氨對蚤狀溞誘導型反捕食生活史防御的抑制效應

劉 琪,孫運菲,谷 磊,楊 州

(南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京 210023)

枝角類是水生生態系統的重要組成部分,它們不僅是影響藻類群落組成和豐富度的主要牧食者,也是魚類和其他無脊椎動物捕食者的重要食物資源[1]。枝角類通?？梢愿兄妒痴哚尫诺男畔⑺?并表現出多樣的誘導型反捕食防御特征,例如改變行為(包括垂直遷移、趨光性和逃逸行為等[2-3])、變化形態(包括產生頸齒、角突、頭冠、增長尾刺等[4-6])、調整生活史策略(包括成熟體長減小、繁殖提前、后代數目增加等[7-8])。這些防御性狀可以有效降低枝角類被捕食的風險,使種群得以延續。然而,在復雜且多樣的水體環境中,枝角類誘導型防御的表達通常會受到包括污染物在內的多種環境因素的干擾[9-11]。例如,當水體中的鈣離子濃度降低時,枝角類的生活史防御受損,但與生殖性能有關的防御特征增強[12];水溫升高加速了枝角類誘導型形態防御的形成,但降低了形態防御性狀的表達強度[13];接觸低濃度的銅擾亂了枝角類的嗅覺系統,從而影響其誘導型防御的形成[14]。因此,了解枝角類在環境污染下對捕食風險的響應,有助于合理評估多樣化的環境脅迫對種間關系(如捕食者-獵物)的影響以及實際效應。

氮污染是水生生態系統中的潛在環境問題。它不僅可以通過城市廢水排放和動物排泄含氮廢物等方式直接進入水生生態系統,也可以通過污染沉積物中含氮有機物的分解而間接進入[15-17]。氨氮是水體中氮污染的主要存在形式,包括非離子氨(NH3)和離子銨(NH4+),其中NH3不帶電荷,具有較高的脂溶性,能夠穿透細胞膜,可對水生生物產生嚴重毒害作用[18-19]。根據相關報道,為了避免對魚類等水生生物產生有害影響,養殖水體中的氨濃度不應超過0.1 mg·L-1[20]。然而,在富營養化水體中聚集的藍藻降解會產生大量的氨,該過程使得水體中局部區域的氨濃度始終保持在很高的水平。例如,太湖藍藻水華污染湖區的氨濃度能夠達到0.2～3.4 mg·L-1,甚至在2007年無錫太湖藍藻爆發期間,局部峰值高達12 mg·L-1,遠遠超過了水生生物所能承受的安全濃度范圍[21]。

事實上,關于氨對水生生物的負面影響已被廣泛報道。例如,氨脅迫顯著影響了白對蝦的非特異性免疫,并且還可能破壞其抗氧化系統的平衡[22]。長期的氨暴露不僅會嚴重損害淡水渦蟲的行為活動,甚至會導致渦蟲死亡[23]。在枝角類中,隨著氨濃度升高,大型溞(Daphniamagna)性成熟和首窩產卵時間均延遲,總產卵量減少,蛻皮次數顯著降低[24]。然而,目前尚不清楚氨是否會干擾枝角類對捕食風險的響應以及捕食風險是否會影響枝角類對氨脅迫的敏感性。

為此,研究選擇枝角類代表性物種蚤狀溞(Daphniapulex)作為受試生物,觀察并測定了它們在氨和魚類信息素聯合處理條件下的各項誘導型防御指標,以期從種間關系的角度揭示氨的負面作用。筆者提出以下科學假設:(1)高濃度氨會抑制蚤狀溞的誘導型生活史防御;(2)氨對蚤狀溞誘導型生活史防御的抑制作用存在時間累積效應;(3)捕食風險會降低蚤狀溞對氨脅迫的耐受性。

1 材料與方法

1.1 枝角類與藻類的培養

研究使用在實驗室培養多年的蚤狀溞克隆進行實驗,該克隆采自藍藻水華暴發期間的巢湖(30°25′ N, 117°16′ E)[25]。蚤狀溞長期培養在含有1.5 mg·L-1(以C計)蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoides,FACHB11)的COMBO培養基中,每2 d更換1次培養基并重新添加定量的食物。培養溫度為25 ℃,光照強度為40 μmol· m-2·s-1,光暗比為14 h∶10 h。

