩加入30 mL 硫酸，混合均勻），將薄層板放置在105 ℃的加熱板上直至斑點顯色清晰。見圖5。3批樣品與桃仁對照藥材在相同色譜位置上，顯相同的條狀藍色斑點，而陰性對照相應位置無斑點［1］。

圖5 桃仁的薄層色譜圖

2.3 制劑穩定性考察

2.3.1 顆粒劑檢驗項目分類參照制劑通則，顆粒劑檢驗項目如下：外觀性狀、薄層鑒別、裝量差異、水分（第二法）、粒度、阿魏酸含量測定、溶化性（該中藥制劑含藥材原粉，不檢查溶化性）。

2.3.2 高濕對九味生化顆粒質量穩定性影響取適量顆粒精稱，置于相對濕度為92.5%的容器中（其底部存放適量硝酸鉀飽和溶液）。分別在第5 天和第10 天進行稱重。由于在相對濕度92.5%放置時，稱重結果表明質量增加大于5%，所以需同法取樣，在相對濕度為75%（其底部存放適量氯化鈉飽和溶液）的環境下考察，稱重結果見表1。吸濕增重數值表明，在高濕環境時，九味生化顆粒因含有大量蔗糖而表現出較強的吸濕性，且易潮解霉變，因此保存需干燥密封［2］。

表1 濕度對九味生化顆粒質量穩定性的影響

2.3.3 高溫對九味生化顆粒質量穩定性影響取適量顆粒置于敞口的干燥玻璃器皿中（厚度不超過2 mm），放置于恒溫箱中（60 ℃），分別在第5 天和第10 天稱取適量樣品，并肉眼觀察外觀性狀，以及進行TLC、水分測定、含量測定等，考察其穩定性。與第0 天數據對比，九味生化顆粒的外觀性狀沒有明顯變色、無分化、無結塊、無色斑形成等，TLC、水分、含量測定均在合格范圍內，說明本品在高溫環境下質量較為穩定［3］。見表2。

表2 九味生化顆粒高溫試驗結果

2.3.4 強光照射對九味生化顆粒質量穩定性影響取適量顆粒置于敞口的干燥玻璃器皿中（厚度不超過2 mm），放置于強光照射試驗箱中，控制光照強度為（4500±500）Lx，紫外強度為83～100 μW/cm2，溫度為室溫25 ℃。分別在第5 天和第10 天秤取適量顆粒，與第0 天數據進行對比。九味生化顆粒的外觀性狀沒有明顯變色、無分化、無結塊、無色斑形成等，TLC、水分、含量測定均在合格范圍內，說明本品在強光照設備環境下質量較為穩定［4］。見表3。

表3 九味生化顆粒強光照射試驗結果

2.3.5 加速試驗對九味生化顆粒質量穩定性影響同時將3 批九味生化顆粒選用鋁塑復合膜包裝后，存放于溫度控制在（40±2）℃、相對濕度為（75±5）%的環境中6個月，分別在第1、2、3、6 個月底稱取適量樣品顆粒，與第0天數據進行對比。顆粒的外觀性狀沒有明顯變色、無分化、無結塊、無色斑形成等，薄層鑒別符合規定，水分和含量略有降低但均未超出標準規定范圍［5］。

2.3.6 長期試驗對九味生化顆粒質量穩定性影響同時將3 批九味生化顆粒選用鋁塑復合膜包裝后，存放于溫度控制在（25±2）℃、相對濕度為（60±10）%的環境中考察24 個月，分別在第0、3、6、12、18、24 個月底稱取適量樣品顆粒，同加速試驗檢測各項目。3 批樣品雖然在保留過程中含量均略有降低，但直至保存到24個月時，其含量的保留率仍然保持在80%以上，各項指標均符合標準規定范圍，說明本品在常溫下質量穩定［6］。

3 討論

九味生化顆粒為酒鋼醫院生產的純中藥顆粒劑，優點是便于攜帶、運輸、貯藏及服用。但是中藥制劑的成分復雜，大多數為親水成分，因此穩定性研究是顆粒劑研發與生產中的關鍵部分。中藥制劑顆粒劑如果貯藏不當，會發生吸潮、沉淀、變質等現象，對藥物的有效成分及含量造成不良的影響，導致藥物極易失效，從而產生毒副作用，影響臨床效果［7］。

此次試驗設計項目均為考察九味生化顆粒的質量穩定性而定。選定薄層鑒別藥物時，由于處方中多種成分相互干擾，如川芎和當歸都含有阿魏酸，澤蘭和焦山楂都含有熊果酸，炮姜處方比例含量較低不適宜作為指標性成分進行鑒別，桃仁和紅花使用《中華人民共和國藥典》中收載的藥材鑒別方法后，陰性有干擾等，重新摸索出了新的試驗方法，選定川芎、益母草、紅花、山楂、桃仁作為薄層鑒別的幾味藥［8］。

鋁塑復合膜包裝后的九味生化顆粒成品分別經高溫、光照強度、6 個月的加速試驗、24 個月的穩定性試驗，結果表明，成品包裝的九味生化顆粒含量下降不超過80%，其他各項考察指標均在質量標準控制范圍內。參照中藥制劑相關要求及穩定性試驗結果分析，將九味生化顆粒的有效期暫定為24個月［4］。本次高濕試驗研究表明，九味生化顆粒在室溫（25±2）℃、相對濕度分別為（92.5±5）%和（75±5%）%的條件下存放10 d，出現部分結塊及霉變現象，表明其有吸濕性，與本品含有大量蔗糖相關。雖然試驗表明，高濕環境對九味生化顆粒的質量穩定性有一定的影響，但由于酒鋼醫院制劑生產環境所處的地理環境較為干燥，故只需在九味生化顆粒制備、分裝與貯存時注意密封保存，環境對其質量穩定性影響不大［9］。