紅麻HcKAN4 基因克隆、表達及在類黃酮合成中的功能

吳法軒 李 秦 楊 昕 李新根 徐建堂 陶愛芬方平平 祁建民 張立武,*

1 福建農林大學作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室 / 農業農村部閩臺作物生物育種重點實驗室 / 福建省作物設計育種重點實驗室, 福建福州 350002; 2 福建農林大學農業農村部東南黃紅麻實驗觀測站 / 福建省麻類種質資源共享平臺 / 福建省南方經濟作物遺傳育種與多用途開發國際科技合作基地, 福建福州 350002

紅麻(HibiscuscannabinusL.)為錦葵科木槿屬的一年生常異花授粉纖維作物, 屬于短日照喜溫類型,主要種植在亞洲的中國、印度、孟加拉國、馬來西亞以及非洲的馬里、貝寧、贊比亞等國家[1]。紅麻屬于韌皮部纖維作物, 具有質地柔軟、吸濕性強、透氣性好、抑菌、易降解等優良特性。在建材、可降解塑料、吸污、飼料、汽車內襯和藥用等領域都有廣泛的應用[2-4]。

類黃酮化合物是植物中具有高度活性的次生代謝產物, 在植物抗氧化、抗病蟲害等方面具有良好效果, 原花青素(proanthocyanidins, PAs)是在植物中廣泛存在的一種類黃酮化合物, 能夠決定植物器官顏色, 并在應對生物和非生物脅迫中發揮重要作用[5]。同時, 花青素可以有效清除自由基, 在抗氧化、抗衰老方面效果顯著[6]。因此深入了解類黃酮在紅麻中的合成及調控過程, 對于培育彩色纖維、增強抗逆性、提高纖維品質具有重要作用。

類黃酮生物合成途徑已被廣泛研究, 參與其生物合成的結構基因己相繼被克隆和鑒定。類黃酮生物合成通路錯綜復雜, 其中先后涉及到十幾個關鍵酶(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFRLDOX、ANS、LAR、ANR、LAC 等)的催化反應[7]。此外, 類黃酮代謝的轉錄調控也被廣泛研究, 涉及到多種轉錄因子(WIP-ZF、MYB、bHLH、WD40、WRKY、MADS)[7-8], 其中以MYB、bHLH 和WD40最為常見, 這 3 類轉錄因子可以以 MYB-bHLHWD40 (MBW)復合體的形式來調控植物PAs 的生物合成[9], 也可以單獨發揮作用, 例如Ding 等[10]發現蘋果的轉錄因子MdMYB28 可以負調控花青素的合成。MYB 轉錄因子決定MBW 復合體的特異性和被激活的基因, 是復合體的核心成員, 可通過過表達MYB就會明顯促進PAs 的生物合成[11]。

在許多植物中, MYB 轉錄因子均已被報道參與類黃酮代謝的調控。例如, 在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中, MYB 類轉錄因子TT2/AtMYB123通過調節ANR、DFR和AHA10的表達來特異調控種皮原花青素的積累[12]。在水稻(OryzasativaL.)中, MYB 轉錄因子OsPL 通過調控花青素代謝使種子耐熱性增加[13]。在苜蓿(Medicagotruncatula)中,MtMYB5和MtMYB14通過與MtTT8和MtWD40-1相互作用形成復合體, 從而激活ANR和LAR的表達來協同調控種子外殼原花青素的積累[14]。MYB 轉錄因子不同成員除了正調控類黃酮的合成外, 也存在對其負調控。例如, 在苦蕎(Fagopyrumtataricum)中, MYB 轉錄因子基因FtMYB11通過與FtSAD2或FtJAZ1的相互作用抑制苯丙烷的生物合成[15]從而抑制類黃酮的合成。擬南芥中AtKAN4基因過表達產生了一個顯性突變系sk21-D, 突變體中的CHS、CHI、F3’H、DFR、LDOX、ANR等類黃酮合成相關基因的表達量均下降,表明AtKAN4基因可廣泛調控擬南芥PAs 生物合成相關基因[16]。

病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)是一種植物用來抵御入侵病毒的自然防御機制, 屬于轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[17]。利用VIGS 技術能夠快速鑒定目標基因沉默后的表型和基因轉錄水平變化,不需要通過穩定遺傳轉化。因此它在功能基因組學研究中有顯著的優勢, 能快速地鑒定目的基因功能。VIGS 的沉默效率受多種因素的影響, 病毒載體的選擇對沉默效率有著較大影響, 目前植物中應用范圍較廣的是煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)。與其他病毒載體相比, TRV 具有沉默效率高和時間長等優點, TRV-VIGS 體系目前已在棉花[18]、亞麻[19]等多種寄主植物中應用[20]。

