蛋白質琥珀?；瘏⑴c丁酸抑制胃癌細胞增殖及遷移的作用

黃穎鵬，張珂，吳芳全，施迪邦，韓千年，王方巖

1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學 基礎醫學院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 消化內科，浙江 溫州 325027

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，其高發病率和高病死率使其成為世界第五大癌癥。據統計，2020年全球有超過100萬例胃癌新發病例，約占確診的癌癥總數的5.6%[1]。在我國，每年約有679 100例胃癌患者確診[2]，由于早期診斷技術的普及不足，約有80%患者在診斷時已是腫瘤進展階段。手術切除腫瘤是早期胃癌最主要的治療方法[3]，而對于晚期胃癌患者，目前以化療和靶向治療為主[4]。然而，接受化療的晚期胃癌患者仍面臨耐藥、腫瘤復發等問題[5]，因此，深入研究有效的新型治療藥物及其相關作用機制具有重要意義。

丁酸是人體內主要由腸道菌群代謝產生的一種短鏈脂肪酸[6]，是腸道上皮細胞重要能量來源，具有抗炎、保護腸道屏障的功能[7-8]。目前已有越來越多研究發現丁酸在抗腫瘤治療中的作用[9-11]，尤其是消化道腫瘤。HAGUE等[12]發現，丁酸鈉通過抑制組蛋白去乙?；?、激活p53依賴性的p21表達，從而體外抑制人結腸癌細胞生長。在胃癌中，已有初步研究表明丁酸鈉能夠通過多種途徑誘導胃癌細胞凋亡[13-14]。丁酸鈉作為人體來源的天然代謝產物，其低毒性的特點為其臨床應用提供了巨大優勢。丁酸鹽能夠有效減少全身使用毒性的同時降低治療劑量，這種天然優勢是丁酸在臨床上治療胃癌的重要依據。因此，研究丁酸鈉在胃癌治療中全新潛在機制，對于探索胃癌新型治療方案具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞 人胃癌BGC-823細胞和AGS細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要藥物和試劑 丁酸鈉（上海阿拉丁公司）；EdU Apollo567 試劑盒（廣州銳博生物公司）；琥珀?；贵w（杭州景杰生物公司）；GAPDH抗體（杭州華安生物公司）；FITC-IgG抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；SYBR Green Master Mix（美國Roche公司）；線粒體熒光探針MitoTracker Red CMXRos（上海翌圣生物公司）。

1.1.3 主要儀器 CO2培養箱、低溫高速離心機（美國Thermo公司）；正置顯微鏡（美國Nikon公司）；酶標儀、垂直電泳系統、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 胃癌細胞AGS和BGC-823在37 ℃、 5% CO2細胞培養箱中使用含10% FBS的DMEM培養基培養。生長至融合度約80%時，進行細胞傳代。

1.2.2 EdU細胞增殖實驗 取對數生長期BGC-823、AGS細胞，以每孔1×104個細胞數接種于96孔板中。丁酸處理組加入5 mmol/L丁酸鈉培養48 h[15-16]，對照組加入等量磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。加入含 50 μmol/L EdU的培養基，孵育2 h后按試劑生產商說明進行固定、中和、通透、染色等操作，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Transwell實驗 向BGC-823、AGS細胞中加入5 mmol/L丁酸鈉培養48 h，對照組加入等量PBS。待處理完成后，將細胞消化，按5×104個/孔加入Transwell上室并用無血清培養基培養。同時，下室加入含有10% FBS的培養基。孵育24 h后，取出小室，棄去上層培養基，固定后使用0.4%結晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Western blot實驗 向細胞培養基中加入5 mmol/L丁酸鈉處理不同時間（對照組加入等體積PBS）后棄培養基，收集細胞并提取蛋白，經濃度測定后行SDS-PAGE凝膠電泳，根據試劑生產商說明進行轉膜、封閉后使用對應一抗及二抗孵育以及曝光。在凝膠成像儀中進行顯像。

