基于納米材料拉曼增強特性的細胞氧化損傷檢測

宋芷儀,王周平,馬小媛

(1 江南大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室,江蘇 無錫 214122;2 江南大學 食品學院,江蘇 無錫 214122)

表面增強拉曼(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)是通過增強基底的表面等離子共振,引起電磁增強,進而將拉曼信號放大的一種技術[1-2]。它具有靈敏度高、破壞性小、預處理簡單等優點。對大多數水溶液樣品來說,表面增強拉曼技術可以大幅度減弱水拉曼散射對樣品造成的干擾,彌補紅外吸收光譜在這方面的不足。其中,具有特殊形貌的金屬納米粒子可極大地增強附著在金屬納米粒子表面的分子拉曼信號,使表面增強拉曼技術能夠被廣泛應用于化學、生物、醫藥、環境等領域[3-5]。

銅是大多數真核生物細胞生理過程的必需元素,但當其濃度過高時可引起細胞氧化應激,并通過形成自由基而對蛋白質、脂質和DNA造成直接損傷,進而對肝臟或大腦造成特定損傷[6-7]。研究表明,大腦或肝臟內的銅元素穩態失衡會導致細胞形態發生變化,活性氧和丙二醇含量升高,谷胱甘肽含量下降,并對DNA造成氧化損傷[8-9]。因此,保護肝臟免受由銅離子濃度升高引起的氧化損傷十分必要。

當前,細胞氧化損傷的傳統檢測方法主要包括細胞內物質成分的變化檢測(如脂質、蛋白質、碳水化合物、DNA等的氧化損傷檢測)、氧化受損細胞內自由基的直接檢測(包括電子自旋共振法和化學發光法)、細胞內總活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)測定、抗氧化酶測定等[10]。此外,高劑量ROS會誘導細胞壞死,低劑量ROS會引起細胞凋亡,因此還可以通過檢測氧化應激引起的細胞凋亡反應間接判斷細胞的受損狀態[11]。然而,由于細胞受ROS損傷的機制較為復雜,目前還沒有形成標準的細胞氧化損傷檢測方法。關于細胞生物學方向的氧自由基檢測還有待發展出靈敏度更高、選擇性更好的新方法。

基于此,本研究將以銅離子誘導的細胞氧化損傷為模型、表面增強拉曼技術為手段,旨在建立一種檢測細胞損傷的拉曼光譜表征法[12]。研究首先通過種子生長法制備金納米花作為拉曼檢測基底,并篩選能增強拉曼信號的基底;再利用CCK-8法進行細胞毒性檢測及Cu2+對細胞造成的氧化損傷檢測,建立氧化損傷模型;最后,通過SERS對細胞氧化損傷模型進行檢測,進而建立一種新的細胞氧化損傷檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,C8H18N2O4S)、氯金酸(HAuCl4)、抗壞血酸(AA,C6H8O6)、二水合檸檬酸三鈉(C6H5Na3·2H2O)、無水乙醇(C2H6O)、氫氧化鈉(NaOH)、二水合氯化銅(CuCl2·2H2O)均為分析純。

人體肝癌細胞HepG2,購自中科院上海生物化學與細胞生物學研究所;CCK-8試劑,購自上海生工生物工程有限公司;超純水,美國Millipore凈水系統;DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素,購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 設備與儀器

HH-4數顯恒溫水浴鍋,常州市榮冠實驗分析儀器廠;全自動雪花制冰機,常熟市雪科電器有限公司;高速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;注射泵,保定蘭格恒流泵有限公司;Shimadzu MV-1800型紫外可見光分光光度計,島津(上海)實驗器材有限公司;JEM-2100(200 kV)透射電子顯微鏡,日本電子公司;LabRAM HR 800 共聚焦顯微拉曼光譜儀,法國HORIBA公司;超純水儀,美國Millipore公司;恒溫油浴鍋、電熱式磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責任公司;超聲波清洗儀,無錫市科潔超聲電子設備有限公司;電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;電子天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;SpectraMax M5/M5e酶標儀,美國Molecular Device公司;微量移液器,德國Eppendorf股份公司;超凈工作臺,蘇州尚田潔凈技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 金種子的合成[13]