蛋白核小球藻在含有2 L BG-11培養基的錐形瓶中進行無菌培養,培養條件與上述蚤狀溞的培養條件相同。待藻類生長到對數期,以5 000 g離心力離心15 min收獲藻細胞,隨后將其儲于4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.2 氨的制備與濃度測定

實驗藥物為NH4Cl(CAS編號 12125-02-9,分析純,純度99.5%),購自 Aladdin 公司(中國上海)。實驗前用無氨水配制氯化銨母液,并用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009)測定其準確濃度(以N計)。根據EMERSON等[26]的方法,使用以下公式將測定得到的氯化銨母液濃度轉換為氨濃度:

(1)

K=0.090 18 + 272 9.92/T。

(2)

式(1)～(2)中,A為氨質量濃度,mg·L-1;N為實際的氯化銨母液的質量濃度,包括溶解的未電離的氨和離子形式的氨,mg·L-1;K為解離常數,pKa;T為開氏溫度,K。實驗時按比例稀釋至所需濃度?；谒{藻爆發期間水體中的氨濃度[27],并結合水生生物的耐受濃度[23],實驗共設置了5種氨質量濃度:0、0.01、0.10、0.30和0.60 mg·L-1。為了保證整個實驗周期中氨濃度的穩定,每天隨機取樣監測濃度變化。

1.3 魚類信息素的制備

根據現有的研究,已鑒定到的魚類信息素的具體物質成分有5α-鯉膽甾醇硫酸酯(5α-cyprinol sulfate)[28]、魚類表皮黏液中的氨基糖[29]以及魚類表皮黏液中的細菌[30]等。其中,5α-鯉膽甾醇硫酸酯和魚類表皮黏液中的細菌均已被證明能夠引起枝角類的行為防御響應[28,30]。實驗中所使用的能夠誘導枝角類表現出生活史防御的魚類信息素是一種產生于魚類腸道的食物依賴型信息素,這種信息素對獵物的作用效果高度依賴于捕食者所攝入的食物與獵物的親緣關系[31]。因此,為了體現出這種食物依賴型信息素的整體生態效應并防止其他外界因素干擾,實驗使用捕食者魚類(以蚤狀溞為食)的生活濾液作為信息素,研究蚤狀溞的誘導型防御響應。這種方法也是國際上關于枝角類誘導型防御研究的通用做法[32]。魚類信息素的具體制備方法參照GU等[4]所述,挑選8只體長3～5 cm的高體鳑鲏魚(Rhodeusocellatus),每只投喂約200只蚤狀溞,喂食6 h。隨后,將鳑鲏魚轉移到4 L COMBO培養基中釋放信息素18 h,期間不投喂食物。為了盡可能去除能夠有效降解魚類信息素的細菌[30],使用0.22 μm孔徑濾膜(Millipore,美國)過濾經鳑鲏魚處理后的COMBO培養基。過濾后獲得的魚類信息素于-20 ℃條件下冷凍保存。正式實驗時魚類信息素添加到培養體系中的最終稀釋濃度為每10 L培養基1條魚,該濃度已被證明足夠誘導枝角類產生防御響應[8]。

1.4 實驗設計

為了排除母體效應并盡量減少實驗個體之間的差異,隨機收集同步發育的母體蚤狀溞的第3代第3窩新生幼體(<12 h)用于正式實驗。為了研究氨對蚤狀溞經魚類信息素誘導的反捕食防御的影響,每個氨濃度下均包含了有、無魚類信息素2種處理。每個處理設置10個重復,每個重復包含1個新生幼體,所有實驗個體均在50 mL小燒杯中單獨培養。整個實驗過程在25 ℃、光照強度為40 μmol·m-2·s-1、光暗比為14 h∶10 h的條件下進行。為了保證實驗過程中氨濃度的穩定以及食物和信息素水平的恒定,每天更換各處理中的培養基,并提供含碳量為1.5 mg·L-1的蛋白核小球藻。蛋白核小球藻的碳含量通過元素分析儀(Vario EL Ⅲ,Elementar,德國)測定,隨后建立碳含量與細胞數之間的線性關系,以確定每個蛋白核小球藻細胞的平均碳含量。根據每個細胞的碳含量,計算出質量濃度為1.5 mg·L-1時所需的細胞密度,最后計算培養獲得的小球藻的總細胞數,并將其稀釋至1.5 mg·L-1。

