基于RNA-Seq 篩選高粱低氮脅迫相關候選基因

王 瑞 張福耀 詹鵬杰 楚建強 晉敏姍 趙威軍 程慶軍,*

1 山西農業大學高粱研究所 / 高粱遺傳與種質創新山西省重點實驗室, 山西晉中 030600; 2 西北農林科技大學農學院, 陜西楊凌 712100

高粱(SorghumbicolorL. Moench)是世界第五大禾谷類作物, 可用于食用、飼料、釀造、飼草、制糖、生物質能源等領域, 在全球農業生產中占有重要地位[1-2]。高粱也是我國的重要農作物之一, 主產區在東北、華北、西南等區域, 在支撐釀造產業、農牧業生產中發揮著重要作用[3-5]。高粱具有抗旱、耐鹽堿和耐貧瘠等多重抗性, 與其他主要谷類作物相比, 在限氮條件下高粱有更高的氮吸收和利用效率, 從而能獲得較高產量[6]。在過去的幾十年, 増施氮肥對作物增產發揮了重要作用, 但過量施氮既浪費資源又帶來一系列的環境污染問題[7-10]。因此, 減少氮肥施用量、提高氮肥利用效率和促進農業可持續發展已成為當今農業生產研究中的熱點問題。而研究作物的氮素吸收利用機理、培育氮高效品種是合理利用肥料、減少環境污染的有效途徑之一。目前, 對作物氮效率的相關研究主要集中在水稻[11-14]、小麥[15-17]、玉米[18-20]等谷類作物, 高粱的研究較少[21]。