所用玻璃器皿及攪拌棒用王水(V濃硝酸∶V鹽酸=1∶3)浸泡12 h以上,超純水沖洗后烘箱烘干。配置質量分數為1%的檸檬酸三鈉水溶液和1%的HAuCl4水溶液,備用。三頸燒瓶中加入0.5 mL上述HAuCl4水溶液和49.5 mL去離子水,安裝冷凝回流裝置后,置于120 ℃油浴鍋中加熱并攪拌。待溶液沸騰后繼續加熱10 min,迅速加入2.5 mL上述檸檬酸三鈉水溶液,加熱攪拌至溶液變為酒紅色。撤去熱源,繼續攪拌冷卻至室溫,得到球狀金種子(AuNPs)。改變檸檬酸三鈉水溶液的添加量,以制備不同尺寸的AuNPs,并用紫外分光光度計和透射電鏡表征。金種子置于棕色瓶中,于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.2 金納米花的合成[13]

配置質量分數為1%的抗壞血酸水溶液和物質的量濃度為20 mmol/L的HEPES水溶液(pH為7.4),備用。在50 mL燒杯中依次加入3 mL粒徑為15 nm的金種子、8 mL HEPES水溶液和400 μL抗壞血酸水溶液,冰浴攪拌均勻。另取680 μL質量分數1%的HAuCl4水溶液,用去離子水稀釋至10 mL,使用注射泵逐滴加入燒杯中,流速控制在30 滴/min,并保持冰浴攪拌。繼續冰浴攪拌2 h以上,得到藍紫色的金納米花膠體溶液。增加HEPES水溶液的添加量至12 mL,得到支角更多、更尖銳的金納米花(AuNFs)。取10 mL金納米花膠體溶液在3 000 r/min條件下離心15 min,去上清液并用1 mL去離子水重懸,使用紫外分光光度計和透射電鏡表征。

1.3.3 人體肝癌細胞HepG2的培養

人體肝癌細胞HepG2使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM高糖培養基在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。待細胞貼壁生長至80%左右時,進行傳代培養:將培養皿中原有的細胞液吸去,加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)進行洗滌,重復2次后加入2 mL胰酶消化液(含0.25%胰蛋白酶、1 mmol/L EDTA和25 mmol/L HEPES的PBS),輕輕晃動培養皿使消化液均勻鋪在細胞上層,消化2～3 min,用顯微鏡觀察到細胞質回縮、細胞間隙增大時吸去消化液,加入2 mL完全培養基終止消化。吸取1～2 mL培養液將培養皿底部貼壁生長的細胞全部吹打下后,以1∶2的比例傳代接種細胞于新培養皿中。

1.3.4 SERS探針和Cu2+的細胞毒性實驗

取1 mL金納米花重懸液,加入10 μL多肽,搖床中孵育8 h以上,使金納米花被肽鏈修飾。在3 000 r/min條件下離心15 min,去上清液并用1 mL去離子水重懸,備用。將生長至指數期的細胞用胰酶消化,在培養皿中加入2 mL培養基,用移液槍輕輕吹打混勻,得到細胞懸液。將細胞懸液以每孔100 μL接種至96孔板中,置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養12 h,備用。

將孔板中的培養基吸出,每孔加入100 μL不同質量濃度的被多肽修飾的金納米花(0、80、160、240和360 μg/mL),混合均勻。培養8 h后,每孔再加入10 μL CCK-8試劑,輕輕敲擊培養板以幫助混勻,繼續培養4 h。最后,將孔板置于450 nm波長下進行檢測。用同樣方法檢測不同物質的量濃度的Cu2+(0、50、100、150、200 μmol/L)對細胞的氧化損傷。細胞存活率計算公式為:細胞存活率=(實驗組吸光值-CCK-8本底吸光值)/(對照組吸光值-CCK-8本底吸光值)×100%。

1.3.5 Cu2+誘導細胞氧化損傷的SERS檢測

貼壁生長的HepG2細胞在加入金納米花的培養基中培養12 h后,將CuCl2溶液加入培養基,使其Cu2+物質的量濃度分別為0、50、100、150和200 μmol/L,在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養8 h后,用共聚焦顯微拉曼光譜儀進行表征。拉曼光譜儀的參數設置如下:激發波長為633 nm,掃描范圍為400～1 800 cm-1,物鏡放大倍數為50,掃描時間為10 s,循環次數為1次,每個樣品上隨機選取10個測試點。實驗重復3次,獲取平均SERS光譜。