與黃麻等韌皮部纖維作物相比, 紅麻纖維的纖維素含量較低而木質素含量較高。據報道[21], 有317個淀粉和糖代謝途徑基因可能參與纖維素生物合成,包括CesA、Csls 基因家族。根據相關研究[22]表明,PAL、HCT、C4H、COMT、CAD、4CL 和F3’H 在木質素生物合成起關鍵作用。類黃酮代謝途徑不僅可以獨自影響纖維的發育, 還可能和木質素代謝途徑或者與苯丙烷代謝途徑的其他分支代謝途徑共同地來調控纖維的發育[23]。植物MYB 轉錄因子調控類黃酮代謝和纖維發育的機制復雜多樣[24], 而在紅麻中鮮有報道。本研究以紅麻優良品種‘福紅952’為材料, 基于其全基因組測序數據[25], 克隆獲得一個與擬南芥AtKAN4的同源基因HcKAN4, 通過Gateway 技術構建HcKAN4的VIGS 載體, 獲得基因沉默植株; 結合實時熒光定量PCR, 分析其影響類黃酮合成途徑相關基因的表達情況。這將豐富MYB轉錄因子KAN4 在紅麻類黃酮合成途徑中的研究,為紅麻類黃酮合成及調控的分子機制研究和纖維品質改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以紅麻‘福紅952’為試驗材料, 由福建農林大學麻類遺傳育種與綜合利用實驗室保存提供。大腸桿菌菌株DB3.1、TOP10、農桿菌菌株GV3101、Gateway 入門載體 pDONR207、載體 pTRV1 和pTRV2 等均由福建農林大學麻類遺傳育種與綜合利用實驗室保存。RNA 提取試劑盒和實時熒光定量PCR 試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取和cDNA 合成 使用RNA 提取試劑盒提取‘福紅952’紅麻葉片的總RNA。用超微量分光光度計Nano Drop ND-1000 (Nano Drop, 美國)檢測RNA 樣品濃度, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。用RNA 反轉錄試劑盒將提取的總RNA反轉錄為 cDNA, 反轉錄體系為(5× Fastking-RT SuperMix: 4 μL、Total RNA 50 ng: 2 μg、RNase-Free ddH2O 補足到20 μL), 反應程序為42℃反應15 min、95℃反應3 min, 以cDNA 為模板進行紅麻HcKAN4基因的克隆及實時熒光定量PCR 分析。

1.2.2 紅麻HcKAN4基因克隆 實驗室前期基礎發現HcKAN4基因對類黃酮合成有著調控作用。從已報道文獻[16]和TAIR 數據庫(https://www.arabidopsis.org/)獲得擬南芥AtKAN4 (AT5G42630)蛋白序列。利用AtKAN4 氨基酸序列進行BLASTP 比對分析, 獲得相似性較高的同源基因, 命名為HcKAN4(紅麻基因組數據庫編號:Hc.03G039160)。以紅麻cDNA 為模板設計特異引物克隆HcKAN4基因(附表1)。PCR程序為: 95℃預變性2 min; 95℃變性45 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸30 s, 34 個循環; 72℃延伸10 min。PCR 反應結束后將產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用DNA 純化試劑盒(Vazyme, 中國南京)回收目的條帶, 送尚亞生物技術公司(福州)測序, 并通過DNAMAN 軟件進行序列比對。

表1 NCBI (CDD)鑒定紅麻類黃酮合成基因及其結構域Table 1 Genes related to flavonoid synthesis and their domains identified by NCBI (CDD)

1.2.3 紅麻HcKAN4 蛋白的系統進化樹構建及序列比對分析 在中國國家基因組科學數據中心(National Genomics Data Center)基因組數據庫Genome Warehouse (https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh)中進行BLASTP比對, 得到‘福紅952’紅麻KAN4基因的蛋白質序列,用MEGA11.0 軟件繪制系統進化樹。使用NCBIBlast 在線分析獲得不同物種KAN4基因的同源蛋白序列, 通過多序列比對軟件DNAMAN 對不同植物KAN4 蛋白序列進行比對分析。

