神經生長因子改善糖尿病大鼠隨意皮瓣缺血壞死的機制

王曉武，朱仙懂，王永強，吳志炫，溫知楷，吳大洲，陳吉彩

溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.肝膽胰外科；2.甲狀腺外科；3.乳腺外科；4.疝與腹壁外科

皮瓣移植是修復外傷、腫瘤切除、下肢血管性潰瘍或糖尿病引起的皮膚缺損的重要外科技 術[1-3]，但是移植后的皮瓣壞死仍是問題[4-5]；而目前國內外的主流觀點是認為皮瓣的壞死是由血流再灌注不足、回流阻塞以及缺血再灌注損傷所引起的，而后者會引發皮瓣組織循環障礙、活性氧物質大量生成等系列問題[5]。這將會影響皮瓣組織和細胞的形態和功能，以及細胞“微環境”-細胞因子的變化。機體內細胞因子是一個復雜的網絡關系，每種因子的作用不可忽視，因此探討每種因子的作用將有助于多層次的了解缺血隨意皮瓣存活與生長因子的關系。有研究發現神經生長因子（nerve growth factor, NGF）能促進不同類型皮瓣的存活，并能促進移植皮瓣感覺恢復[6]，但是具體分子機制仍不詳。本研究以大鼠糖尿病缺血隨意皮瓣為代表模型，通過動物和細胞實驗探討NGF改善糖尿病大鼠隨意皮瓣缺血壞死的分子機制，為NGF應用于糖尿病缺血隨意皮瓣存活和防治提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物造模與分組 實驗所需動物來自溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（浙）2021-0017。6～8周的240～320 g健康雄性Wistar大鼠40 只。飼養環境：5 只/籠，SPF環境（溫度20～24 ℃，濕度50%～60%）下，用蒸餾水和優質實驗飼料喂養。使動物適應環境1周后展開后續的動物實驗。動物實驗方案已通過溫州醫科大學實驗動物倫理委員會審批（WYYY-AEC-2023-036）。建立I型糖尿病大鼠模型，40只大鼠注射1%鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ，65 mg/kg）[7]。在STZ注射前1天及注射后第3、5、7天，通過監測尾靜脈血液中的血糖濃度是否超過16.67 mmol/L證實模型成功與否。I型糖尿病模型穩定后，隨機分為DM組（20 只）、DM+NGF組（20只）。在I型糖尿病模型上，對2組大鼠建立改良McFarlane皮瓣模型[8]。建模流程：將所有大鼠利用異氟烷誘導和維持麻醉，將每只大鼠俯臥置于塑料板上，固定肢體，用剃刀進行背部備皮，范圍為3 cm×9 cm，用亞甲藍標記矩形隨機皮瓣范圍（寬3 cm、長9 cm）進行皮瓣模型建立，而皮瓣手術均由熟悉皮瓣移植的同一人完成。具體手術步驟：將皮膚和淺筋膜與深筋膜完全剝離，保留真皮下毛細血管網，保留蒂部并結扎蒂部雙側髂動脈；采用4-0醫用縫合線將皮瓣修復至原位。術后DM+NGF組在皮瓣固定點處注射10 nmol/（mL·kg）NGF[9]，DM組注射等量0.9%氯化鈉溶液7 d，完成相應實驗并收集組織標本后用1%～3%劑量的異氟烷和氧氣混合氣體麻醉大鼠，使大鼠安樂死。

