雷公藤甲素對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞線粒體自噬、NLRP3 炎癥小體活化和細胞焦亡的影響

康艷慧，穆萍萍，張海雷

1.北京大學第一醫院太原醫院 太原市中心醫院 風濕免疫科，山西 太原 030001

2.北京大學第一醫院太原醫院 太原市中心醫院 病理科，山西 太原 030001

3.太原市第四人民醫院 內科，山西 太原 030053

類風濕關節炎是一種慢性進行性的自身免疫性關節疾病，具有高發病率和高致殘率的特征。類風濕關節炎患者主要病因是成纖維樣滑膜（FLSs）細胞異常增殖和炎癥因子大量釋放，進而破壞患者關節局部結構，最終導致關節畸形和功能障礙[1]。雷公藤是一種臨床上用于治療風濕性關節炎的傳統中草藥，而雷公藤甲素是從雷公藤中分離鑒定出的一種主要活性成分，目前已有的研究表明，雷公藤具抗類風濕、抗炎癥等作用，降低炎癥因子白細胞介素（IL）-18 和IL-1β 水平[2-3]。因此，雷公藤甲素治療類風濕關節炎具有一定療效，但其具體的作用機制尚不明確。近期，有研究表明雷公藤能夠通過抑制LC3B 蛋白表達，增強p62 表達抑制線粒體自噬，同時還減少NLRP3 表達進而緩解結腸炎引發的炎癥損傷[4]。NLRP3 的表達和細胞焦亡息息相關，并且在類風濕關節炎滑膜組織中檢測到細胞焦亡相關蛋白GSDMD-N 表達顯著上調[5]?；诖?，本研究通過比較不同質量濃度的雷公藤甲素對類風濕關節炎FLSs 細胞線粒體自噬、NLRP3 炎癥小體的活化和細胞焦亡的影響，探討雷公藤甲素治療類風濕性關節炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

FLSs 細胞（貨號ZY-R025）和類風濕關節炎FLSs 細胞（貨號HZ-H197）購自上海滬震生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

雷公藤甲素（質量分數≥98%，貨號38748-32-2）購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO，貨號01934-1L）購自Sigma-Aldrich 公司；青霉素–鏈霉素溶液（貨號SV30010）、DMEM（貨號SH30022.01B）培養基購自Hyclone；細胞焦亡檢測試劑盒（貨號為ab39412）購自Abcam 公司；IL-1β、IL-18 ELISA 檢測試劑盒（貨號JC-E1109、JCA04206）購自上海機純實業有限公司。本研究所用抗體微管相關蛋白 1 輕鏈 3B（LC3B，貨號ab192890）、聚集素-1（p62，貨號ab109012）、抑制素2（PHB2，貨號ab182139）、NOD 樣受體蛋白3（NLRP3，貨號 ab263199）、噬菌體溶解素 D（GSDMD，貨號ab219800）、噬菌體溶解素D N-末端片段（GSDMD-N，貨號ab215203）、糖酵解酶（GAPDH，貨號ab8245）、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor?488；貨號ab150077）和Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488；貨號150113）均購自英國Abcam 公司。超敏ECL 化學發光試劑盒（貨號P0018M）購自北京碧云天生物技術有限公司。

3111 型CO2細胞培養箱購自美國熱電公司，HT 型酶標儀購自美國Bio-Tek 公司，CytoFLEX 型流式細胞儀購自美國Beckman 公司，24KS 型電泳儀購自北京六一公司，TE22 型轉膜儀購自美國Hoefer 公司。

1.3 細胞培養

將FLSs 細胞和類風濕關節炎FLSs 細胞置于含有10% FBS、100 μg/mL 青霉素–鏈霉素的DMEM液體培養基中培養，并確保培養溫度為37 ℃、50%CO2。將培養3～8 代后的細胞用于后續實驗。

1.4 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測細胞線粒體自噬、NLRP3 炎癥小體激活和細胞焦亡相關蛋白的表達

