補肺活血膠囊對小鼠肺纖維化作用及機制

李鵬，劉怡，王鳳嬋，趙國靜，韓萍，周佩夏，葉海燕，王坤，胡海波，陸學超

青島大學附屬青島市海慈醫院 青島市中醫醫院，山東 青島 266033

肺纖維化是許多間質性肺部疾病的終末結局，可導致呼吸困難或呼吸衰竭，確診后平均預期壽命僅為3 年[1]。盡管當前有大量關于肺纖維化的研究，但通過化學藥治療肺纖維化的效果并不理想[2]。面對逐年上漲的肺纖維化發病率，以其關鍵發病機制為出發點，著力于研發高效治療藥物對于改善肺纖維化患者預后，提高其生活質量具有重要的意義。

補肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂組成，可益氣活血、補肺固腎，常用于臨床肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、重癥肺炎等疾病的治療。研究表明，補肺活血膠囊可以減少肺組織中炎性因子的分泌，改善肺炎性損傷及纖維化樣變的程度[3]，一定程度上能延緩肺功能下降，改善臨床癥狀[4]。然而其具體的作用機制尚不明確。本研究擬通過博來霉素建立小鼠肺纖維化模型，并用補肺活血膠囊進行治療。通過小鼠存活率、鼠肺泡灌洗液（BALF）總細胞與總蛋白、肺組織濕干質量比（W/D）與羥脯氨酸（HYP）和肺組織病理學變化研究補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠的治療作用，并基于Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）通路研究補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠上皮間質轉化（EMT）的影響，以期闡明補肺活血膠囊治療肺纖維化的機制，為補肺活血膠囊臨床應用治療肺纖維化提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

90 只SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠，體質量20～22 g，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0008。每5 只小鼠一籠，飼養于室溫（21±2）℃，相對濕度50%～60%，明暗12 h/12 h 的環境并使小鼠自由進食飲水。本研究經青島市中醫醫院倫理委員會批準，審批號2024HC01LS12。

1.2 藥品與試劑

NLRP3 抑制劑MCC950（貨號S8930，美國Selleck 公司）；博來霉素（貨號M2100，美國AbMole公司）；補肺活血膠囊（規格0.35 g/粒，批號155532，廣東雷允上藥業有限公司）；BCA 法微量蛋白檢測試劑盒（貨號W041-1-1，南京建成生物工程研究所）；牛血清白蛋白（BSA，貨號W071-1-1，南京建成生物工程研究所）；Masson 染液（貨號D026-1-3，南京建成生物工程研究所）；蘇木素–伊紅（HE）染液（貨號D006-1-4，南京建成生物工程研究所）；HYP 檢測試劑盒（堿水解法，貨號A030-2-1，南京建成生物工程研究所）；羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶（HRP，貨號KS001，南京建成生物工程研究所）；羊抗兔IgG-HRP（貨號KS002，南京建成生物工程研究所）；抗體：β-肌動蛋白（β-actin，貨號3700）、E-鈣黏蛋白（E-cad，貨號14472）、波形蛋白（Vim，貨號3932）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，貨號69319）、轉化生長因子-β（TGF-β，貨號3711）、NLRP3（貨號15101）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC，貨號67824）、cleaved-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1，貨號89332）、mature-白細胞介素（IL）-1β（貨號63124）、mature-IL-18（貨號57058），Cell Signaling Technology；試劑盒：總RNA 提取試劑盒（貨號#DP419）、cDNA 反轉錄試劑盒（貨號#KR116-02）、SYBR 擴增試劑盒（貨號#P205-02，天根生化科技（北京）有限公司）。