1.1.2 細胞實驗與分組 人臍靜脈內皮細胞 （human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）由上海iCell公司提供。使用ECM完全培養基，配置體系為500 mL ECM基礎培養基+5 mL內皮生長添加物+5 mL青霉素/鏈霉素溶液，按比例配置完全培養基。培養環境為：37 ℃，5% CO2細胞培養箱。待HUVEC融合度達到85%～90%，細胞呈鵝卵石 狀，狀態良好，培養基無污染，用胰酶-EDTA（含0.25%胰酶）消化細胞，進行細胞計數，再進行后續細胞建模和實驗。為確認HUVEC高糖模型的糖濃度，向ECM完全培養基中添加不同濃度的10%葡萄糖溶液使 培養基最終糖濃度為5.5、15、25、37.5 mmol/L， 通過CCK-8實驗檢測HUVEC的活性，最終確認細胞高糖模型的葡萄糖濃度為25 mmol/L，并與ECM完全培養基配制成高糖ECM完全培養基，作為后續細胞培養的培養基?；谠撃Ｐ?，將細胞實驗分為細胞模型組（DM組）和細胞實驗組（DM+NGF）組。為確定NGF對高糖環境下HUVEC活力影響的最適合濃度，在高糖ECM完全培養基中加入不同濃度NGF溶液，使得NGF最終濃度為0、12.5、25、50、100、200 ng/mL，將其置于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中處理24 h，通過CCK-8實驗檢測細胞活力和增殖情況。

1.1.3 主要耗材與試劑 NGF購自武漢海特生物制藥股份有限公司；STZ和Triton X-100購自由美國Sigma公司；基質膠和transwell小室購自美國Corning公司；TRIzol試劑、SYBR Green和反轉錄試劑盒（K1622）購自美國Thermo Fisher公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技公司；抗熒光淬滅封片液、DAPI染色液、4%細胞固定液、0.1%結晶紫染色液購自上海碧云天生物技術有限公司。CCK-8試劑盒由美國Biolite公司提供；4%多聚甲醛、DAB顯色試盒和HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫（H2O2）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；CD31一抗（兔源）購自英國Abcam公司；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、糖基化終未產物受體（receptor for advanced glycation products,RAGE）和微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance protein 2, MCM2）一抗（兔源）購自美國Affinity公司；HRP標記山羊抗兔IgG和HRP標記山羊抗鼠IgG購自中國Bioworld公司；Cora?Lite 488熒光二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；其余試劑和生物化學試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計和生產。

1.2 方法

1.2.1 皮瓣壞死存活的測量 術后第7天（POD7），使用高級攝影照相機對所有皮瓣進行評估。肉眼觀察皮瓣顏色；是否結痂、出血、分泌物滲出；毛發發育和顏色。用拓印紙拓印皮瓣壞死和存活面積，然后將數據導入ImageJ軟件測量并評估存活皮瓣的面積。計算公式：皮瓣存活百分比（%）=存活區范圍/整個皮瓣。

1.2.2 HE染色 用手術器械采集大鼠背部皮瓣的皮瓣組織，在4%多聚甲醛中固定24 h。第2天取出組織樣本，修整至0.5 cm×0.5 cm大小，然后沖洗、脫水并用組織包埋機將其包埋在石蠟中，再用組織切片機將皮瓣蠟塊切成4～5 μm厚的組織石蠟切片。根據HE染色試劑盒的說明書對組織切片進行染色。在光學顯微鏡下觀察隨機多視野下拍照。

表1 引物序列

1.2.3 免疫組化染色 將組織石蠟切片進行烘干、脫蠟、水化處理，按照先前工作流程以及前期預實驗探索地染色條件進行組織切片的染色、脫水、透明和封片[10]。不同的是本實驗的一抗為CD31（1:200）和VEGF（1:400）。最后，在光學顯微鏡下觀察并在隨機多視野下拍照。

1.2.4 CCK-8實驗 根據不同濃度的NGF（0、12.5、25、50、100和200 ng/mL）設置組別，每組至少3個孔。往96孔板中添加細胞（5 000個細胞/孔），用25 mmol/L糖濃度ECM完全培養基進行培養24 h，待其貼壁，24 h后，移去舊培養基，加入不同濃度的NGF，培養24 h。再向每孔加入10 μL的10% CCK-8溶液，在細胞培養箱中黑暗孵育1～4 h，然后用酶標儀（美國Thermo公司）在450 nm測定OD值，并對數據進行統計學分析。