1.2.4 紅麻HcKAN4基因表達分析 根據實驗室前期建立的紅麻‘福紅952’不同發育時期根、莖、葉和花等不同組織的轉錄組數據庫, 用R 語言中的pheatmap 函數對‘福紅952’紅麻HcKAN4基因進行電子表達量熱圖繪制。

1.2.5 TRV-VIGS 載體構建 以克隆獲得的HcKAN4基因為模板, 通過primer 5.0 軟件設計位于HcKAN4基因CDS 上約250 bp 特異性片段的引物HcKAN4-SF 和HcKAN4-SR (附表1)。電泳檢測PCR產物并回收目標條帶, 并測序驗證。

pTRV2-HcKAN4 載體構建: 將擴增得到的HcKAN4基因特異性片段、載體pDONR207 和BP酶按BP 反應體系(HcKAN4-250 bp (20 ng μL-1):0.5 μL, pDONR207 vector (40 ng μL-1): 0.5 μL, BP Clonase reaction buffer: 0.25 μL)混勻, 25℃連接12 h,轉化到DB3.1 感受態細胞中, 然后涂布在含有50 μg mL-1慶大霉素的LB 平板上。培養12 h 后挑取單克隆, 進行菌液PCR 檢測。將陽性菌液提取質粒, 命名為 pDONR207-HcKAN4。將質粒 pDONR207-HcKAN4、載體pTRV2 和LR 酶按LR 反應體系(pDONR207-HcKAN4(80～100 ng μL-1): 0.5 μL,pTRV2 (80～100 ng μL-1): 0.5 μL, LR Clonase reaction buffer: 0.25 μL)混勻后, 過夜連接。轉化TOP10 感受態細胞, 37℃培養12 h, 挑取單克隆, 菌液PCR 檢測,菌液送尚亞生物技術公司進行測序, 序列比對正確,提取質粒, 將其命名為pTRV2-HcKAN4。

1.2.6 農桿菌轉化侵染液制備 將 pTRV1、pTRV2、pTRV2-HcKAN4質粒分別轉化根瘤農桿菌GV3101 感受態細胞, 挑取單克隆, 接種到含50 μg mL-1的卡那霉素、50 μg mL-1的慶大霉素和50 μg mL-1的利福平的液體培養基, 28℃培養12 h,菌液PCR 檢測后驗證陽性克隆。將驗證為陽性的菌液, 按1∶100 的比例接種到含有卡那霉素、慶大霉素、利福平的150 mL LB 液體培養基中, 28℃培養12 h, 離心(5000 轉min-1, 10 min)收集菌體。以適當體積的重懸液(10 mmol L-1MgCl2, 10 mmol L-12-嗎啉乙磺酸以及200 μmol L-1乙酰丁香酮)重懸菌體, 液濃度OD600=0.8。將攜帶有pTRV1 載體重懸液與分別攜帶pTRV2、pTRV2-HcKAN4的重懸液按體積比1∶1 混勻, 用于侵染種植7 d 的紅麻真葉。將侵染后的植株置于溫度25℃、光/暗周期(14 h/10 h)的條件下生長, 并用防蟲網遮蓋, 根據生長情況澆營養液。

1.2.7 紅麻類黃酮合成相關基因鑒定 利用擬南芥類黃酮生物合成相關基因蛋白序列與紅麻蛋白質數據庫進行BLASTP 比對, 鑒定得到紅麻類黃酮生物合成相關基因, 分別為HcPAL、HcCHS、HcF3’H、HcFLS、HcF3’5’H。通過NCBI-CDD 分析進一步確認紅麻類黃酮合成候選基因的蛋白質結構域, 再根據實驗室前期建立的紅麻‘福紅952’在不同發育時期不同組織的轉錄組數據(種子萌發后10 d 下胚軸、種子萌發后60 d 莖皮、種子萌發后120 d 莖皮), 分析類黃酮合成相關基因在紅麻莖皮中的表達模式。

1.2.8 紅麻細胞壁合成相關基因的篩選 根據實驗室已發表文獻[25]得到紅麻木質素合成途徑相關基因HcPAL、HcC4H、Hc4CL、HcCOMT、HcHCT、HcCCR、HcCAD、HcC3H、HcF5H, 纖維素合成途徑相關基因HcCSLD12、HcCESA9、HcCESA5、HcCEL6, 分析紅麻生長發育過程中細胞壁合成相關基因的電子表達模式。