2 結果與討論

2.1 金種子(AuNPs)的表征

圖1是AuNPs的表征結果。圖1a顯示,AuNPs的紫外吸收峰分別在521 nm (15 nm)和523 nm (25 nm)左右,隨著AuNPs粒徑的增大,能級間隔減小,對應的吸收峰位將靠近較長波段,即表面等離子體共振(LSPR)吸收峰會出現一定程度的紅移,符合AuNPs直徑與其LSPR吸收峰之間的變化規律[14]。圖1b、1c表明,AuNPs呈尺寸均勻的圓形,且分散性良好。使用Nano Measure對AuNPs進行粒徑統計,結果如圖1d、1e所示。15 nm AuNPs平均粒徑為15.1±1.1 nm,25 nm AuNPs平均粒徑為25.1±1.5 nm。對AuNPs進行Zeta電位表征,電位值為-25.3 mV,這是因為檸檬酸根離子在合成AuNPs的過程中起到還原劑和穩定劑的作用,并使納米顆粒表面帶負電荷,防止它們在溶液中發生聚集。

圖1 金種子表征結果

2.2 金納米花(AuNFs)的表征

AuNFs的透射電鏡表征結果如圖2a～2c所示。在支角生長階段,Au以AuNPs為基礎在表面異向生長,當AuNPs粒徑較大時,隨之合成的AuNFs尺寸較大。HEPES作為形貌誘導劑,能夠控制AuNPs表面支角的生長,當HEPES濃度較高時,AuNFs表面支角數量增多,長度增大。

圖2 金納米花表征結果

使用Nano Measure對AuNFs進行粒徑統計,結果如圖2d～2f所示。25 nm AuNPs在高濃度HEPES中介導合成的AuNFs平均粒徑為94.1±1.7 nm,15 nm AuNPs在低濃度HEPES中介導合成的AuNFs平均粒徑為55.3±1.5 nm,15 nm AuNPs在高濃度HEPES中介導合成的AuNFs平均粒徑為74.3±1.9 nm。對AuNFs進行Zeta電位表征,電位值為-29.4 mV。

圖3為不同實驗條件下制備的AuNFs紫外可見吸收光譜圖。通過比較AuNFs最大吸收峰的位置可知,當HEPES的添加量增加后,未離心組的LSPR吸收峰由579 nm紅移至585 nm,離心組的LSPR吸收峰由570 nm紅移至583 nm,符合AuNFs形貌與LSPR吸收峰位置之間的關系。對于不規則的金納米花顆粒,其形貌越復雜,表面支角越多、越尖銳,LSPR吸收峰紅移越明顯。離心后的AuNFs出現微小的藍移,同時吸光度有所下降,這可能是因為離心后除去了粒徑較小的AuNFs以及反應后多余的試劑。此外,在未離心組的光譜圖中可以看到,530 nm左右有1個小峰,這可能是由溶液中殘余的AuNPs造成,也有可能是AuNFs核心等離子體共振與支角等離子體共振模式雜交,從而出現2個LSPR吸收峰。

圖3 金納米花的紫外可見吸收光譜圖(15 nm金種子)

由于制備的納米顆粒最終需要進入細胞,材料粒徑過大不利于細胞胞吞且容易發生聚集,故選用15 nm AuNPs在低濃度HEPES中介導的AuNFs作為后續實驗材料。

2.3 金納米花SERS探針和Cu2+的細胞毒性實驗

利用種子生長法制備的金納米花經離心濃縮后質量濃度為1 600 μg/mL,將其加入完全DMEM高糖培養基中混勻,分別配制成質量濃度為0(空白對照)、80、160、240、320 μg/mL的細胞培養液,與指數生長期的細胞混合培養8 h,用CCK-8法進行細胞毒性檢測,計算細胞存活率。由圖4a可知,當金納米花質量濃度較低時,細胞存活率較高,金納米花質量濃度增加,細胞存活率逐漸降低,說明材料本身也對細胞具有一定程度的生長抑制作用。由于金納米花是拉曼增強基底,為了獲得較高的拉曼信號并盡量降低對細胞的損傷,故選擇質量濃度為160 μg/mL的金納米花作為后續實驗材料。

圖4 CCK-8細胞毒性檢測結果

以Cu2+作為細胞的氧化損傷誘導劑,分別配置Cu2+物質的量濃度為0、50、100、150、200 μmol/L的完全DMEM高糖培養基,與細胞共培養8 h后進行CCK-8細胞毒性檢測,計算細胞存活率。由圖4b可知,Cu2+的存在對細胞生長會產生顯著損傷,隨著Cu2+物質的量濃度的升高,細胞存活率大大降低,這可能是由于Cu2+破壞了細胞內的氧化還原平衡,誘導細胞產生氧化應激反應,進而造成不可逆損傷。因此,可以利用Cu2+誘導的細胞作為氧化損傷模型,用于進一步的拉曼檢測。

