生物信息學和實驗驗證探究千層紙素A 抗宮頸癌的效應及其作用機制

王玨

宿遷市第一人民醫院 藥學部，江蘇 宿遷 223800

宮頸癌是一種始發于宮頸細胞的癌癥，但其通常會隨著時間的推移而緩慢發展[1]。發育異常的子宮頸細胞首先出現在子宮頸組織中，隨著時間的推移，如果不進行干預或清除，異常細胞可能會變成癌細胞，并開始生長和擴散到更深的子宮頸和周圍組織[2]。在目前的研究表明，宮頸癌多由高風險類型的人類乳頭瘤病毒（HPV）誘發，其中HPV16、HPV18 占到了70%[3]。定期接受宮頸癌篩查和接種HPV 疫苗被認為是預防宮頸癌發生的有效手段[4]，但目前這2 種手段在我國的普及率較低[5]。目前治療宮頸癌的常規手段為手術治療、化療、放射療法及靶向治療[6-7]。千層紙素A 是一種從黃芩根皮中所提取的活性成分，多項研究表明千層紙素A 具有抗腫瘤、抗炎、神經調節等多種藥理作用[8-10]。

SHC SH2 結構域結合蛋白1（SHCBP1）是細胞表面受體的重要蛋白[11]，它將激活的生長因子受體偶聯到表皮生長因子受體（EGFR）、成纖維細胞生長因子受體（FGFR）和胰島素受體等相關信號通路[12]。SHCBP1 在多種癌癥中如肝癌、乳腺癌、膠質瘤中過表達，目前有研究表明SHCBP1 的表達還與腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和免疫抑制基因（TGFBR1、PD-L1、TGFB1 等）呈正相關[13-15]，表明SHCBP1 與腫瘤免疫有著密切的關系。

目前對于千層紙素A 抗腫瘤作用研究得到了重點關注，但其作用的機制仍有待研究。本研究通過MTT 比色法證實了千層紙素A 可以抑制宮頸癌細胞的增殖，并基于前期研究的基礎，通過Western blotting 實驗分析千層紙素A 與SHCBP1 之間的關系。此外，對千層紙素A 與SHCBP1 進行計算機模擬分子對接，分析結合效能。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

HeLa 細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司；千層紙素A（質量分數≥98%，貨號480-11-5）購自成都普思生物科技股份有限公司；SHCBP1 抗體（貨號12672-1-AP）購自美國Proteintech 公司；DMSO（貨號ST038）、MTT 毒性檢測試劑盒（貨號C00098）、PBS（貨號C0221A）購自上海碧云天生物技術股份有限公司；DMEM 培養基（貨號6122692）購自美國Gibco 公司；胎牛血清（貨號11011-8611）購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

超精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、多功能微孔板檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）、雙紅外激光色成像儀（美國LI-COR 公司）；電泳儀（美國BIO-BAD 公司）。

1.2 數據集的研究

通過GEO 和TCGA 數據庫檢索人宮頸癌相關數據集，最終選定GSE9750、GSE63678、GSE29570和人宮頸癌TCGA 數據（TCGA-CESC）作為研究數據集，其中對GSE63678 中非宮頸癌樣本進行刪除。通過R 語言分別對GSE9750、GSE63678、GSE29570 進行整理獲得基因表達矩陣，運用生物醫學數據分析盒子（Sangerbox）[16]中COMBAT 法對3 個數據集進行去批次效應處理，獲得可進行比較的3 個數據集基因表達矩陣集合，之后在基因表達矩陣中分析SHCBP1的表達量。同時，通過GEPIA 2 平臺（http://gepia2.cancer-pku.cn）[17]對TCGA 數據庫中TCGA-CESC 進行研究，分析SHCBP1 在TCGA 數據庫中的表達；使用R 語言中IOBR 包在3 個GEO 數據集中，對22 種免疫細胞進行Cibersort法分析。采用TISIDB 數據庫（http://cis.hku.hk/TISIDB）[18]分析SHCBP1 與免疫檢查點的聯系。