1.2.9 實時熒光定量PCR 分析 以紅麻Hc18sRNA為內參基因, 使用熒光定量PCR 儀試劑盒(GOTaqqPCR Master Mix (Promega, 美國)), 在實時熒光定量PCR 儀CFX96 (Bio-Rad, 美國)中進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR 反應體系為cDNA 2.0 μL、左引物和右引物各0.7 μL、SYBR Green I 10.0 μL、ddH2O 6.6 μL, 擴增程序為50℃ 2 min, 95℃ 10 min; 95℃變性15 s, 60℃退火/延伸1 min, 40 個循環。每個樣品設置3 個技術重復, 采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量[26]。采用Microsoft Excel 軟件進行數據處理和作圖, 用SPSS Statistics 25 軟件分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 紅麻HcKAN4 基因克隆與生物學信息分析

以紅麻‘福紅952’葉片cDNA 為模板, 以HcKAN4-F/R為引物克隆獲得HcKAN4基因(圖1-a), 擴增結果和預期片段大小一致?；蚪Y構分析表明(圖1-b),HcKAN4基因包含6 個外顯子、521 bp 的5′非翻譯區(non translated region, UTR)和226 bp 的3′UTR, 編碼322 個氨基酸。預測蛋白分子量為35.38 kD, 等電點(pI)為6.90, 分子式為C1523H2425N449O490S16。該蛋白氨基酸含量較多的有Ser (41 個, 12.7%)、Leu (39 個,12.1%)、Gly (24 個, 7.5%)、Thr (20 個, 6.2%)、Asp (21個, 6.5%), 氨基酸不包含Pyl 和Sec。通過蛋白質序列比對分析表明, 紅麻、棉花、木槿、榴蓮和葡萄的KAN4 蛋白序列比對都包含一段高度保守的氨基酸序列, 屬于MYB 保守結構域, 屬于MYB 家族(圖1-c), 其氨基酸序列與棉花、木槿、榴蓮和葡萄比較發現都具有較高的同源性, 其中與木槿同源性最高,達到87.42%, 說明該基因在錦葵科植物中具有較高的保守性。使用MHMM 軟件對Hc.KAN4蛋白的跨膜結構區進行分析, 發現Hc.KAN4整條肽鏈都在細胞膜外側, 說明不存在跨膜螺旋(附圖 1)。通過MEGA7.0 軟件構建Hc.KAN4蛋白與其他植物KAN4蛋白的系統發育樹, 探究它們之間的同源關系(附圖2)。由圖可知,Hc.KAN4與擬南芥和木槿的同源關系較近, 與油菜、辣椒的同源關系較遠。

2.2 HcKAN4 基因在不同時期不同組織中的表達分析

由圖2-a 可知,Hc.KAN4基因在旺盛生長期(種子萌發后60 d 根、莖皮、莖骨和葉)及工藝成熟期(種子萌發后120 d 莖皮)的表達特征。Hc.KAN4在莖和葉中均有不同程度的表達, 在旺盛生長期根和莖骨中表達低, 而工藝成熟期(種子萌發后120 d)莖皮表達量最高, 說明Hc.KAN4基因具有組織特異性。在種子萌發后120 d 時莖皮中的表達量約為60 d 的12倍, 說明Hc.KAN4基因隨著植物生長在莖皮中發揮著重要作用。分析Hc.KAN4基因在不同發育時期的圓葉(R)、三裂葉(B3)、五裂葉(B5)和七裂葉(B7)葉片的表達特征(圖2-b)發現,Hc.KAN4基因在R7 時具有最高表達量, 是R、B3、B5 時期的8.56 倍、1.21倍、4.86 倍, 表明隨著葉片生長發育, 該基因表達量總體呈升高的趨勢, 推測Hc.KAN4基因可能參與紅麻葉片發育的調控。

2.3 紅麻HcKAN4 沉默載體的構建及農桿菌轉化

為了驗證該基因的功能, 以TRV 作為病毒載體沉默目的基因HcKAN4, 構建TRV-HcKAN4載體并轉化農桿菌GV3101。以紅麻葉片cDNA 為模板進行PCR, 得到一條與預期大小一致的擴增片段, 表明為特異性片段?；厥赵撃康钠魏笸ㄟ^Gateway技術構建 pTRV2-KAN4載體, 經凍融法獲得轉入pTRV1、pTRV2 (空載)、pTRV2-KAN4載體的農桿菌GV3101, 用特異引物進行菌液PCR 鑒定, 結果如圖3 所示, 出現符合預期的條帶, 表明3 個TRV-VIGS表達載體成功轉入到農桿菌GV3101 中。