類風濕關節炎FLSs 細胞采用0、10、20、40 ng/mL 雷公藤甲素處理48 h，FLSs 細胞添加等量的二甲基亞砜后常規培養48 h。細胞通過胰蛋白酶消化后，用磷酸緩沖液沖洗3 次后重懸細胞，用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，使用SDS-PAGE上樣，電泳并轉膜后，將蛋白膜放置到預先準備好的洗滌液中，封閉，之后加入以下抗體進行孵育：LC3B（1∶1 000；Abcam）、p62（1∶1 000；Abcam）、PHB2（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、GSDMD-N（1∶1 000）或GAPDH（1∶1 000），洗滌后，加入以1∶20 000稀釋的以辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG H&L 或羊抗鼠IgG H&L 二抗，室溫孵育1 h后，用ECL 發光試劑進行蛋白檢測。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測NLRP3 炎癥小體相關通路、IL-1β 和IL-18 的水平

取雷公藤甲素（0、10、20、40 ng/mL）或二甲基亞砜處理后的類風濕關節炎FLSs 和FLSs 細胞的上清，按照ELISA 試劑盒說明書測定各組中IL-1β和IL-18 水平。

1.6 流式細胞術檢測細胞焦亡

類風濕關節炎FLSs 細胞采用不同濃度的雷公藤甲素（溶解于二甲基亞砜，使終濃度分別達到0、10、20、40 ng/mL[6]）處理48 h，FLSs 細胞添加等量的二甲基亞砜后常規培養48 h。根據細胞焦亡檢測試劑盒說明指導，用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1）檢測試劑盒和碘化丙啶（PI）檢測試劑盒標記各組細胞（6×104個/孔）并采用流式細胞儀檢測分析，統計Caspase-1＋PI＋細胞個數占總細胞個數的百分比即記為細胞焦亡水平[7]。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 雷公藤甲素對線粒體自噬線粒體的影響

與FLSs 組相比，類風濕關節炎FLSs 組細胞的線粒體自噬相關蛋白LC3B 表達升高，p62 和PHB2的表達顯著降低（P＜0.001）。采用10、20、40 ng/mL雷公藤甲素處理類風濕關節炎FLSs 后，發現雷公藤甲素各劑量組均能顯著下調類風濕關節炎FLSs細胞的線粒體自噬相關蛋白LC3B 的表達，上調p62和PHB2 的表達（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性，見圖1。

圖1 雷公藤甲素對線粒體自噬線粒體的影響（，n=3）Fig.1 Effect of triptolide on mitochondria autophagy (,n=3)

2.2 雷公藤甲素對NLRP3 炎癥小體激活情況的影響

與FLSs 組相比，類風濕關節炎FLSs 組NLRP3表達水平顯著升高（P＜0.001）。與類風濕關節炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組NLRP3 表達水平均顯著降低（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關性，見圖2。

圖2 雷公藤甲素對類風濕關節炎FLSs 細胞NLRP3 炎癥小體激活的影響（，n=3）Fig.2 Effect of triptolide on activation of NLRP3 inflammasome in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.3 雷公藤甲素對炎癥因子IL-1β 和IL-18 水平的影響

與FLSs 組相比，類風濕關節炎FLSs 組炎癥因子IL-1β 和IL-18 水平顯著升高（P＜0.001）。與類風濕關節炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組的IL-1β 和IL-18 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性，見圖3。

圖3 雷公藤甲素對類風濕關節炎FLSs 細胞IL-1β 和IL-18 水平的影響（，n=3）Fig.3 Effect of triptolide on IL-1β and IL-18 levels in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.4 雷公藤甲素對細胞焦亡水平的影響

與FLSs 組相比，類風濕關節炎FLSs 組細胞焦亡率顯著升高（P＜0.01）。與類風濕關節炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組細胞焦亡率顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性，見圖4。

圖4 雷公藤甲素對細胞焦亡水平的影響（，n=3）Fig.4 Effect of triptolide on pyroptosis in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.5 雷公藤甲素對細胞焦亡相關蛋白表達的影響

與FLSs 組相比，類風濕關節炎FLSs 組細胞GSDMD 蛋白表達顯著降低，GSDMD-N 蛋白的表達顯著升高（P＜0.001）。與類風濕關節炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組細胞GSDMD 蛋白表達顯著上升，GSDMD-N 蛋白表達下降（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性，見圖5。

圖5 雷公藤甲素對細胞焦亡相關蛋白表達的影響（，n=3）Fig.5 Effect of triptolide on pyroptosis-related proteins expression (,n=3)