實驗共持續14 d,這樣的暴露時間足以顯示出氨對蚤狀溞的影響和蚤狀溞的誘導型反捕食防御反應。實驗過程中每天記錄蚤狀溞的生活史參數:存活數、首窩產卵時間、性成熟體長、性成熟尾刺長、第14天體長、第14天尾刺長、相對尾刺長、產卵窩數、總產卵量、平均每窩產卵量等。為了精確獲得每個個體的首窩繁殖時間,在蚤狀溞性成熟懷卵后,每3 h檢查1次燒杯中是否出現新生幼體。將相同處理下的第1窩所有后代移出并混合在一起,隨機選取10只幼體,測量體長、尾刺長等形態指標。對第3窩后代也進行相同操作。

1.5 數據分析

通過雙因素方差分析(two-way ANOVA)并進行Tukey′s HSD檢驗,分析不同氨濃度和魚類信息素處理對蚤狀溞性成熟體長、性成熟尾刺長、第14天體長、第14天尾刺長、相對尾刺長、產卵窩數、總產卵量、幼體體長、幼體尾刺長等防御指標的影響。

相對尾刺長(LRS)的計算公式為

LRS=LS/LB。

(3)

式(3)中,LS為尾刺長,μm;LB為體長,μm。

生長速率(G)的計算公式為

G=(lnWt-lnW0)/t。

(4)

式(4)中,Wt為第t天的個體干重,μg;W0為初始干重,μg;t為天數,d。

個體干重(W)的計算公式為

lnW=lnLB×2.635-16.016。

(5)

式(5)中,W為干重,μg。

為了評估氨對魚類信息素作用的影響,計算每個氨濃度下魚類信息素處理組相比于對照組引起的變化百分比(R),計算公式為

(6)

式(6)中,Vt和Vc分別為蚤狀溞的特定防御性狀在存在和不存在魚類信息素時的表達值。

使用以下方程評估氨對魚類信息素誘導的蚤狀溞防御性狀的干擾程度(ID):

(7)

式(7)中,CN和CA分別表示蚤狀溞性狀在沒有魚類信息素存在時對無氨和有氨的響應情況;FN和FA分別表示蚤狀溞性狀在魚類信息素存在時對無氨和有氨的響應情況。

所有數據統計分析均使用SigmaPlot 14.0軟件進行。數據均表示為平均值±標準誤的形式。當P<0.05 時,統計檢驗被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 存活時間和生長速率

在研究所設任何氨濃度下,對照組和信息素處理組間蚤狀溞的存活時間均未表現出顯著差異。隨著氨濃度增加,不同處理組中蚤狀溞均在氨濃度為0.3或0.6 mg·L-1時出現死亡,尤其在氨濃度為0.6 mg·L-1時,對照組和信息素處理組中蚤狀溞的存活時間分別降至13.4和13.2 d(圖1)。就蚤狀溞的生長速率而言,魚類信息素和氨均顯著降低了蚤狀溞的生長速率,并存在顯著的交互作用(表1)。在高濃度氨的影響下,經魚類信息素誘導的蚤狀溞生長速率的相對變化也顯著減小(圖2)。

表1 魚類信息素和氨對蚤狀溞生長速率影響的雙因素方差分析

圖1 不同氨濃度對蚤狀溞存活時間的影響

英文大寫或小寫字母不同分別表示不同氨濃度之間生長速率存在顯著差異(P<0.05)。***表示相同氨濃度下對照組或信息素處理組之間生長速率存在顯著差異(P<0.01)。