1.3 分子對接

分別在AlphaFoldDB 和TCMSP 數據庫中檢索SHCBP1 和千層紙素A 的PDB 格式與MOL2 格式文件，Pymol 對小分子與蛋白進行脫水等處理，后導入Autodock 軟件中進行分子模擬對接，將勢能最低的一個結果使用Pymol 進行可視化輸出。

1.4 MTT 實驗

1.4.1 含藥培養基配制 用精密天平精準稱定2 mg千層紙素A，根據相對分子質量加入相應體積的DMSO 溶液配制成60 mmol/L 儲備液，通過稀釋法配制濃度為10、20、30 mmol/L 的含藥母液。

1.4.2 培養細胞 HeLa 細胞在含有5%胎牛血清的DMEM 培養基中培養，經傳代后，以每孔1×104個接種入96 孔板中，每組副孔6 個，培養至70%～80%的密度。

1.4.3 加藥 取3 個5 mL 離心管，分別加入2 mL培養基，取2 μL 濃度為10、20、30 mmol/L 的含藥母液分別加入含培養基的離心管內，即為10、20、30 μmol/L 含藥培養基，另取一對照管加入相應體積的DMSO。吸干原96 孔板中培養基，加入200 μL含藥培養基，繼續培養24 h。

1.4.4 收樣 加入10 mL MTT 溶液（5 mg/mL）培養4 h，棄掉原培養基加入200 μL DMSO 溶液，充分溶解甲臜40 min 后490 nm 處測吸光度（A）值。

1.5 蛋白免疫印記實驗

HeLa 細胞在10、20、30 mmol/L 含藥培養基下培養24 h，對照組培養基加入相應體積DMSO 同步培養，用含有1%的蛋白酶抑制劑（PMSF）的NP40裂解緩沖液提取HeLa 細胞的蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度。以30 μg 的蛋白量加入10%的膠中，100 V 條件下分離，在240 mA 下轉印90 min，經封閉、洗膜、敷抗體等步驟后顯影。

1.6 共表達網絡分析

通過Linkedomics[19]（http://www.linkedomics.org）獲取SHCBP1 共表達基因網絡，并以熱圖的形式進行可視化。并通過基因本體（GO）和京都基因組百科全書（KEGG）進一步分析SHCBP1 的生物學功能。

1.7 數據分析

數據采用R4.3.1 和GraphPad Prism 8 進行分析。使用Wilcoxon 秩和檢驗分析SHCBP1 的表達情況；使用斯皮爾曼的相關性分析來評估相關性。

2 結果

2.1 SHCBP1 在宮頸癌中的表達情況

由于GEO 數據庫中的數據通常來自不同的實驗室、不同的實驗平臺和不同的時間點，因此存在很大的差異性。為了消除這些非生物學的技術性差異，需要對數據進行標準化處理，同時對于不同批次的GEO 數據還要進行去批次效應處理，使得各組數據具有可比性。首先對GSE9750、GSE63678、GSE29570 數據庫進行標準化和COMBAT 去批次，處理后的數據集中138 組數據（宮頸癌患者92 組，健康人46 組）幾乎在同一水平線上，均一性好，該組數據集的芯片數據可靠，可進行后續分析。經過線性模型擬合、貝葉斯檢驗，獲得差異表達基因（DEGs），使用ggplot2 和cowplot 包繪制火山圖（圖1-A）。使用ggpubr 對SHCBP1 在GSE9750、GSE63678、GSE29570 合集中的表達進行可視化（圖1-B），結果顯示，相較于健康受試者，宮頸癌患者的SHCBP1 顯著上升（P＜0.001）；同時對TCGA數據庫中307 例樣本（宮頸癌患者304 組，健康受試者3 組）的分析中，也顯示出相同的結果（P＜0.001）。