圖3 紅麻Hc.KAN4 基因重組載體質粒轉化后菌液PCR 檢測Fig. 3 PCR detection of Hc.KAN4 recombinant plasmid transformation in kenaf

圖4 紅麻HcKAN4 的cDNA 和氨基酸序列Fig. 4 cDNA and amino acid sequences of HcKAN4 in kenaf

2.4 TRV-VIGS 誘導HcKAN4 基因沉默的效率檢測

當沉默HcPDS基因的植株開始出現白化表型,隨機選取6 株沉默HcKAN4基因的紅麻植株, 以及長勢與沉默植株一致的3 株空載處理的紅麻植株作為對照。本研究通過qRT-PCR 檢測TRV-VIGS 對紅麻葉中HcKAN4基因表達水平的影響(圖5-a)發現,VIGS 沉默后, 與對照相比, 6 株沉默植株的相對表達量都達到顯著性降低, 沉默效率達到100%。為證實TRV-VIGS 沉默效果是否是整株植物沉默, 隨機選取2 株沉默HcKAN4植株, 取其莖皮和2 株空載處理植株作為對照(圖5-b)。與對照相比, 沉默植株莖皮的相對表達量也出現了降低, 沉默效率100%,說明TRV-VIGS 是整株沉默且沉默效率良好。

圖5 HcKAN4 基因沉默后紅麻植株的沉默效果檢測Fig. 5 Silencing effect detection of individuals after HcKAN4 gene silencing in kenaf

2.5 HcKAN4 基因沉默對類黃酮合成基因表達的影響

2.5.1 類黃酮合成相關基因在不同發育時期莖皮中的表達分析 利用擬南芥類黃酮合成相關基因蛋白質序列, 通過與紅麻蛋白質數據庫BLASTP 鑒定, 得到紅麻類黃酮合成相關基因, 通過NCBI-CDD 對這些基因的結構域進一步分析(表1)。由表1 可知,Hc.CHS蛋白具有PLN03172 super family 結構域,Hc.F3'H具有p450 super family 結構域,Hc.ANS具有PLN03178 結構域,Hc.ANR具有PLN00198 super family 結構域,Hc.F3’5’H具有p450 super family 結構域。

通過對鑒定得到的類黃酮合成基因在紅麻不同時期莖皮的電子表達量進行表達模式分析(圖6)發現, 5 個類黃酮合成基因的電子表達量都隨著生長時間增加在莖皮中的表達量呈顯著性增加的趨勢, 說明類黃酮在植物莖皮的生長發育中起著重要作用。由圖7-a 可知, 紅麻木質素合成相關基因Hc.PAL、Hc.C4H、Hc.COMT、Hc.HCT、Hc.CCR、Hc.CAD、Hc.C3H、Hc.F5H的電子表達量隨著植株生長時間的增加呈顯著性降低的趨勢, 只有木質素合成相關基因Hc.CCT的電子表達量先降低后增加的變化;由圖7-b 可知, 紅麻纖維素合成相關基因Hc.CSLD、Hc.CESA9、Hc.CESA6、Hc.CEL6的電子表達量隨著植物生長時間增加呈顯著性降低的趨勢。說明隨著植株生長時間增加, 莖皮中類黃酮合成基因的電子表達量呈顯著性增加趨勢, 而莖皮中的木質素和纖維素合成相關基因呈顯著性降低趨勢, 類黃酮表達量的增加導致了木質素基因和纖維素合成酶基因表達量的減少, 由此可說明類黃酮相關基因高表達可能不利于紅麻纖維品質改良。

圖6 紅麻類黃酮合成相關基因在不同時期莖皮的表達分析Fig. 6 Relative expression level of genes related to flavonoid biosynthesis at different stages in kenaf

圖7 紅麻纖維素和木質素合成相關基因在不同時期莖皮的表達量Fig. 7 Relative expression level of genes related to cellulose and lignin biosynthesis at different stages in kenaf

2.5.2HcKAN4基因沉默植株類黃酮合成相關基因的表達分析 對HcKAN4基因VIGS 沉默處理的和對照組的紅麻莖皮中的類黃酮合成相關基因進行qRT-PCR 檢測(圖8)發現,HcKAN4基因VIGS 沉默植株中, 類黃酮合成基因HcF3’H、HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR在莖皮的表達量下調達到極顯著水平, 分別是對照組的0.51、0.14、0.23、0.11 倍。表明HcKAN4 基因能夠影響紅麻類黃酮合成基因的表達, 從而影響類黃酮的生物合成。