近年來, 隨著測序技術的迅猛發展和測序成本的大幅下降, 高通量測序已成為植物基因組和轉錄組等眾多組學研究的首選測試分析手段, 越來越多的研究從組學入手, 深入解析作物在低氮脅迫下的響應。Singh 等[22]用玉米耐低氮自交系DMI 56 和氮敏感自交系DMI 81 的葉和根進行轉錄組分析?；贙EGG 和Mapman 分析表明, 大部分差異表達基因(DEGs)可通過多種代謝途徑參與調控, 包括次生代謝產物的生物合成、信號轉導、氨基酸代謝、氮同化代謝和淀粉代謝。與敏感型相比, 耐受基因型中一些涉及氮吸收(高親和力硝酸鹽轉運蛋白NRT2.2和NRT2.5)、氮同化和代謝(谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶)、氧化還原平衡(SOD、POX)和轉錄因子(MYB36、AP2-EREBP)的關鍵基因表達量較高。Ge 等[23]對低氮脅迫下谷子幼苗的轉錄組進行分析,篩選出1891 個差異表達基因, 其中上調基因1318個, 下調基因573 個; 3%基因參與膜轉運, 5%基因參與氧化還原過程?；蚬δ芊治霰砻? 在低氮脅迫下SiMYB3 通過調控植物根系生長素合成來調控根系發育。Sultana 等[24]采用RNA-Seq 分析方法, 對3個澳大利亞小麥品種的葉和籽粒進行轉錄組研究。在低氮脅迫下共鑒定出12,344 個差異表達基因, 其中下調基因主要與碳水化合物代謝過程、光合作用、捕光和防御反應有關, 上調基因主要與核苷酸代謝、蛋白質水解和跨膜轉運有關。Ding 等[25]對谷子鄭204 在低氮脅迫下的轉錄分析表明, SiMYB42 轉錄因子在低氮脅迫下表達上調, 它可能通過調控硝酸鹽轉運基因的表達來增強谷子對低氮脅迫的耐受性。Yan 等[26]對小麥XM26 和LM23 兩個品種的根和芽進行了低氮和正常處理下的轉錄組分析, 鈣介導的植物-病原體相互作用、MAPK 信號通路和磷脂酰肌醇信號通路在XM26 中富集, 而在LM23 中不富集, 表明鈣相關途徑在2 個品種中發揮不同的作用, 引起不同的耐低氮脅迫。Zhang 等[27]從大豆根莖、葉、花和種子的全基因組序列中鑒定出64 個假定的GATA 因子。在低氮脅迫下, GATA44 和GATA58可能參與了大豆氮素代謝的調控。NLP 是硝酸鹽應答順式元件結合蛋白, 在硝酸鹽調控表達中起轉錄激活的作用。Jagadhesan 等[28]通過對水稻葉和根的研究揭示了NLP 轉錄因子在低氮脅迫抗性中的作用。關于高粱在低氮脅迫下轉錄響應的研究, Gelli等[29]利用全基因組轉錄分析鑒定了7 個高粱基因型的根(4 個耐低氮高粱基因型-三尺三、China17、KS78、高氮bulk 和3 個敏感基因型-CK60、BTx623低氮bulk)耐低氮脅迫差異表達基因。在敏感基因型中, 低氮脅迫增加了與應激反應(包括氧化應激和刺激)相關的DEG 轉錄本的豐度。在耐受型基因型中,高親和力硝酸鹽轉運體(NRT2.2、NRT2.3、NRT2.5和NRT2.6)和賴氨酸組氨酸轉運體1 (LHT1)轉錄本豐度高, 表明提高無機和有機氮的吸收效率; 較高豐度的SEC14 細胞質因子家族蛋白轉錄物可提高膜的穩定性和對氮脅迫的耐受性。Zhu 等[30]對高粱BTX623 幼苗的芽和根低氮轉錄組分析, 篩選出4292 個DEGs (3243 個表達上調和1049 個表達下調);GO 和KEGG 通路分析表明, 缺氮反應與光合作用和蛋白質運輸等功能相關; 另外為了研究氮磷鉀營養缺乏下的單一營養素是否對基因表達水平有交互影響, 他們選擇了幾個已知的氮磷鉀相關基因來檢、、查它們在單一和聯合缺乏下的表達情況, 結果表明,大多數低氮相關基因, 如硝酸鹽和銨轉運體Sb04g024090、Sb04g026290 和Sb01g001970 在缺氮磷鉀植株和缺氮植株的莖和根中的表達模式相似,硝酸鹽轉運體Sb03g032310 在低氮下在莖和根中表達強烈。此外, Massel 等[31]利用44 組高粱重測序數據分析了230 個參與氮吸收和代謝的基因的遺傳變異和選擇壓力, 為高粱氮肥利用相關基因發掘奠定基礎。本研究選取2 個耐低氮型高粱品種(BSX44 和BTx378)為試驗材料, 設置正常和低氮脅迫2 個處理,采用轉錄組測序技術, 分別在苗期、抽穗期和開花期取葉片提取總RNA, 再經mRNA 純化、反轉錄、文庫構建及轉錄組測序等一系列過程, 在2 個氮處理下, 對不同基因型高粱進行生物信息學分析。從mRNA 水平對高粱缺氮過程中基因的表達進行探測,全面地搜索影響氮效率的相關基因及表達水平。該研究旨在了解高粱響應低氮脅迫的分子機制, 為鑒定和培育適應低氮的種質資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在課題組[21,32]前期篩選研究基礎上, 選用耐低氮品種BTx378 和BSX44, 參照劉鵬等[32]采用盆栽試驗, 設置正常生長(0.24 g kg-1風干土)和低氮脅迫(0.04 g kg-1風干土) 2 個處理種植, 分別在苗期取第三葉、抽穗期和開花期取倒二葉, 各處理均選取3 盆高粱, 采樣后保存在液氮中。利用TRIzol 法提取RNA, 提取的總RNA 使用超微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)測定其純度及濃度, 確保質量合格。將樣品送北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序, 根據基因在不同樣品中的表達量進行差異表達分析、差異表達基因功能注釋和功能富集等表達水平分析, 挖掘參與高粱低氮脅迫的關鍵候選基因及其調控途徑。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉錄組樣品 分別在苗期、抽穗期和開花期進行轉錄組測序分析, 轉錄組樣品和分組見表1和表2 (NN 為正常氮、LN 為低氮; R1 和R2 分別為BTx378 和BSX44; S1 為苗期、S2 為抽穗期、S3 為開花期)。

