CYB561D2基因在神經膠質瘤組織中的表達及臨床意義

黃純， 周和平， 查正江， 朱克帥， 宣蘭蘭， 劉雅玲

神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，具體的發病機制仍不清楚，預后不佳，尤其高級別惡性膠質瘤［1，2］。本課題組前期通過對TCGA、GSE及REMBRANDT 3個基因數據庫進行統計學生物信息技術分析，發現細胞色素B561家族成員D2（Cytochrome B561 family member D2，CYB561D2）基因過表達與膠質瘤生存期可能有一定關系。CYB561D2是一種重要的編碼基因，在人體染色體的3p.21.3的630kb區域，參與體內氧化還原、電子轉移、生化代謝，維持抗壞血酸的平衡［3］。本課題組前期細胞培養實驗發現，CYB561D2基因的過表達可誘導免疫抑制，促進膠質瘤細胞的增殖、遷移［4］。因此，本研究納入2018年10月―2022年12月在安慶市立醫院神經外科接受治療的78例神經膠質瘤患者資料，選取手術切除的膠質瘤組織和對應的瘤旁正常腦組織對照分析，尋找膠質瘤細胞凋亡、遷移等基因分析，從分子學角度尋找膠質瘤靶向治療新思路，對神經膠質瘤病理組織中的CYB561D2基因的表達做進一步探討和驗證。

1 資料與方法

1.1 臨床病例及組織標本取材 選取2018年10月―2022年12月安慶市立醫院醫院神經外科接受治療的78例神經膠質瘤患者資料，包括36例男性與42例女性，年齡均在28~75歲范圍內，平均年齡為（41.5±3.6）歲，所有病例術后病理證實為神經膠質瘤，患者術前均未經任何相關的腫瘤治療，并進行定期隨訪。收集神經膠質瘤組織標本78例，為實驗組。腫瘤手術路徑過程中必須切除的正常腦組織標本32例，設為對照組。所有腫瘤標本均從腫瘤非壞死區收集，快速冷凍保存于-80 ℃冰箱中。采用熒光實時定量PCR實驗（Real-time PCR）與免疫組織化學染色（S-P）研究分別檢測實驗組及對照組中CYB561D2基因的mRNA及蛋白的表達水平。本研究通過醫院醫學倫理委員會審批。

1.2 免疫組織化學染色 使用10%中性福爾馬林對組織標本進行固定，并用常規石蠟進行包埋，制備4 μm厚的切片。免疫組織化學采用S-P法檢測實驗組與對照組組織病理中CYB561D2基因的蛋白表達，用磷酸鹽緩沖液（PBS）對一抗進行替代進行陰性對照。兔抗人CYB561D2多克隆抗體與S-P免疫組化試劑盒都產自上海邁克生物科技有限公司，是美國Abcam 公司產品。將組織切片在4 ℃下與CYB561D2兔多克隆抗體培養過夜后在室溫下進行染色實驗；使用二級抗體生物素化?？故笱錓gG（常州志遠生物技術有限公司）在37 ℃下孵育30 min，再沖洗、復染、脫水、透明及封片。

1.3 免疫組化結果判定CYB561D2基因在組織中的蛋白表達由2名高年資病理醫生進行閱片和評分，取平均值。參照半定量積分法，按照陽性反應強弱與陽性細胞占比打分。其中前者按照無色、淡黃、棕黃和棕褐分別對應0~3分；著色陽性面積按無著色、著色0%~30%、30%~60%、60%~100%分別打0、l、2、3分。兩項打分之和判斷其結果：0分為（-），1~2分為（+），3~4分為（?），5~6分為（?）。

1.4 熒光實時定量PCR（real-time PCR） 將78例實驗組和32例對照組新鮮組織標本進行RNA逆轉聚合酶鏈反應實驗。運用Trizol試劑（Sigma公司，美國）從提取組織細胞里面的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA純度進行鑒定符合純度要求。使用TriZol逆轉錄試劑盒（Sigma公司，美國）建立反轉錄反應體系，逆轉錄合成cDNA。在NCBI GeneBank中查找膠質瘤相關的CYB561D2引物信息。通過Primer v7.0引物軟件完成設計工序。運用美國應用生物系統公司（ABI）的SYBR Green Master Mix展開熒光實時定量PCR實驗對CYB561D2基因的表達進行評價。