1.3 儀器

LP-5117 型多功能酶標儀（長春樂鏷科技有限公司）；PowerPAC Basic 電泳儀和ChemiDoc XRS凝膠成像自動分析儀（Bio-Rad 公司）；H3-18KR 型高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；MDF-C8V(N)型?80 ℃冷凍冰箱（日本SANYO 公司）；LEPGEN-96 熒光定量PCR 儀[樂普（北京）醫療器械股份有限公司]。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將C57BL/6 小鼠隨機分為對照組、模型組、NLRP3 抑制劑（MCC950）組及補肺活血膠囊低、中、高（0.32、0.63、1.26 g/kg）組，每組15 只。通過對小鼠氣管內單次注射2.5 mg/kg 博來霉素來誘導肺纖維化。對照組小鼠接受單次氣管內注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。在接受氣管注射后第1 天開始，MCC950 組每天ip 10 mg/kg MCC950，補肺活血膠囊組每天分別ig 0.32、0.63、1.26 g/kg補肺活血膠囊。補肺活血膠囊劑量根據等效劑量換算公式（等效劑量＝成人每日劑量/70×9.1）計算得出，其中中劑量為人等效劑量，低劑量為等效劑量的1/2 倍，高劑量為等效劑量的2 倍。給藥前確定小鼠體質量，以便準確計算所需藥物量。將膠囊中的細粉顆粒按照高劑量濃度溶于生理鹽水，之后使用生理鹽水分別梯度稀釋為中劑量和低劑量，按照每只小鼠接受0.2 mL 藥物溶液進行配制。對照組與模型組每天分別ig 等體積的生理鹽水，整個給藥過程持續21 d。給藥過程中，每天統計各組小鼠存活的數量。在接受氣管注射后第22 天，小鼠以頸椎脫臼法被處死，稱質量并收集樣本。

2.2 肺組織標本采集與病理學染色

小鼠處死后，切開胸腔并充分暴露頸部氣管。結扎右肺后，用4 ℃的PBS 對左肺進行3 次灌洗，每次0.5 mL，回收的液體即為BALF，灌洗后的左肺摘下在?80 ℃冰箱保存。然后將BALF 在4 ℃下以150×g離心5 min，并將灌洗液的上清液儲存在?80 ℃，用總蛋白測定試劑盒分析總蛋白含量。將BALF 樣品的細胞顆粒重新懸浮在PBS 中進行細胞計數。

BALF 收集完成后，摘取結扎的右肺放入4%多聚甲醛固定，取下葉稱取濕質量（W），然后置于60 ℃烘箱中烘干72 h 后稱取干質量（D），計算肺組織濕干質量比（W/D）。剩余右肺嵌入石蠟包埋后，制成3 μm 的切片進行染色。進行蘇木精–伊紅（HE）染色和Masson 染色，通過光學顯微鏡觀察結果以評估肺部炎癥和膠原沉積的水平。采用Szapiel 量化方法對HE 染色進行評估[5]，采用改良的Ashcroft 量化方法對Masson 染色進行評估[6]。

2.3 肺組織HYP 測定

精準稱量30 mg 肺組織，使用生化試劑盒測定肺部膠原蛋白主成分HYP 的水平。HYP 氧化后與二甲氨基苯甲醛反應顯紫紅色，用酶標儀在550 nm波長處測定。

2.4 qRT-PCR 檢測EMT 相關蛋白的mRNA 表達

使用總RNA 提取試劑盒從肺組織及細胞中獲得總RNA。再使用反轉錄試劑盒獲得cDNA。使用qPCR 法測定E-cad、Vim、α-SMA、TGF-β1mRNA表達量。引物序列見表1，使用2?ΔΔCt法基于β-actin計算目標mRNA 相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.5 Western blotting 檢測EMT 以及NLRP3 信號通路相關蛋白表達

將肺組織及細胞放入含1 mmol/L PMSF 的冰冷的RIPA 緩沖液中進行超聲均質提取總蛋白。使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白濃度。提取的蛋白質通過SDS-PAGE 分離后電轉到PVDF膜。使用5%脫脂奶粉溶液封閉膜1 h，隨后用Ecad、VIM、α-SMA、TGF-β1、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、cleaved-IL-1β、cleaved-IL-18 的抗體在4 ℃下培養過夜。用TBST 清洗3 次孵育后的膜，然后用HRP 標記的二抗在室溫下培養1 h，再次洗膜后經ECL 化學發光顯影，最后使用Image J 軟件對條帶進行量化分析。

2.6 統計學分析

采用Excel 2019 和SPSS Pro 在線數據分析平臺進行數據分析，數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。