表1 轉錄組樣品Table 1 Transcriptome sample

表2 轉錄組樣品分組Table 2 Groups of transcriptome sample

1.2.2 轉錄組驗證 為驗證轉錄組測序結果的準確性, 隨機挑選6 個低氮脅迫關鍵差異基因在2 個耐低氮高粱品種進行qRT-PCR 驗證。利用NCBI 設計引物(表3), 以SbActin為內參基因, 利用Bio-Rad實時熒光定量PCR 系統(伯樂, 美國)進行熒光定量檢測。每個樣品3 次生物學重復, 以2-ΔΔCT相對定量法計算相對表達量。

表3 引物信息Table 3 Information of the primers

1.2.3 差異表達基因篩選 通過比較不同樣本間的數據從而篩選出差異表達基因, 使用DESeq 進行差異基因分析。采用TPM (transcripts per million)作為衡量基因表達水平的指標在差異表達基因檢測過程中, 將Fold Change≥2 且FDR＜0.01 作為篩選標準。差異倍數(Fold change)表示兩樣品(組)間表達量的比值。錯誤發現率(False discovery rate, FDR)是通過對差異顯著性P值(P-value)進行校正得到的。采用公認的Benjamini-Hochberg 校正方法對原有假設檢驗得到的顯著性P值(P-value)進行校正, 并最終采用FDR 作為差異表達基因篩選的關鍵指標。

1.2.4 差異基因的GO 和KEGG 富集分析 對檢測到的差異表達基因(DEGs)進行基因本體 GO[33](Gene ontology, http://www.geneontologyorg/)功能顯著性富集分析, 利用R 語言中的richR 程序包將差異基因進行功能分類及富集分析, 當顯著性P＜ 0.05時認為該功能項為富集項。

KEGG[34](Kyoto encyclopedia of genes and genomes, http://www.genome.jp/kegg/)是一個基于分子水平信息的大規模分子數據集, 用于了解生物高級功能的系統。采用 Pathway 顯著性富集分析, 以KEGG 數據庫中Pathway 為單位, 應用超幾何檢驗,找出與參考基因組背景相比, 在差異表達基因中顯著性富集的Pathway[35]。并借助KOBAS (2.0)[36]將差異基因進行Pathway 富集分析。當P＜ 0.05 時, 表示差異基因在該Pathway 中顯著富集。

2 結果與分析

2.1 RNA-Seq 測序數據質量分析

在正常和低氮條件下, 將BTx378 和BSX44 在苗期、抽穗期和開花期取樣進行轉錄組測序, 表4 為轉錄組測序數據質控信息, 正常和低氮脅迫下BTx378和BSX44 葉片3 個時間點(低氮脅迫苗期、抽穗期和開花期) GC 含量范圍在55.45%～57.58%之間, Q30 堿基百分比高于91.53%; 表明轉錄組測序樣品組間差異較小、測序數據可靠, 可用于后續分析。

表4 測序數據質量評估Table 4 Quality evaluation of RNA sequencing data

2.2 差異表達基因的qRT-PCR 驗證

為進一步探索差異表達基因在低氮脅迫下的表達模式, 通過qRT-PCR 對隨機選擇的6 個基因在不同時期的表達量進行驗證。結果顯示, qRT-PCR 和RNA-Seq 的表達趨勢一致, 說明轉錄組RNA-Seq 數據較為可靠, 可用于后續的分析(圖1)。通過對參與低氮脅迫響應相關差異表達基因的分析發現, 這些基因隨著低氮脅迫時間的持續, 均表現出差異表達。表明這些顯著上調或者下調的基因, 與高粱耐低氮相關, 探索具有相似表達譜的基因, 將有助于我們定位更多參與低氮脅迫的重要候選基因, 構建參與高粱低氮耐受的表達網絡。

圖1 部分差異表達基因qRT-PCR 驗證Fig. 1 qRT-PCR validation of partially differentially expressed genes

2.3 差異表達基因篩選

2.3.1 低氮脅迫不同時期差異表達基因數目統計

對2 個耐低氮高粱品種在低氮處理不同時期的差異表達基因進行篩選(表5)發現, 低氮處理苗期R1 共篩選937 個差異表達基因, 其中464 個基因上調表達(49.52%)、473 個基因下調表達(50.48%) (對比組1); R2 共篩選出787 個差異表達基因, 其中264個基因上調表達(33.67%)、523 個基因下調表達(66.33%) (對比組2)。

表5 差異表達基因數目統計Table 5 Statistics of differentially expressed genes (DEGs)