1.2.5 細胞增殖計數實驗 消化、重懸和計數良好長勢的細胞，向96孔板中的每個孔中加入3 500個細胞。在高糖ECM完全培養基上，設定組別為NGF（0、50、100和200 ng/mL），每組至少3個孔。之后流程按照先前工作進行[10]，用不同濃度的NGF培養1、3、5 d，在固定時間點消化各組細胞，計數。最后對數據進行統計分析。

1.2.6 MCM2+細胞免疫熒光 設置細胞DM組和DM+NGF組。首先，往含有圓形爬片的12孔板中加入細胞（10 000～20 000個細胞/孔），搖勻細胞、待細胞貼壁。之后DM+NGF組加入含NGF的高糖ECM完全培養基，兩組均培養24 h。然后，根據先前工作流程進行后續操作[10]，以MCM2抗體為一抗。最后用免疫熒光顯微鏡在隨機多視野下對MCM2+細胞進行拍攝。

1.2.7 劃痕實驗 在6孔板接種相同濃度的細胞量并晃勻。待細胞融合度達到100%時，用200 μL的黃色槍頭進行劃痕，用PBS洗去脫落細胞，DM組中加入2 mL的（內含2%血清+25 mmol/L葡萄糖，不含內皮生長添加物）ECM培養基，而在DM+NGF組中加入上述ECM培養基并添加100 ng/mL NGF，置于細胞培養箱中培養24 h。在0、24 h時間點在光學顯微鏡下觀察和拍攝圖片。結果采用ImageJ軟件進行統計和分析。

1.2.8 Transwell實驗 將30 000個細胞加入上室中。向DM+NGF組中加入100 ng/mL NGF，向對照組中加入PBS。將800 μL（內含20%血清+25 mmol/L葡萄糖，不含內皮生長添加物）ECM培養基加入到下室中，將其在細胞培養箱中培養24 h。之后流程按照先前工作進行[10]，最后在倒置顯微鏡下隨機視野拍照并進行統計分析。

1.2.9 血管形成實驗 將基質凝膠從-20 ℃的冰箱中取出，將其包埋在干冰中，使其成為液體狀態。將50 μL/孔的基質凝膠加入到96孔板中，搖動凝膠使其均勻分布。將其放置在細胞培養箱3～4 h讓膠固化。將同一瓶中的細胞消化并在離心機中離心以獲得兩管沉淀的細胞團，然后將它們加入到含有或不含有NGF的高糖ECM完全培養基中，再重新懸浮細胞并計數。將35 000個細胞/100 μL細胞懸液加入到96孔板中，并將該板轉移到細胞培養箱中進行培養。在0和6 h時用倒置顯微鏡拍攝血管生成的照片。使用ImageJ軟件對獲得的圖像進行統計分析。

1.2.10 NGF與常見血管生成相關因子的關系 將NGF和常見的血管生成相關基因[VEGF、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor, EGF）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）血小板衍生生長因子A（platelet derived growth factor A, PDGFA）、基質細胞衍生因子1α（stromal cell derived factor 1α, SDF1α）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、精氨酸酶-1（arginase-1, Arg-1）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）]輸入STRING 11.0數據庫建立PPI，并分析這些基因的GO和KEGG功能富集情況。

1.2.11 RT-qPCR 實驗過程參考以前的工作[10]。HUVEC的總RNA提取按照總RNA提取試劑盒說明書進行。7500 Fast系統（American Applied Biology Systems, USA）用于RT-qPCR分析。采用上海捷瑞生物工程有限公司研發的mRNA特異性引物檢測VEGF、PDGFA、SDF1α、HIF-1α、EGF、Arg-1、bFGF的表達。采用2-ΔΔCt法分析結果。

1.2.12 RNA-seq 測序數據集包含6個HUVEC樣本，分為兩組：DM組（25 mmol/L高糖正常組，3個樣本）和DM+NGF組（25 mmol/L高糖+24 h NGF處理組，3 個樣本）。收獲細胞團低溫保存并運送至上海前程生物科技有限公司進行RNA-seq操作和分析。使用RNAmini試劑盒（Qiagen, Germany）從細胞中提取總RNA。mRNA的富集、片段化、反轉錄、文庫構建、Illumina Novaseq 6000和數據分析由Tenk Genomics進行。利用R軟件的DESeq2軟件包分析后，根據|log2FC|≥1和P＜0.05選擇差異表達mRNAs。然后在Reactome數據庫中分析差異表達的mRNAs的功能富集情況。