圖1 宮頸癌中SHCBP1 的表達情況Fig.1 Expression of SHCBP1 in cervical cancer

2.2 千層紙素A 對HeLa 細胞增殖和SHCBP1 蛋白表達的影響

結果顯示，與對照組相比，千層紙素A 在10 μmol/L 時即可對HeLa 細胞顯示出抑制作用；且各濃度千層紙素A 均可抑制SHCBP1 蛋白的表達（P＜0.05、0.001），見圖2、3。

圖2 千層紙素A 對HeLa 細胞增殖的影響（，n=6）Fig.2 Effect of oroxylin A on proliferation of HeLa cells(,n=6)

圖3 千層紙素A 對SHCBP1 蛋白表達的影響（，n=3）Fig.3 Effect of oroxylin A on the expression of SHCBP1 protein (,n=3)

2.3 千層紙素A 與SHCBP1 結合能分析

千層紙素A 與SHCBP1 的VAL-109、THR-191、VAL-187、GLN-190 存在氫鍵作用（圖4），其結合自由能為?7.3 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），該結果顯示千層紙素A 與SHCBP1 蛋白可以在自然情況下進行結合，且對接結果良好。分子對接結果顯示，千層紙素A 與SHCBP1 有較穩定的相互作用，進一步說明SHCBP1 蛋白可能為千層紙素A 抗宮頸癌的潛在重要作用靶點。

圖4 千層紙素A 與SHCBP1 分子對接Fig.4 Molecular docking of oroxylin A with SHCBP1

2.4 SHCBP1 在CESC 中的生物學功能

為了進一步評估SHCBP1 在CESC 中的生物學功能，本研究通過Linkedomics 分析了SHCBP1 在CESC 中的共表達網絡，共得到與SHCBP1 正相關基因453 個，SHCBP1 負相關基因387 個。將前50個的正相關和負相關的基因以熱圖形式進行展示（圖5）。隨后對SHCBP1 共表達網絡進行GO 與KEGG 分析（圖6），其中分子功能（MF）涉及激酶活性（kinase activity）、激酶結合（kinase binding）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）等；生物功能（BP）涉及細胞因子刺激的反應（cellular response to cytokine stimulus）、蛋白磷酸化反應（protein phosphorylation）、磷酸化的正向調節（positive regulation of phosphorylation）等；細胞組成（CC）涉及囊泡腔（vesicle lumen）、受體復合物（receptor complex）、細胞外基質（extracellular matrix）等。KEGG 結果顯示，SHCBP1 及共表達基因富集在TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）等。

圖5 SHCBP1 在CESC 中排名前50 個的正相關（A）和負相關（B）基因熱圖Fig.5 Heat map of the top 50 positively (A) and negative (B) correlated genes ranked by SHCBP1 in CESC

圖6 SHCBP1 在CESC 中的GO（A）和KEGG（B）富集分析Fig.6 GO (A) and KEGG (B) analysis of SHCBP1 in CESC

2.5 SHCBP1 在CESC 免疫浸潤和免疫檢查點中的作用

腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）可通過直接或間接作用參與腫瘤組織的發生、發展，是影響CESC 在內的各種癌癥發展的獨立因素。本研究通過CIBERSORT 算法計算了GSE9750、GSE63678、GSE29570 中22 種免疫細胞的比例（圖7-A），發現活化的樹突狀細胞、靜息的樹突狀細胞、M0 型巨噬細胞、M1 型巨噬細胞、靜息肥大細胞、單核細胞、中性粒細胞、NK 細胞、CD4+T 細胞、濾泡輔助性T 細胞的水平在CESC 中改變（圖7-B），表明免疫細胞在宮頸癌的發生中起到重要作用。此外，將數據集集合分為SHCBP1 高、低表達組，在SHCBP1 高表達組中活化的樹突狀細胞、M0 型巨噬細胞、M1 型巨噬細胞、漿細胞、活化的CD4+T記憶細胞、濾泡輔助性T 細胞比例上調，調節性T細胞、肥大細胞、單核細胞、靜息CD4+T 記憶細胞比例下調（圖7-C）。通過TISID 數據庫對SHCBP1與CESC 免疫檢查點相關性分析得出，SHCBP1 與RAET1E、TGFB1、TGFBR1 表現出正相關，與TNFRSF14、LGALS9、VTCN1、CXCR4、HHLA2表現出負相關。這些結果表明，SHCBP1 可能參與了CESC 免疫的調控，見圖8。