1.5 統計學分析 通過SPSS 20.0軟件完成數據的分析處理，計量數據執行正態性檢驗，符合正態性分布的數據用（）表示，計數資料采用卡方檢驗進行兩組間比較（必要時輔以精確概率Fisher法計算P值）并記錄χ2值；符合正態分布的計量資料采用t檢驗進行兩組間比較，記錄t值；P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術后常規病理結果 按照2021年第5版WHO中樞神經系統腫瘤分類臨床指南對標本病理進行分級統計，其中12例為Ⅰ級，15例為Ⅱ級，19例為Ⅲ級，32例為Ⅳ級。Ⅲ、 Ⅳ級屬于高級別膠質瘤，共有51例；Ⅰ級與Ⅱ級屬于低級別膠質瘤，共27例。

2.2 膠質瘤組織和腫瘤周圍正常腦組織中CYB561D2蛋白免疫組化的表達情況CYB561D2在各種類型膠質瘤中都有不同程度的表達，大部分定位于細胞漿內，尤以近核旁區明顯，呈棕黃色或棕褐色顆粒，少部分位于胞核內。實驗組中，高級別膠質瘤組CYB561D2蛋白呈高表達，低級別膠質瘤組中CYB561D2蛋白呈中低表達。對照組瘤旁組織中CYB561D2蛋白基本不表達。按免疫組化評分，高級別膠質瘤組中CYB561D2蛋白表達值為（4.86±0.32）；低級別膠質瘤組中CYB561D2蛋白表達值為（2.16±0.13），對照組中CYB561D2蛋白表達值為（0.53±0.12），各組間有統計學差異（P<0.05）（見表1、圖1）。

圖1 不同組織HE病理染色結果

表1 實驗組、對照組CYB561D2蛋白免疫組化表達情況

2.3 Real-time PCR 檢測膠質瘤組織（實驗組）與正常腦組織（對照組）中CYB561D2基因mRNA的轉錄情況 利用RT-PCR技術對組織標本里面CYB561D2基因轉錄mRNA相對表達量進行檢測，結果顯示各組表達水平不一致，高級別膠質瘤組里面mRNA的表達量為（0.736±0.032），低級別膠質瘤組里面mRNA的表達量為（0.428±0.045）；對照組正常腦組織中基因轉錄mRNA表達量為（0.152±0.028）。差異具有統計學意義（χ2=2.75，P<0.05）（見圖2）。

圖2 各組組織中CYB561D2基因mRNA的轉錄水平（）

3 討論

神經膠質瘤在中樞神經系統的原發性惡性腫瘤中較為多見，詳細的發病機制仍不能明確，目前以手術切除聯合放療、化療方法的臨床療效雖有一定提高，但患者預后仍然不夠理想，平均生存時間僅有12~15個月［5］，新版中樞神經系統腫瘤分級標準在組織學特征的基礎上增加分子參數，新版腫瘤分類為臨床診療設定了新標準，分子檢測不僅可以明確診斷，還可以進行分子分型、評估患者預后和預測患者腫瘤復發［6］。因此，需要從分子學角度進行深入研究，研究神經膠質瘤發病的病理生理機制，從而為膠質瘤患者治療提供新的思路及方法。

CYB561D2基因是細胞色素B在選擇性剪切后屬于其中一種亞型，在人染色體3p.21.3的630kb區域，其表達蛋白定位于線粒體外膜，是一種分子質量為28kDa的疏水蛋白由6個α跨膜螺旋和4個內螺旋構成，這種較小且普遍存在的蛋白質作為電子轉移成分廣泛地參與了許多不同組織細胞的氧化還原、生長發育及生化代謝等［3］。研究表明，CYB561D2基因在調控多種腫瘤生長分化、浸潤、侵襲等過程中扮演了較為重要的促進作用［7-9］。在黑色素瘤中，CYB561D2基因異常表達可促進癌細胞增殖、遷移與侵襲［10］。對肝細胞癌患者，CYB561D2的表達與其生存期之間存在負相關的關系，可成為判斷肝癌預后的評價指標［11］。對于乳腺癌患者，CYB561D2基因mRNA過表達與ERBB2/HER2與浸潤性CD4+T細胞存在關聯，CYB561D2過度表達患者的總生存率顯著降低，死亡風險增加［12，13］。