1.2.13 Western blot實驗 實驗方法參考本課題組前期研究成果[10]。根據細胞分組對細胞進行培養和預處理后收集細胞提取細胞蛋白質進行Western blot實驗；根據動物實驗的分組分別獲取相應的動物皮瓣蛋白并進行Western blot實驗。使用的抗體如下：CD31、p-ERK1/2（1:1 000）；VEGF、RAGE（1:1 000）；絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）、p-AKT、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K，1:1 000）。

1.3 統計學處理方法

采用Graphpad Prism 8軟件對數據進行統計學分析。正態分布計量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NGF對糖尿病大鼠隨意皮瓣存活面積率的影響

在皮瓣移植模型后的第7天，DM組所有大鼠在所有皮瓣的I區（遠端區）的大部分皮瓣中形成痂，沒有毛發生長。在皮瓣II區（中間部分）和III區（蒂部區）的傷口邊緣有散在的痂和變黑。DM+NGF組I區少數大鼠皮瓣呈棕褐色和暗紅色，其余皮瓣區無黑色痂，有少量毛發生長，而I、II、III區其余大鼠皮瓣無黑色硬痂，有少量毛發生長。與DM組比，DM+NGF組皮瓣存活率更高。術后第7天發現DM+NGF組皮瓣存活率高達85%～90%，而DM組為70%～75%，兩組間差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 術后第7天NGF對I型糖尿病大鼠缺血隨意皮瓣存活的影響

2.2 NGF促進糖尿病缺血隨機皮瓣的血管生成

與DM組比，DM+NGF組皮瓣中有更多的新生微血管，且DM+NGF組中CD31+微血管的密度比DM組高，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2A。免疫組化和Western blot結果顯示，皮瓣組織DM+NGF組CD31和VEGF表達水平高于DM組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2B、圖2C。

圖2 皮瓣組織HE染色、CD31/VEGF指標免疫組化染色及CD31/VEGF相應蛋白表達量的結果

2.3 移植皮瓣的存活和血管生成與AGE-RAGE/MAPKERK1/2信號通路的關系

與DM組比，10 μg/mL NGF的DM+NGF組RAGE蛋白表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；而MAPKERK1/2信號通路中p-ERK1/2的蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 移植皮瓣存活和血管生成與AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號通路的關系

2.4 NGF促進高糖環境中HUVEC的活力和增殖

HUVEC的活性隨著葡萄糖濃度增加而降低；與5.5 mmol/L濃度比，在25.0 mmol/L和37.5 mmol/L濃度下HUVEC的活性降低，差異有統計學意義（P＜0.05），但25.0 mmol/L和37.5 mmol/L間差異無統計學意義（P＞0.05），可能達到HUVEC細胞可以耐受的最高葡萄糖濃度，見圖4A。因此，用25 mmol/L葡萄糖建立細胞高糖模型。不同濃度的NGF對25 mmol/L 葡萄糖中HUVEC活性的影響，在0～100 ng/mL濃度范圍內，HUVEC活性隨NGF濃度的增加而增加，NGF在100 ng/mL時增殖最明顯，差異有統計學意義（P＜ 0.01），見圖4B。100 ng/mL的NGF作用6 d也是增殖效果最顯著的，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4C。與DM組比，DM+NGF組的MCM2+陽性細胞數較多，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4D。

圖4 NGF對在高糖環境下HUVEC增殖的影響

2.5 NGF促進高糖環境中HUVEC的遷移和血管生成

在25 mmol/L葡萄糖濃度下，DM+NGF組在24 h內的愈合面積比DM組大，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5A。DM+NGF組較DM組遷移細胞數多，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5B。25 mmol/L葡萄糖濃度下，100 ng/mL NGF組6 h內血管形成的總長度、總分支長度和總分段長度均大于DM組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5C。