3 結果

3.1 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠存活率的影響

給藥結束后，對照組小鼠存活率為100%，模型組小鼠存活率為47%，MCC950 和補肺活血膠囊干預可顯著增加肺纖維化小鼠存活率。MCC950 組存活率為67%，補肺活血膠囊0.32、0.63、1.26 g/kg組存活率分別為60%、67%、73%，見圖1。

圖1 肺纖維化小鼠存活率（n=15）Fig.1 Survival rate of mice with pulmonary fibrosis (n=15)

3.2 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠體質量、肺組織W/D 的影響

與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊1.26 g/kg 組體質量顯著升高（P＜0.01）；MCC950 組和補肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組肺組織W/D 顯著降低（P＜0.05、0.01），見圖2。

圖2 肺纖維化小鼠體質量和肺組織W/D（，n=15）Fig.2 Body mass and W/D of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

3.3 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠BALF 總細胞數和總蛋白的影響

與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊各劑量組BALF 總細胞數顯著降低（P＜0.05、0.01）；MCC950 組和補肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組總蛋白濃度顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 BALF 總細胞數和總蛋白濃度（，n=15）Fig.3 Total cell count and total protein concentration of BALF (,n=15)

3.4 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠肺組織病理的影響

HE 染色顯示，對照組肺組織未發現肺泡炎性滲出及纖維化病變，肺泡結構清晰；模型組肺部結構發生了扭曲，肺間質細胞數量增加，纖維組織增生、纖維化，肺泡腔增大、融合；MCC950、補肺活血膠囊干預后，肺纖維化小鼠肺組織病理化程度減輕，肺組織結構完整度提升，肺泡間隔厚度減少，炎性細胞浸潤減少。與模型組比較，MCC950 組和補肺活血膠囊各劑量組Szapiel 評分顯著降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 肺纖維化小鼠肺組織HE 染色及Szapiel 量化評分（，n=15）Fig.4 HE staining and Szapiel quantitative score of lung tissue of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

Masson 染色顯示，對照組小鼠肺組織結構形態正常；模型組肺間質中存在明顯的藍色膠原蛋白沉積，呈大片束狀及片狀分布，肺組織纖維化程度嚴重；MCC950、補肺活血膠囊干預后肺纖維化小鼠肺組織中藍色膠原蛋白沉積減少，肺纖維化程度明顯減輕。與模型組比較，MCC950 組和補肺活血膠囊各劑量組Ashcroft 評分顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 肺纖維化小鼠肺組織Masson 染色及Ashcroft 量化評分（，n=15）Fig.5 Masson staining and Ashcroft quantitative score of lung tissue of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

3.5 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠HYP 的影響

與模型組比較，MCC950 組和補肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組HYP 含量顯著降低（P＜0.05、0.01），見圖6。

圖6 肺纖維化小鼠HYP 含量（，n=15）Fig.6 HYP content in mice with pulmonary fibrosis(,n=15)

3.6 補肺活血膠囊對EMT 相關蛋白mRNA 和蛋白表達的影響

qRT-PCR 結果顯示，與模型組相比，MCC950組、補肺活血膠囊各劑量組中的Vim、α-SMA、TGFβ1 mRNA 表達明顯降低，E-cad mRNA 表達明顯升高（P＜0.05、0.01），見圖7。

圖7 補肺活血膠囊對EMT 相關mRNA 的影響（，n=15）Fig.7 Effect of Bufei Huoxue Capsules on EMT-related mRNA (,n=15)

Western blotting 結果顯示，與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊各劑量組的Vim、α-SMA、TGF-β1 蛋白表達明顯降低，E-cad 表達水平明顯升高（P＜0.05、0.01），見圖8。

圖8 補肺活血膠囊對EMT 相關表達蛋白的影響（，n=15）Fig.8 Effect of Bufei Huoxue Capsules on EMT-related expression proteins (,n=15)

3.7 補肺活血膠囊對NLRP3 信號通路表達蛋白的影響

與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊各劑量組的NLRP3、ASC、mature-Caspase-1、mature-IL-1β、mature-IL-18 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05、0.01），見圖9。