3 討論

雷公藤性寒，具有祛風濕、消腫解毒、通經活絡的功效[8]。其中，雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分之一，是一種治療類風濕關節炎的潛在藥物。正常FLSs 是一種能夠分泌滑液使關節潤滑，防止關節黏連的一類細胞。但是，類風濕關節炎患者FLSs 不僅異常增殖和侵襲，而且能釋放大量致炎因子介導關節破壞，最終對患者造成不可逆的關節損傷[9]。線粒體自噬是一種修復細胞損傷，維持細胞穩態的一種方式，它主要的作用機制是通過調節線粒體的融合和分裂，清除發生損傷或多余的線粒體，促進細胞內線粒體的更新，維持細胞內線粒體的動態平衡[10]。近期研究發現，外濕可以加劇類風濕關節炎大鼠的線粒體自噬和損傷線粒體的堆積[11]。本研究發現，類風濕關節炎FLSs 與FLSs 相比，線粒體自噬相關蛋白LC3B 表達升高、p62 和PHB2 的表達顯著降低，表明線粒體自噬水平增強。究其原因，可能是由于類風濕關節炎FLSs 細胞為了維護細胞穩態則增強線粒體自噬水平，代償細胞損傷機制。在線粒體自噬中，p62 和LC3B 蛋白分別發揮著標記并聚集受損蛋白和線粒體的作用，并能參與和促進自噬小體的形成。而PHB2 是分布于線粒體內膜上的蛋白，其獨有的LC3 結構域能夠幫助受損的線粒體被自噬小體錨定并降解[12]。本研究發現，雷公藤甲素能夠抑制LC3B 蛋白表達上調，同時增強p62 和PHB2 表達，表明雷公藤甲素能夠減弱線粒體自噬水平，類風濕關節炎引發的線粒體自噬水平失衡得到緩解。

研究指出，線粒體是NLRP3 功能的中心調控因子，線粒體DNA 的釋放可以促進NLRP3 炎癥小體的組裝和激活[13]。當NLRP3 炎癥小體活化后，通過轉錄因子核因子-κB（NF-κB）輕鏈增強子激活的B 細胞觸發pro IL-1β 和pro IL-18 的表達，最終誘導促炎因子IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌[14]。本研究發現，類風濕關節炎在促進FLSs 線粒體自噬的同時，還能增強NLRP3 的表達，表明類風濕性關節炎可能通過促進線粒體自噬促進NLRP3 炎癥小體的活化。此外，進一步研究發現，類風濕性關節炎還能促進IL-1β 和IL-18 炎癥因子的表達，激活炎癥反應。雷公藤甲素是一種抗炎中藥，在給予不同劑量的雷公藤甲素處理后，類風濕關節炎FLSs 細胞的NLRP3 炎癥小體的活化作用被有效地抑制，部分恢復到正常FLSs 細胞的水平，表明雷公藤甲素能夠作為類風濕關節炎的潛在藥物可能是通過抑制線粒體自噬，進而抑制NLRP3 炎癥小體的活化作用，最終抑制促炎癥因子高表達引發的炎癥反應。臨床上，類風濕關節炎患者檢出滑膜組織的NLRP3 炎癥小體被顯著激活，并發現IL-1β 和IL-18 的高表達，這與本研究結果一致[15-16]。

細胞焦亡是一種特殊的細胞死亡方式，其特征為細胞核溶解、細胞膜溶脹以及細胞質和其內容物外泄。細胞焦亡的最經典途徑是依賴于Caspase-1 介導的，而GSDMD 是最主要的效應分子。Caspase-1可以通過裂解GSDMD，產生GSDMD-N 作為活性結構，在細胞膜上聚合形成孔道，增強細胞膜的通透性和細胞溶脹，最終導致細胞發生焦亡。此外，GSDMD-N 形成的孔道也是釋放炎癥因子的重要途徑之一[17]。本研究發現，類風濕關節炎FLSs 細胞中GSDMD 表達降低，而GSDMD-N 表達顯著升高，表明類風濕關節炎能夠促進細胞焦亡。最新研究發現，新風膠囊能抑制FLSs 細胞焦亡，同時下調炎癥細胞因子分泌，減輕關節局部炎癥反應[18]。同樣本研究也發現，雷公藤甲素能夠有效地抑制細胞焦亡，同時觀察到焦亡相關蛋白GSDMD 表達升高，GSDMD-N 降低，表明雷公藤甲素通過抑制GSDMD 的裂解抑制細胞焦亡。

綜上所述，雷公藤甲素能通過抑制線粒體自噬、NLRP3 炎癥小體激活和細胞焦亡，抑制細胞炎癥反應。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突