圖5 在25 mmol/L葡萄糖環境中100 ng/mL NGF對HUVEC遷移和血管生成的影響

2.6 NGF上調血管生成相關因子的表達

NGF與常見血管生成因子的關系及功能富極化分析結果：NGF與VEGF、PDGFA、EGF、HIF-1α、SDF1α、Arg-1、bFGF、TGF-β相互作用；這些基因的GO分析結果主要富集到了內皮細胞增殖和遷移、表皮生長因子信號通路、傷口愈合、生長因子受體激活和調控、血管生成和PI3K分子調控相關的功能（P＜0.05），見圖6A-D。KEGG分析的結果主要涉及MAPK信號通路和AGE-RAGE信號通路。與DM組比，DM+NGF組的VEGF、PDGFA、HIF-1α、Arg-1和bFGF的mRNA相對表達量均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖6E-K。與血管生成相關的主要因子VEGF在DM+NGF組中比DM組蛋白相對表達量高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6L。

圖6 NGF與常見血管生成相關因子的互作、功能富極化分析和表達調節的結果

2.7 HUVEC的RNA-seq的結果

DM+NGF組中MMP-2、ZNF33B、TPP1等基因表達量高于DM組，ZNF330、LIME1等基因表達量低于DM組，見圖7A、圖7B。在Reactome數據庫中，這些差異基因 主要富含與MAPK信號通路相關的代謝通路，見圖7C。

圖7 HUVEC的RNA-seq的結果

2.8 HUVEC表型與AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號通路的關系

在25 mmol/L葡萄糖濃度下，100 ng/mL NGF促進了HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成。與DM組比，DM+NGF組中RAGE的蛋白表達降低，MAPK信號通路中的p-ERK1/2的蛋白表達增多，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖8。

圖8 HUVEC表型與AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號通路間關系

3 討論

近年來，隨著糖尿病相關的慢性難愈合性創面（chronic refractory wounds, CRWs）或其他CRWs[11]的發病率不斷增加，隨意皮瓣移植的應用也將顯著增加，但隨意皮瓣存活和壞死問題仍未解決。而影響皮瓣存活與壞死的關鍵因素之一是血管狀態，它也是皮瓣存活與壞死之間的橋梁[12]。本研究創新性地關注NGF與糖尿病隨意缺血皮瓣成活及血管生成的關系，首次通過細胞和動物實驗證實，NGF通過影響AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號通路促進糖尿病缺血隨意皮瓣血管生成，而益于皮瓣成活。以往的研究表明，大鼠缺血皮瓣的存活與細胞因子途徑有關[13]。然而，據報道細胞因子在糖尿病皮膚中經常被混淆和缺乏表達，常見的因子包括 bFGF、VEGF和NGF等[14]。NGF是一種最常見的神經營養因子，其主要結構是由三個α 2βγ 2亞基組成的復合體，β亞基是NGF發揮生物學功能的主要結構[15]。有報道稱，NGF除了本身有營養神經的功能之外，還有很強抗炎作用[15]、促進血管生成[16]，修復創 面[14]、減少氧化應激損傷[17]等作用，NGF還能促進不同類型皮瓣的存活，但機制不詳。本研究為了探討NGF對糖尿病缺血隨意皮瓣成活的影響，通過動物實驗發現，DM+NGF組皮瓣成活面積比DM組多10%～20%。DM+NGF組中CD31+標記的微血管數量和CD31相對蛋白表達水平均高于DM組；但DM+NGF組和DM組中VEGF的整體表達水平非常低，這可能是VEGF抗體結合不良的原因，但并不影響實驗結論。與DM組比，DM+NGF組中皮瓣組織蛋白中VEGF的高表達也證實了這一點。上述結果表明NGF能促進糖尿病皮瓣血管生成，有利于皮瓣成活。