低氮脅迫抽穗期R1 共篩選1305 個差異表達基因, 其中637 個基因上調表達(48.81%)、668 個基因下調表達(51.19%) (對比組3); R2 共篩選出935 個差異表達基因, 其中432 個基因上調表達(46.20%)、503 個基因下調表達(53.80%) (對比組4)。

低氮脅迫開花期R1 共篩選1402 個差異表達基因, 其中394 個基因上調表達(28.03%)、1008 個基因下調表達(71.97%) (對比組5); R2 共篩選出963 個差異表達基因, 其中384 個基因上調表達(39.88%)、579 個基因下調表達(60.12%) (對比組6)。

2.3.2 低氮脅迫不同時期差異表達基因韋恩分析

耐低氮高粱品種分別在低氮處理不同時期苗期、抽穗期和開花期的差異表達基因分析發現, 在低氮脅迫苗期、抽穗期和開花期分別有246、371 和306 個基因在2 個耐低氮高粱品種中共同差異表達(圖2)。

圖2 差異表達基因韋恩分析Fig. 2 Venn diagram of differentially expressed genes

2.4 低氮脅迫下不同時期差異表達基因的富集分析

為了進一步鑒定差異表達基因的生物學功能,分別對苗期、抽穗期和開花期3 個不同時期, 2 個耐低氮高粱品種中共同差異表達的基因進行GO 功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析, GO 富集分析主要分為細胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物過程(biological process, BP) 3 個亞組。

2.4.1 低氮脅迫苗期差異基因的富集分析 低氮脅迫下, 對苗期2 個耐低氮材料中均差異表達的246個基因進行GO 功能富集與KEGG 代謝通路富集分析發現(圖3), 這些基因主要富集包括生物過程、細胞組分和分子功能3 個分類下的43 個GO term。生物過程共富集到19 個GO term, 主要是氧化還原過程(GO:0055114)、對脫落酸的響應(GO:0009737)、對磷酸鹽饑餓響應(GO:0016036)、半乳糖生物合成過程(GO:0019375)、轉錄負調控(GO:0045892)、硝酸鹽轉運(GO:0015706)、磷酸鹽離子運輸(GO:0006817); 細胞組分共富集到13 個GO term, 主要包括細胞(GO:0005623)、細胞膜(GO:0016020)、細胞器(GO:0044464)、大分子復合物(GO:0032991)、共質體(GO:0055044); 分子功能共富集到11 個GO term, 與催化活性(GO:0003824)、轉運活性(GO:0005215)、核酸結合轉錄因子活性(GO:0001071)、電子載體活性(GO:0009055)、分子轉導活性(GO:0060089)、信號轉導途徑(GO:0004871)、結構分子活性(GO:0005198)、抗氧化活性有關(GO:0016209)。代謝通路富集分析, 對顯著富集的前20 條通路進行統計分析發現, 在低氮脅迫苗期, 差異基因主要富集在碳代謝、氨基酸的生物合成、甘油酯代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、半乳糖代謝、果糖與甘露糖代謝、糖酵解通路、參與氨基糖和核苷酸糖代謝、β-丙氨酸代謝、氮素代謝等過程。

2.4.2 低氮脅迫抽穗期差異基因的富集分析 對低氮脅迫抽穗期在2 個耐低氮高粱材料中均差異表達的371 個基因進行GO 功能注釋富集與KEGG 代謝通路富集分析發現(圖4), 這些基因主要富集包括生物過程、細胞組分和分子功能3 個分類下的41 個GO term。生物學過程共富集到18 個GO term, 主要包括缺水響應(GO:0009414)、對傷害的響應(GO:0009611)、對冷害的響應(GO:0009409)、高滲鹽響應(GO:0042538)、乙烯響應(GO:0009723)、對茉莉酸的響應(GO:0009753)及磷酸鹽饑餓響應過程(GO:0016036); 細胞組分共富集到12 個GO term,主要包括細胞(GO:0005623)、細胞膜(GO:0016020)、細胞器(GO:0044464)、大分子復合物(GO:0032991)、共質體(GO:0055044); 分子功能共富集到11 個GO term, 主要包括與催化活性(GO:0003824)、轉運活性(GO:0005215) 、 核酸結合轉錄因子活性(GO:0001071)、電子載體活性(GO:0009055)、分子轉導活性(GO:0060089)、信號轉導途徑(GO:0004871)、結構分子活性(GO:0005198)、抗氧化活性有關(GO:0016209)。代謝通路富集分析, 對顯著富集的前20條通路進行統計分析結果發現, 在低氮脅迫抽穗期,差異基因主要富集在氨基酸生物合成、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、2-氧代環戊烷羧酸甲脂代謝、光合作用、甘油酯代謝、氮代謝等過程。