圖9 補肺活血膠囊對NLRP3 信號通路表達蛋白的影響（，n=15）Fig.9 Effect of Bufei Huoxue capsule on NLRP3 signaling pathway (,n=15)

4 討論

博來霉素作為一種化學治療性抗生素，被廣泛應用于肺纖維化動物模型的制作[11]。本研究通過博來霉素建立肺纖維化模型小鼠。MCC950 與補肺活血膠囊給藥治療后，肺纖維化小鼠生存率明顯提高，體質量明顯增加，肺組織W/D、BALF 總細胞與總蛋白、羥脯氨酸含量均明顯降低，肺纖維化進程明顯改善，補肺活血膠囊治療效果明顯。

后續本研究探討了補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠EMT 的影響，結果顯示，補肺活血膠囊干預后可提高肺纖維化小鼠肺組織E-cad 表達，降低VIM、α-SMA、TGF-β1 表達。過度的EMT 在肺纖維化發展中起到了關鍵性的作用。EMT 是上皮細胞表型的轉變，這個過程中上皮細胞失去其部分特征和標記從而獲得間質細胞的標記，在各種損傷刺激下分化的上皮細胞經過表型轉化可形成大量的成纖維細胞以及肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞則可以通過細胞外基質（ECM）的過度積累促進肺纖維化的發展[12]。在EMT 過程中，上皮細胞基因表達受到抑制導致上皮細胞標記物如E-cad 蛋白表達減少，間質細胞基因表達激活導致間質細胞標記物如Vim、α-SMA、蛋白表達增加[13]，因此可以通過檢測相關蛋白以及mRNA 的變化來表征EMT 的發生發展。TGF-β1 是ECM 過度積累、成纖維細胞增殖和分化為肌成纖維細胞的主要誘導劑，即肺纖維化中誘導EMT 發生的關鍵因子，抑制TGF-β1 的表達可改善EMT 的發展[14-15]。

近年來有許多研究證實EMT 的促進可能與激活NLRP3 炎癥小體信號通路有關，這種變化會加劇腫瘤細胞的侵襲與遷移，而其在肺纖維化發生發展過程中所起的作用鮮有研究[16-18]。NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、ASC、Caspase-1 組成的多蛋白復合物，當NLRP3 被激活時會促進NLRP3 炎癥小體各組分（NLRP3、ASC、Caspase-1）的組裝，進而激活 pro-Caspase-1 形成具有活性的 cleaved-Caspase-1，對炎癥因子IL-1β 和IL-18 進行切割并使其成熟，mature-IL-1β 可以刺激TGF-β1 合成，而TGF-β1 是EMT 發生發展的關鍵性因子，TGF-β1 合成增加將加劇肺泡EMT 進程，從而加速肺纖維化形成，抑制NLRP3 可以明顯緩解肺纖維化[19-21]。本研究結果顯示，與模型組相比，補肺活血膠囊可以下調NLRP3 相關蛋白的表達，下調肺纖維化小鼠體內炎癥反應，表明NLRP3 途徑可能是補肺活血膠囊抗肺纖維化的重要調節通路。MCC950 是一種有效的特異性NLRP3 炎癥小體小分子抑制劑，抑制原理與其直接結合NLRP3 中NACHT 結構域的Walker B 基序繼而阻斷ATP 水解有關，此外其對NLRP1、NLRC4、AIM2 等炎癥小體的激活沒有影響[22-23]。因此本研究選取MCC950 作為陽性對照藥物對比補肺活血膠囊對NLRP3 的抑制作用，結果顯示MCC950 可抑制NLRP3 通路活化及EMT 發生，同時對肺纖維化小鼠具有治療作用，而補肺活血膠囊與MCC950 干預對肺纖維化小鼠EMT 及治療作用的影響無明顯差異。

綜上所述，通過補肺活血膠囊治療后，肺纖維化小鼠生存率明顯提高，體質量明顯增加，肺組織W/D、BALF 總細胞與總蛋白、HYP 含量均明顯降低，肺纖維化進程明顯改善。因此可以證實補肺活血膠囊可以通過調控NLRP3 通路介導的EMT 抑制減輕博來霉素誘導的肺纖維化程度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突