本課題組前期使用統計學生物信息學技術，通過對TCGA、GSE112及REMBRANDT 3個基因數據庫CYB561D2基因表達與膠質瘤生存期分析發現，基因表達量越高患者腫瘤級別越高，預后越差，整體生存期也較短，CYB561D2基因在膠質瘤發生中扮演著致癌基因的作用。Tao等研究發現，在神經膠質瘤細胞系中，CYB561D2及其功能產物抗壞血酸鹽劑量依賴性激活STAT3蛋白磷酸化，并過表達增加了PD-L1，誘導免疫抑制［14］。Ruby等對膠質母細胞瘤細胞系進行測序，發現CYB561D2多個基因融合，提示CYB561D2基因可能參與膠質瘤的發生、分化和進展［15，16］。

本文研究證實，膠質瘤細胞株敲除CYB561D2基因的表達，結果表明膠質瘤細胞的克隆和增殖均明顯減弱，這符合前期有關的研究結果［17，18］。本次實驗中，我們利用免疫組化與RT-PCR對CYB561D2基因在神經膠質瘤中的蛋白與mRNA表達水平進行檢測并分析，CYB561D2在各種類型膠質瘤中都有不同程度的表達，大部分定位于細胞漿內，尤以近核旁區明顯，呈棕黃色或棕褐色顆粒，少部分位于胞核內。實驗組中，高級別膠質瘤組CYB561D2蛋白呈高表達，低級別膠質瘤組中CYB561D2蛋白呈中低表達，對照組瘤旁組織中CYB561D2蛋白基本不表達。神經膠質瘤中CYB561D2基因在蛋白和mRNA水平都有較高程度的表達，尤其在高級別惡性腦膠質瘤中，與對照組組織中CYB561D2基因表達相比有統計學差異（P<0.05）。本研究認為CYB561D2上調與膠質瘤的分級及惡性程度有一定相關，隨著腫瘤級別的升高，CYB561D2表達的上調趨勢越明顯，進一步證實CYB561D2基因在膠質瘤形成、發展中有較大的促進作用。

同時本研究利用RT-PCR對組織里面CYB561D2基因轉錄mRNA相對表達量進行檢測，結果顯示各組表達水平不一致，高級別膠質瘤組里面mRNA的表達量明顯高于對照組，因而，在臨床診療方面，CYB561D2基因利于明確膠質瘤的診斷，進一步完成分子分型、評估患者預后和預測患者腫瘤復發［19，20］；靶向抑制CYB561D2基因的表達可能是治療膠質瘤的一種新途徑，CYB561D2基因在膠質瘤細胞生成中發揮促進作用，抑制CYB561D2基因表達從而起到抑制膠質瘤細胞增殖、遷移［21］。

神經膠質瘤的發生、發展是多基因、多種信號通路共同調控的結果。CYB561D2基因在神經膠質瘤中呈過表達，極有可能參與了膠質瘤的形成和進展，與神經膠質瘤患者預后有一定相關性。結合前期研究結果，目前可能與CYB561D2上調激活STAT3誘導膠質瘤的免疫抑制相關，其具體調控機制仍需進一步研究證實。CYB561D2基因目前在神經膠質瘤中初步證實為癌基因，可被當作神經膠質瘤的潛在靶點用于治療中，給神經膠質瘤患者的臨床治療提供新依據和思路，當然這些還需要我們后期的進一步研究。

倫理學聲明：本研究方案經由安慶市立醫院倫理委員會審批［醫學倫理（2022）第73號］，患者或授權家屬均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：黃純負責設計論文框架、起草論文、論文修改；朱克帥、劉雅玲負責數據收集、統計學分析、繪制圖表；周和平、查正江、宣蘭蘭負責擬定寫作思路、指導撰寫論文并最后定稿。