1.2.5 RT-qPCR檢測 使用TRIzol RNA分離試劑從細胞中分離總RNA并通過反轉錄酶試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。qPCR采用SYBR Green Master Mix II作為熒光標記，在高通量熒光定量PCR儀上以上95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s的程序進行40～45個循環及定量。運行結束后結合內參Ct值，根據2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6 免疫熒光染色 向細胞培養基中加入 5 mmol/L丁酸鈉處理不同時間（對照組加入等體積PBS）后棄培養基，用4%多聚甲醛在室溫下固定細胞30 min后用PBS洗滌2次，加入0.5 Triton X-100通透15 min，用5%山羊血清進行室溫封閉15 min。加入相應抗體后放入濕盒內4 ℃過夜孵育。室溫靜置30 min后，PBS洗滌3次，分別用FITC偶聯的抗兔或抗鼠IgG抗體（1:500）檢測特異性結合的一抗。PBS洗滌后用DAPI對細胞核進行染色，在Nikon正置熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3 統計學處理方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丁酸抑制胃癌細胞增殖能力

使用5 mmol/L丁酸鈉處理胃癌細胞系AGS和BGC-823 48 h后通過EdU染色檢測細胞增殖能力，結果顯示，兩種胃癌細胞在丁酸處理后密度均有所降低，同時丁酸處理組EdU染色陽性的增殖細胞數量顯著低于對照組（P＜0.01），見圖1A、圖1B。此 外，丁酸鈉處理48 h后細胞遷移能力的Transwell檢測結果顯示，丁酸鈉處理能夠顯著抑制胃癌細胞AGS和BGC-823的遷移（P＜0.01），見圖1C、圖1D。

圖1 丁酸鈉處理后胃癌細胞的增殖和遷移情況

2.2 丁酸顯著影響BGC-823細胞能量代謝組

使用5 mmol/L丁酸鈉處理胃癌細胞系BGC-823 48 h并收集細胞代謝物進行代謝組學分析。KEGG富集分析結果顯示，丁酸處理后的胃癌細胞中代謝途徑主要富集到三羧酸循環、氧化磷酸化等生物主要代謝途徑（圖2A），表明丁酸在影響細胞代謝中發揮了極其重要的影響作用。丁酸處理后胃癌細胞中的代謝物變化結果表明，與對照組相比，丁酸處理組L-蘋果酸、琥珀酰輔酶A、延胡索酸、黃素單核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）顯著上調，而草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）、還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）顯著下調（圖2B、圖2C）。

圖2 丁酸處理后胃癌細胞BGC-823代謝特征變化

2.3 丁酸促進BGC-823的蛋白質琥珀?；?/h3>

BGC-823細胞中的琥珀?；鞍姿诫S丁酸處理時間延長而上升（圖3A）。細胞免疫熒光檢測果顯示隨著丁酸處理時間延長，BGC-823細胞中位于胞質中的琥珀?；鞍谉晒鈴姸仍黾?，并與線粒體具有共定位關系（圖3B）。同時，探針標記的維持正常膜電位的線粒體隨丁酸處理而減少。

圖3 丁酸處理后BGC-823細胞中琥珀?；揎椝阶兓?/p>

2.4 丁酸上調SUCLG1促進BGC-823蛋白琥珀?；?/h3>

胃癌細胞BGC-823中琥珀?；嚓P基因RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，丁酸處理48 h后，介導蛋白琥珀?；腟UCLG1、SUCLG2和SUCLA2的mRNA水平顯著升高（P＜0.01），其中SUCLG1呈現丁酸處理時間依賴性上調，而介導去琥珀?；腟IRT5表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 丁酸對胃癌細胞中琥珀酰輔酶A合成酶表達的影響

3 討論

丁酸屬于四碳飽和短鏈脂肪酸，主要由腸道的革蘭陽性厭氧菌通過乙酰輔酶A轉移酶途徑或磷酸轉丁?；负投∷峒っ竿緩疆a生[6]。丁酸的主要生理功能是作為腸道尤其是結腸上皮的能量來源，供細胞產能，并起到穩定腸道上皮的作用[7]。近年來研究發現丁酸作為組蛋白去乙?；敢种苿┌l揮抗腫瘤效應[17]，此外，丁酸鈉也被證實在結直腸 癌[17]、乳腺癌[18]、肝癌[19]等多種惡性腫瘤中對細胞分化、增殖、遷移侵襲有明顯的抑制作用。本研究使用丁酸鈉處理胃癌細胞，結果顯示丁酸鈉顯著抑制了BGC-823、AGS細胞的增殖及遷移能力，表明丁酸在胃癌的治療應用中具有一定前景。