圖8 紅麻HcKAN4 基因VIGS 沉默后類黃酮合成相關基因的qRT-PCR 分析Fig. 8 Relative expression level of flavonoid synthesis-related genes after VIGS silencing of HcKAN4 gene in kenaf

3 討論

3.1 MYB 轉錄因子在類黃酮和纖維發育中的作用機制

MYB 轉錄因子在類黃酮合成和纖維發育中發揮著重要作用, 本研究利用TRV-VIGS 技術鑒定了HcKAN4基因在紅麻類黃酮合成中的作用。結果顯示, 在HcKAN4基因沉默后, 類黃酮合成基因表達量均顯著減少, 說明HcKAN4是紅麻類黃酮代謝途徑中部分酶基因的關鍵調控因子。進一步分析發現,該基因在紅麻中主要在莖、葉中表達而在根中不表達。在油菜中,KAN4基因在根莖葉中都有表達, 在根中的表達量顯著高于莖、葉[27], 表明該基因同源基因在不同植物存在不同表達模式, 具有組織特異性。

多種轉錄因子對類黃酮生物合成通路中的基因有調控作用, MYB 轉錄因子調控類黃酮的途徑也有相關報道。Zhai 等[28]發現PbMYB10b可以調控PAs的生物合成, 但其功能可以被其他MYB 轉錄因子補充。Li 等[29]發現FhMYB5 和bHLH 轉錄因子基因FhTT8L和FhGL3L共同作用時, 類黃酮合成基因被激活。Zhu 等[30]從菊花中發現R2R3-MYB 轉錄因子的CmMYB8基因對木質素和類黃酮化合物的合成起到負調控作用。在棉花中發現R2R3-MYB基因與纖維品質有遺傳相關性[31]。本研究發現, 沉默HcKAN4基因顯著下調紅麻類黃酮化合物合成酶基因的轉錄水平, 可能正向調控木質素合成相關酶基因的表達。根據這些結果推測, 紅麻HcKAN4沉默后可能抑制了黃酮類化合物的合成而促進纖維素含量積累。而提高纖維素含量是改良纖維品質的關鍵途徑,因此, 這為改善紅麻纖維品質的分子育種提供了新的研究思路。

關于HcKAN4基因與類黃酮合成相關基因HcF3’H、HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR之間的調控關系, 是通過轉錄調控還是蛋白結合等方式實現, 目前還沒有相關文獻報道。生物信息學分析結果顯示, 紅麻類黃酮合成相關基因HcF3’5’H(Hc.10G006460)啟動子上游1959 bp 處存在1 個HcKAN4的結合元件(TTTTTACGGTTA), 其功能是MYB binding site involved in flavonoid biosynthetic genes regulation。多項研究顯示, 該元件是MYB 轉錄因子家族調控下游靶基因的核心元件。因此, 轉錄因子HcKAN4可能結合HcF3’5’H啟動子進而調控類黃酮的合成。具體調控機制有待進一步深入研究。

3.2 TRV-VIGS 的影響因素

VIGS 具有不通過穩定遺傳轉化就降低目的基因表達水平的特征, 從而可以研究目的基因表達水平降低后對作物表型的影響。VIGS 的沉默效率受多種因素影響, 如載體種類[32]、侵染方法[33]、侵染時間[34]等。VIGS 在不同的植物中沉默效率也有較大差別, Jia 等[35]發現草莓CHS 基因的沉默效率達80%左右, 而本研究中沉默Hc.KAN4基因沉默效率為100%?，F階段VIGS 研究通常沉默一個基因, 從而研究基因功能作用。李玉霞等[36]通過共沉默GbCHI、GbDFR和GbF3’H來研究在海島棉中的抗枯萎病發現, 共沉默相對于單獨沉默GbF3’H的作用效果有顯著提升。通過共沉默來探討紅麻HcKAN4基因與類黃酮合成相關基因HcF3’H、HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR之間的調控關系, 有待進一步研究。

4 結論

HcKAN4基因表達具有組織特異性, 在莖、葉中的表達量顯著高于根中。TRV-KAN4 的沉默效率良好, 且沉默植株中類黃酮合成相關基因的表達量與對照相比顯著下降, 通過對植株在相同組織不同時期的表達量發現, 類黃酮合成相關基因的表達量呈上升趨勢, 而纖維素和木質素相關基因的表達量呈下降趨勢。推測該轉錄因子可以影響類黃酮的生物合成, 進而影響紅麻的纖維發育。