2.4 Cu2+誘導細胞氧化損傷的SERS檢測分析

由圖5可知,HepG2細胞使用不含金納米花的DMEM培養基培養6 h后,基本無明顯拉曼信號峰,金納米花本身也無明顯拉曼信號峰。將一定濃度的金納米花加入到培養基中,與HepG2細胞共同培養6 h后進行拉曼信號檢測,得到數個較為明顯的信號峰。這表明細胞對金納米花進行胞吞,使金納米花成功進入到細胞內部。同時,信號峰反映出細胞內的部分物質,HepG2細胞的各拉曼光譜峰所對應的物質歸屬如表1所示。

表1 拉曼光譜峰對應的物質歸屬[15]

圖5 HepG2細胞的拉曼光譜圖

2.5 Cu2+誘導細胞氧化損傷的SERS表征

分別用Cu2+物質的量濃度為0、50、100、150、200 μmol/L的DMEM完全培養基處理細胞6 h和12 h,并進行拉曼光譜表征,結果如圖6所示?？梢钥闯?不同Cu2+處理時間的HepG2細胞的平均拉曼光譜圖存在較大差異,相比于6 h的處理時間,處理12 h細胞的SERS峰強度整體偏弱,說明隨著處理時間的延長,細胞的受損程度隨之變大。

對相同物質的量濃度Cu2+處理不同時間的HepG2細胞進行拉曼光譜檢測,所得拉曼光譜作歸一化處理,進行差譜分析,結果如圖7所示?？梢钥闯?經不同物質的量濃度Cu2+處理后,HepG2細胞均出現了不同程度的損傷。

糖類的變化:細胞中糖原(490 cm-1)和碳水化合物(1 153 cm-1)的含量均發生變化,隨著細胞氧化損傷程度的加深,糖類物質含量不斷減少。

核酸的變化:相比于6 h處理時間,經12 h處理的HepG2細胞在1 083 cm-1、788 cm-1處的光譜強度均有所減弱。1 083 cm-1處的峰代表DNA骨架磷酸二酯基團的對稱伸縮振動,788 cm-1處的峰代表DNA骨架磷酸根的對稱伸縮振動?？梢?隨著細胞氧化損傷程度的加深,DNA骨架斷裂,雙螺旋結構發生改變,核酸含量減少。

脂類的變化:1 450 cm-1處的峰代表脂質CH2和CH3的振動峰,從拉曼光譜圖中可以看出,細胞中脂質含量相對較少且變化不大。這可能是因為HepG2細胞本身生長迅速、耗能快,脂質提供細胞生長所需能量,難以在癌細胞內積累。

蛋白質的變化:蛋白質分子的苯丙氨酸和酪氨酸殘基中的C—O伸縮振動峰出現在1 174 cm-1附近,蛋白酰胺Ⅰ的α螺旋結構出現在1 655 cm-1處,肽鏈骨架C—C鍵振動峰位于937 cm-1處,這些峰均出現了相應的變化,說明細胞氧化損傷對蛋白質產生了氫鍵破壞、二硫鍵斷裂和脫酰胺作用等,蛋白質發生空間結構改變,造成了生物活性功能的改變。

糖類、核酸、脂類和蛋白質的變化均可能改變細胞的形態、結構和功能,使之無法維持正常生理活動,從而引發各種疾病。

3 結論

本研究建立了一種基于無標記納米材料增強拉曼光譜對細胞氧化損傷進行檢測的方法。制備出有多肽修飾的金納米花作為拉曼增強基底,成功觀察到金納米花進入細胞,且達到信號增強的效果。利用CCK-8法進行細胞毒性檢測,確定金納米花作為拉曼增強基底可以在盡量不損傷細胞的情況下達到良好的拉曼增強效果,其適宜的質量濃度為160 μg/mL。進一步檢測Cu2+對HepG2細胞造成的氧化損傷,發現經Cu2+誘導后,細胞出現明顯損傷和死亡,且隨著Cu2+物質的量濃度的提高,細胞受損程度增大。最后,建立了Cu2+誘導的細胞氧化損傷模型,并獲得不同Cu2+處理條件下細胞的拉曼光譜,發現經氧化處理后的細胞均受到不同程度的損傷,細胞內的糖類、核酸、脂質和蛋白質等物質均出現了一定程度的改變,對機體造成了損傷。