代謝重編程是腫瘤發生、發展過程中的重要事件[20]，在正常細胞向腫瘤轉變的過程中，為了滿足自身代謝需求，細胞會通過各種代謝途徑調整自身生物能量合成，以滿足腫瘤增殖和生存所需。丁酸作為人體部分細胞的能量來源，與細胞能量代謝密不可分，丁酸通過促進丙酮酸激酶磷酸化和四聚體化，從而重編程結腸癌細胞代謝過程，抑制腫瘤Warburg效應[21]。為了進一步探索丁酸對胃癌細胞代謝功能的影響，我們對丁酸處理后的胃癌細胞BGC-823進行了代謝組學測序，并發現三羧酸循環和氧化磷酸化途徑在丁酸處理后顯著富集，多種代謝底物包括琥珀酰輔酶A在丁酸處理后顯著上調。以上結果表明丁酸處理可顯著激活胃癌細胞中的有氧呼吸，一定程度上發揮抑制Warburg效應的作用。

除了作為三羧酸循環的重要底物外，琥珀酰輔酶A能夠充當蛋白質琥珀?；w，通過酶學或非酶學方式將琥珀?；矁r結合到賴氨酸殘基上完成蛋白修飾[22]。琥珀?；侵匾牡鞍踪|翻譯后修飾方式，其在腫瘤發生發展中亦發揮了關鍵作 用[23]。因此，我們通過Western blot和免疫熒光染色檢測了丁酸處理后胃癌細胞BGC-823中的琥珀?；潭?，結果顯示丁酸處理能夠顯著促進細胞中的蛋白質總體琥珀?；揎椝?，由于丁酸處理 48 h顯著抑制胃癌細胞增殖，視野內細胞數量較少，因此將丁酸處理36 h作為最大處理時間進行免疫熒光的檢測。值得注意的是，目前研究表明胃癌細胞中乳酸脫氫酶的賴氨酸222（LADH-K222）位置[24]以及鈣結合蛋白S100A10的賴氨酸47（S100A10-K47）位置[25]的琥珀?；軌虼龠M胃癌細胞生長和遷移，然而，在這兩個蛋白對應的相對分子量位置（30 kDa 和10 kDa）并未觀察到丁酸處理前后琥珀?；阶兓▓D3A），因此我們推測，丁酸介導的蛋白琥珀?；峭ㄟ^其他靶蛋白發揮抑癌作用，但其具體效應蛋白及修飾位點仍需進一步研究。

SIRT5是哺乳動物中主要的去琥珀?；?，能夠逆轉蛋白質琥珀?；揎梉26]，而SUCLG1、SUCLG2和SUCLA2分別編碼琥珀酰輔酶A合成酶的不同亞基，其表達水平和蛋白琥珀?；潭瘸收嚓P[27]。為了更深入地探索丁酸促進胃癌細胞蛋白質琥珀?；臋C制，我們分別檢測了丁酸鈉處理后胃癌細胞中上述基因表達，結果顯示SUCLG1、SUCLG2以及SUCLA2表達水平在丁酸處理48 h后均顯著上調，其中SUCLG1水平呈時間依賴性上調。而SIRT5的mRNA水平在丁酸處理前后均無顯著差異，以上證據足以表明丁酸通過上調SUCLs表達以促進胃癌細胞BGC-823中的蛋白質琥珀?；?。本研究結果表明，丁酸能夠通過激活琥珀酰輔酶A合成酶編碼基因，促進琥珀酰輔酶A合成，導致蛋白質琥珀?；缴险{。

綜上所述，本研究明確了丁酸可抑制胃癌細胞增殖及遷移，并探討了其對胃癌細胞代謝途徑以及蛋白琥珀?；挠绊懲緩?，后期本課題組還將進一步深入研究丁酸促進胃癌細胞中蛋白質琥珀?；木唧w作用位點及相關機制。胃癌嚴重危害人體健康，丁酸有望成為胃癌治療的新方向。