圖7 GEO 數據集中免疫細胞比例（A）、免疫細胞浸潤情況（B）和免疫細胞表達差異（C）Fig.7 Proportion of immune cells (A),infiltration of immune cells (B),and differences in immune cell expression (C) in GEO data sets

圖8 SHCBP1 與CESC 中的免疫檢查點之間的關系Fig.8 Relationship between SHCBP1 and immune checkpoints in CESC

3 討論

從中藥中分離和鑒定具有抗癌活性的化合物，成為宮頸癌的治療的一種新的研究思路[20-21]。千層紙素A 作為一種從黃芩中提取到的活性化合物，在皮膚癌、乳腺癌、肺癌、肝癌中有顯著抑制作用[8]，但在宮頸癌中的研究缺失。本研究表明，千層紙素A 可以濃度相關性地抑制Hela 細胞的增殖。此外基于前期的研究基礎，本研究對千層紙素A 是否調控SHCBP1 開展了進一步的研究。通過對GEO 及TCGA 數據集的研究，發現SHCBP1 在宮頸癌中是顯著高表達的，之后為了驗證實千層紙素A 是否能夠抑制SHCBP1 這一猜想，進行了Western blotting實驗，結果也顯示，10 μmol/L 千層紙素A 即顯示出對SHCBP1 的抑制作用。此外，為了更好的評估千層紙素A 與靶點SHCBP1 之間的結合效能，分子對接結果表明千層紙素A 與SHCBP1 在多個位點形成氫鍵，結合能為?7.3 kcal/mol，表明SHCBP1 可能是千層紙素A 的重要的潛在作用靶點。為深入探究SHCBP1 作為治療靶點的作用機制，首先對其在宮頸癌中的生物學功能開展分析，通過對SHCBP1共表達網絡的分析獲知SHCBP1及其共表達基因參與了TNF、HIF-1、IL-17 等多個信號通路，而TNF、HIF-1 和IL-17 信號通路均參與宮頸癌炎癥的發生，表明SHCBP1 可能參與調節宮頸癌的炎癥反應。在多個研究中，千層紙素A 在腫瘤中表現出良好的抗炎作用[14]，因此推斷其抗炎機制可能與抑制SHCBP1 有關。

美國食品藥品管理局批準帕博利珠單抗聯合伴或不伴貝伐珠單抗的化療用于一線治療證實為腫瘤表達PD-L1 的持續性、復發性或轉移性宮頸癌患者[22]。這是首個被批準用于這些患者一線治療的抗PD-1 組合療法，展示了免疫檢查點抑制劑在治療CESC 中的重要作用。本研究中，SHCBP1 與RAET1E、TGFB1、TNFRSF14、CXCR4 等多個免疫檢查點相關，這些免疫檢查點蛋白參與了人體先天和適應性免疫反應，在機體中發揮著重要的免疫調節作用[23-25]。免疫細胞浸潤與腫瘤炎癥反應息息相關，通過對22 種免疫細胞的分析，也獲悉多種免疫細胞與SHCBP1 的表達相關，其中與SHCBP1 顯著正相關的巨噬細胞，主要分為M0 型、M1 型和M2 型，在宮頸癌中分泌各種促炎因子，參與了腫瘤發生、發展。以上均表明SHCBP1 可能在CESC免疫中發揮著關鍵的作用，值得進一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突