(圖4)

2.4.3 低氮脅迫開花期差異基因的富集分析 對低氮脅迫開花期2 個耐低氮高粱材料中均差異表達的306 個基因進行GO 功能富集與KEGG 代謝通路富集分析發現(圖5), 這些基因主要富集包括生物過程、細胞組分和分子功能3 個分類下的42 個GO term。生物學過程共富集到19 個GO term, 主要包括鎘離子反應(GO:0046686)、對冷害的響應(GO:0009409)、過氧化氫響應(GO:0042542)、對傷害的響應(GO:0009611)、對高光強的響應(GO:0009644)、對熱的響應(GO:0009408)、細胞對磷酸鹽饑餓的反應(GO:0016036); 細胞組分共富集到13 個GO term,主要涉及到細胞(GO:0005623) 、 細胞膜(GO:0016020)、細胞器(GO:0044464)等組分; 分子功能共富集到10 個GO term, 主要包括與催化活性(GO:0003824)、轉運活性(GO:0005215)、核酸結合轉錄因子活性(GO:0001071)、電子載體活性(GO:0009055)。代謝通路富集分析, 對顯著富集的前20 條通路進行統計分析發現, 低氮脅迫開花期時差異基因主要參與了內質網蛋白加工、氨基酸生物合成、淀粉與蔗糖代謝、谷胱甘肽代謝過程及氨基酸代謝過程等。

(圖5)

2.5 耐低氮相關的差異表達基因分析

苗期、抽穗期和開花期3 個時期對2 個耐低氮品種中差異表達的基因進行挖掘。結果發現, 低氮脅迫下, 共有28 個基因在2 個耐低氮品種的不同生育時期均差異表達, 其中有 5 個基因上調表達, 23 個基因下調表達(圖6)。熱圖是展示基因表達差異非常直觀的方法, 將不同高粱與低氮脅迫相關的28 個DEGs 進行聚類分析發現(圖7), 基因Sb04g034160、Sb06g016540、Sb04g021010在正常條件下表達豐度最高。正常與缺氮相比較,Sb07g 028630、Sb01g015190、Sb01g032250、Sb03g045170、Sb06g025950等5 個基因表達整體呈上調趨勢, 其他23 個基因表達整體呈下調趨勢(表6), 這將為進一步分析與低氮脅迫的基因在不同高粱中的調控作用提供依據。

圖6 差異表達基因韋恩分析Fig. 6 Venn diagram of differentially expressed genes

表6 共同差異表達基因相關信息Table 6 Related information of common differentially expressed genes

2.5.1 共同差異表達基因KEGG 相關代謝通路富集分析 代謝通路富集分析發現, 共同差異基因參與氮代謝、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸的生物合成、醚脂代謝、2-氧羧酸代謝、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、磷脂酰肌醇信號系統、光合作用、甘油脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、光合生物中的碳固定、內吞作用和碳代謝(表7 和圖8)。其中代謝路徑重要的基因:Sb04g034160參與氮代謝(ko00910);Sb06g031460參與氮代謝(ko00910), 谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250), 氨基酸的生物合成(ko01230), 乙醛酸和二羧酸代謝(ko00630), 精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330);Sb01g023750參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250), 氨基酸的生物合成(ko01230),2-氧羧酸代謝(ko01210), 光合生物的固碳作用(ko00710), 碳代謝(ko01200);Sb01g032250參與甘油磷脂代謝(ko00564), 磷脂酰肌醇信號系統(ko04070), 甘油脂代謝(ko00561);Sb03g012720參與甘油磷脂代謝(ko00564), 醚脂代謝(ko00565), 內吞作用 (ko04144);Sb01g006100參與光合作用(ko00195)。