血管生成是一個復雜的過程，其中內皮細胞受血管生成相關的促進和抑制因子的調節，并涉及多種信號通路的參與[18]。這一過程中常見的調節因子有VEGF、HIF-1α、bFGF、PDGFA、EGF等。其中，VEGF是促進血管生成的主要因子；而與血管生成相關的常見信號通路包括p38 MAPK-ERK1/2信號通路和PI3K-AKT信號通路[19-20]。本研究結果表明，在 25 mmol/L葡萄糖環境中，100 ng/mL NGF可刺激HUVEC分泌VEGF、PDGFA、HIF-1α、Arg-1和bFGF等與血管生成相關的因子，促進血管生成。許多研究報告稱，在糖尿病皮膚中發現許多因子缺乏，包括NGF[14]。結合糖尿病皮膚結構中微血管的減少和周圍神經的損傷，推測NGF可能是導致糖尿病因子紊亂和缺乏的關鍵因素。關于NGF的促進血管生成作用，有研究[21]發現NGF促進血管生成與直接和間接影響VEGF表達有關；但HAN等[22]發現，NGF促血管生成作用不受VEGF抑制劑的抑制，或許這與NGF促進內皮細胞分泌bFGF等其他血管生成相關的促進因子有關。NGF向細胞因子網絡提供信號并促進血管生成。內皮細胞首先影響皮瓣的微環境和微環境中的細胞狀態。在NGF的刺激下，內皮細胞分泌血管生成因子，如VEGFA。VEGFA通過激活多種酶，如VEGFR2、VEGFA相關的絲裂原活化激酶和激活MAPKERK1/2通路，可產生內皮細胞存活、增殖、遷移和血管生成的生物學效應[7]。此外，NGF還可刺激bFGF在內的其他因子通過其下游靶分子信號促進血管生成?？傊?，NGF影響內皮細胞分泌血管生成相關的生長因子，這些因子在促進內皮細胞的增殖、遷移和血管生成中發揮協同作用，導致缺血皮瓣血管生成增加，改善皮瓣的缺血，促進其存活。

在探討何種機制時，本研究發現了NGF與AGERAGE/MAPK-ERK1/2信號通路有關。至于與糖尿病并發癥相關的AGE-RAGE信號通路，其主要與兩個主要分子AGEs和RAGE有關。AGEs是糖基化末端物質，主要是原糖與蛋白質糖基化產生的不可逆的穩定產物，它們通常在糖尿病患者中高度表達[23]。至于RAGE，屬于免疫球蛋白超家族，主要表達在內皮細胞和單核細胞的膜上。在血管損傷領域，AGEs與RAGE結合后會內化到內皮細胞的細胞外基質中，導致血管基底膜的形態和功能發生劇烈變化，從而導致血管的功能和結構發生改變。兩者結合可以通過NF-κB[24]信號通路刺激多種下游靶基因的表達，進一步導致炎癥因子和氧自由基產物的產量增多，引起了包括內皮細胞在內的細胞微環境的變化和細胞損傷甚至死亡。這種變化在宏觀上體現之一為皮瓣血管狀態的改變，類似于皮瓣缺血再灌注損傷過程中活性氧的產生、內皮細胞的損傷和炎癥因子的瀑布式爆發導致的血管改變。更糟糕的是氧自由基產物增加了糖酵解途徑中的中間產物數量，相應地增加了AGEs的數量，從而引發炎癥的惡性循環[25]。本研究發現，NGF降低了高糖環境下內皮細胞RAGE的表達，從而抑制了這種惡性循環。據文獻報道，高表達的p-ERK1/2 還能促進內皮細胞的增殖、遷移和血管生成，這與本研究細胞實驗結果一致，即 100 ng/mL的NGF能促進含25 mmol/L葡萄糖的高糖環境中HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成，這些表型與MAPK-ERK1/2通路有關[26]。這一點也與細胞RNA測序結果發現與MAPK信號通路有關相符合。

綜上所述，本研究首次通過細胞和動物實驗證實了NGF通過影響AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號通路促進糖尿病缺血隨意皮瓣血管生成而益于皮瓣成活，為糖尿病缺血皮瓣的研究做好鋪墊，也為皮瓣存活和防治壞死提供了理論支持。