表7 共同差異表達基因KEGG 富集通路Table 7 KEGG enrichment pathway of common differentially expressed genes

2.5.2 差異表達基因的同源基因比對 將2 個耐低氮品種苗期1478 個、抽穗期1869 個和開花期2059個差異表達基因與Massel 等[31]關于高粱氮吸收和代謝途徑中的230 個基因進行比較, 發現15 個相同的高粱基因。這些基因在低氮條件下, 苗期、抽穗期和開花期的表達不同(表8)。其中,Sb01g001970在2個耐低氮品種低氮處理后的各個時期都表達上調,Sb10g026090在各個時期都表達下調。

表8 高粱氮吸收和代謝途徑中的15 個基因和玉米、水稻的同源基因及在不同時期的表達情況Table 8 15 genes in the nitrogen uptake and mobilization pathway of orthologous maize and rice genes during different periods

3 討論

高粱起源于土壤相對貧瘠的非洲, 與其他作物相比耐貧瘠性好, 氮肥吸收利用效率高。然而, 不同高粱遺傳材料之間氮肥吸收利用效率變異廣泛。因此, 探究參與調控高粱氮肥吸收利用的基因表達網絡, 挖掘優異基因對于提高高粱氮肥利用率, 減少化肥施用, 推動農業綠色發展有重要意義。本研究利用2 個高粱耐貧瘠材料通過轉錄組分析分別鑒定了246、371 和306 個在苗期、抽穗期和開花期共同差異表達的基因。這些基因功能主要集中在氮代謝、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘油磷脂代謝以及氨基酸的生物合成等通路, 揭示了高粱響應低氮脅迫轉錄組學變化。同時, 本研究發掘了28 個在不同取樣時期均差異表達的基因, 為后續功能基因發掘奠定了基礎。

3.1 植物應答低氮脅迫的轉錄調控研究

當土壤中的氮素虧缺時, 植物會對低氮信號作出感應, 通過信號轉導調節體內氮相關基因的表達,從而調控植物體內的生理生化反應。Miyake 等[37]在大豆中分離鑒定GmMYB101基因在低氮脅迫下上調表達。Lea 等[38]在低氮條件下發現擬南芥MYB12的表達水平顯著上調。胡利斧[39]研究谷子SiMYB3基因在低氮、低鉀和低磷條件下的表達均顯著提高。Zhu 等[30]對高粱BTX623 幼苗氮、磷、鉀相互作用的轉錄組分析表明, 大多數低氮相關基因, 如硝酸鹽和銨轉運體Sb04g024090、Sb04g026290和Sb01g001970在缺氮磷鉀植株和缺氮植株的莖和根中的表達模式相似, 硝酸鹽轉運體Sb03g032310在低氮下在莖和根中表達強烈。本研究在苗期, 銨轉運體Sb01g001970在BTx378 和BSX44 兩個高粱材料中表達上調, 硝酸鹽轉運體Sb03g032310在BSX44 中表達明顯下調。Massel 等[31]關于高粱氮吸收和代謝途徑中的230個基因中也包含Sb01g001970基因。本研究發現共同差異基因主要集中在氮代謝、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸的生物合成等途徑, 這與前人對煙草[40]、水稻[41]低氮脅迫下的轉錄組分析結果基本一致。本研究對2 個耐低氮型高粱低氮脅迫后, 在苗期、抽穗期和開花期3 個時期,Sb01g032250等5 個基因都表達上調,Sb04g034160、Sb06g031460、Sb01g032250、Sb03g012720、Sb01g 006100等23 個基因都表達下調, 可能這些基因可能影響氮素的利用效率。這28 個不同時期均差異表達的基因可以作為進一步功能分析的重點, 探究其在高粱氮肥吸收利用中的作用。

3.2 低氮脅迫對高粱不同生育時期代謝通路的影響

當植物應對不良環境時, 植物體內代謝物的種類和數量會發生一些變化, 包括代謝通路會發生不同程度的變化來應對逆境以免造成傷害。氨基酸作為蛋白質合成的基本單元, 在植物逆境脅迫中能夠作為滲透調節物質并維持生物膜穩定[42]。本研究中,在高粱不同生育時期氨基酸生物合成過程都受影響,說明低氮脅迫下, 氨基酸能夠降低滲透勢, 增強抗逆性, 維持其正常生理特性。植物氮代謝與碳代謝緊密相關。碳代謝提供碳源和能量可促進氮代謝進行, 氮代謝可以為碳代謝提供酶和蛋白供應植株發育[43]。本研究在低氮脅迫下, 苗期影響碳代謝, 參與碳代謝協調氮代謝從而共同影響植物的生長發育?？扇苄蕴窃谥参矬w內是重要的碳源, 也是重要的滲透調節劑, 對植物抗逆有至關重要的促進作用[44]。本研究低氮脅迫下, 苗期與糖代謝有關半乳糖代謝、果糖與甘露糖代謝以及開花期的淀粉與蔗糖代謝顯著加強, 在抵御低氮脅迫發揮重要作用。能量代謝對植物抵御不利環境脅迫至關重要, 也最容易受到不利環境影響[45]。糖酵解是維持細胞重要的能量合成途徑以及生產碳骨架方面扮演著重要角色,能應對不良環境[46]。本研究低氮條件下, 苗期與糖酵解有關的代謝過程顯著積累, 從而增強能量代謝反應, 這表明糖酵解是高粱適應低氮環境的重要能量代謝。

3.3 低氮脅迫對氮代謝的影響

氮營養是植物生長必不可少的重要因素[47], 影響植物的許多生物過程。植物根系從土壤中獲取的氮素主要形式是NO3-和NH4+。植物需要經歷NO3-無機氮同化和NH4+有機同化, 植物吸收的NO3-需還原為NH4+才能被吸收, NH4+在GS/GOGAT 途徑分別被同化成谷氨酰胺和谷氨酸[48-49], 谷氨酰胺和谷氨酸基本上為所有的氨基酸、核酸和其他含氮化合物(如葉綠素)的生物合成提供氮素。然后谷氨酰胺和谷氨酸可用于形成天冬氨酸和天冬酰胺。這4 種氨基酸共同完成有機氮的輸送和轉化[50-51]。

Sb04g034160參與氮代謝通路, 且表達豐度最高。Sb04g034160基因GO 注釋主要包括對硝酸鹽的響應(GO:0010167)、硝酸鹽轉運(GO:0015706)、硝酸鹽同化(GO:0042128)、細胞氮化合物合成(GO:0044271)、亞硝酸鹽還原酶活性(GO:0050421)等, 表明Sb04g034160基因可能是通過調節NO3-無機氮同化基因的表達來實現。

Sb06g031460參與氮代謝(ko00910), 谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250), 氨基酸的生物合成(ko01230)等途徑。Sb06g031460基因GO 注釋主要包括谷氨酰胺合成(GO:0006542) 、 固氮(GO:0009399)、半胱氨酸合成(GO:0019344)、氨同化循環(GO:0019676)等, 差異表達基因KEGG 代謝通路分析結果與GO 富集分析具有較高的一致性。表明Sb06g031460基因可能通過調節NH4+有機同化基因的表達來實現。

3.4 低氮脅迫對光合作用的影響

氮素是作物光合器官及光合酶的構成部分, 土壤中的氮素供應對作物光合作用的正常運轉起重要作用。植物內部的氮含量直接影響葉片擴展和光合作用[52]。正常生長條件下作物會將大部分吸收的氮向上運輸到長勢優良的葉片, 為其光合作用提供氮源, 從而增加CO2的同化; 而在低氮條件下, 作物光合作用一般會顯著降低[53]。本研究低氮脅迫后, 參與光合作用(ko00195)的基因Sb01g006100表達下調。

4 結論

本研究在正常和低氮脅迫下, 通過對2 個耐低氮材料的轉錄組測序分析, 發現了苗期、抽穗期和開花期分別有246、371 和306 個基因在共同差異表達。其中, 3 個時期均差異表達基因28 個, 包括5 個上調表達基因和23 個下調表達基因; 對共同差異表達基因的KEGG 相關代謝通路富集分析, 發現主要集中在氮代謝、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸的生物合成等通路。該研究揭示了高粱響應低氮脅迫的轉錄組學變化, 為進一步發掘提高氮肥利用效率的優異基因奠定基礎。