2.2 形態指標

方差分析結果表明,添加魚類信息素顯著減小了蚤狀溞的性成熟體長和第14天體長、增加了性成熟尾刺長和第14天尾刺長;氨濃度的升高顯著削弱了蚤狀溞的性成熟體長、第14天體長、性成熟尾刺長和第14天尾刺長(表2、圖3)。魚類信息素和氨濃度處理之間無明顯交互作用。值得說明的是,0.6 mg·L-1的氨濃度顯著削弱了魚類信息素誘導下蚤狀溞性成熟體長和第14天體長的相對變化率,即高濃度氨顯著抑制了蚤狀溞體長對魚類信息素的響應強度。

表2 魚類信息素和氨聯合對蚤狀溞及其幼體形態指標影響的雙因素方差分析

英文大寫或小寫字母不同表示不同氨濃度之間某指標存在顯著差異(P<0.05)。***表示相同氨濃度下對照組和信息素處理組之間某指標存在顯著差異(P<0.01)。

就蚤狀溞后代的形態指標而言,魚類信息素顯著減小了蚤狀溞第1窩和第3窩后代的體長,增加了第3窩后代的尾刺長和相對尾刺長;而氨濃度對蚤狀溞第1窩和第3窩后代的所有形態指標均無顯著影響(表2、圖4)。值得說明的是,蚤狀溞第1窩后代的尾刺長和相對尾刺長在有、無魚類信息素的處理下均無顯著差異。

星號表示相同氨濃度下對照組和信息素處理組之間存在顯著差異(***P<0.001,**P<0.01)。

2.3 繁殖指標

添加魚類信息素顯著提前了蚤狀溞的首窩產卵時間,削減了平均每窩后代數和總后代數;高濃度氨顯著延長了蚤狀溞的首窩產卵時間,削減了產卵窩數、平均每窩后代數和總后代數(圖5、表3)。魚類信息素和氨僅對蚤狀溞的總后代數存在顯著的交互作用。

表3 魚類信息素和氨濃度聯合對蚤狀溞繁殖指標影響的雙因素方差分析

英文大寫或小寫字母不同表示不同氨濃度之間某指標存在顯著差異(P<0.05)。星號表示相同氨濃度下對照組和信息素處理組之間某指標存在顯著差異(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

在任何氨濃度條件下,魚類信息素處理組中蚤狀溞的首窩產卵時間均顯著早于對照組。隨著氨濃度的增加,當氨濃度達到0.6 mg·L-1時,對照組和魚類信息素處理組中蚤狀溞的首窩產卵時間分別延遲了4.2和2.1 h。此外,隨著氨濃度的升高,蚤狀溞的總后代數、平均每窩后代數及產卵窩數均顯著下降。當氨濃度達到0.6 mg·L-1時,對照組和魚類信息素處理組中蚤狀溞的總后代數分別降低了39.7%和42.7%,平均每窩后代數分別降低了28.5%和31.9%。

2.4 氨對防御指標的干擾程度

在魚類信息素處理下,蚤狀溞的主要防御特征表現為生長速率減緩、體長減小、尾刺長增長、相對尾刺長增加、總后代數和平均每窩后代數減少、窩數增加(圖1～5)。

就表現在形態上的防御指標而言,氨對成熟時蚤狀溞表現在形態上的防御指標的干擾并不顯著。然而隨著實驗時間的延長及氨濃度的增加,蚤狀溞第14天的形態防御指標受到顯著干擾(圖6)?？傊?除了成熟時蚤狀溞表現在形態上的防御指標外,隨著氨濃度的增加,氨對蚤狀溞其他防御指標的干擾程度均顯著增強。

直線通過線性回歸擬合,a代表擬合線的斜率。

3 討論

氨是淡水環境中的主要污染物之一,水體中高濃度的氨會對多種水生生物產生嚴重毒害作用[18-19]。隨著氨濃度的升高,蚤狀溞響應魚類捕食風險而表現出的體長減小、生長速率減緩、產卵提前等防御表現被明顯削弱。并且隨著暴露時間的延長,氨對蚤狀溞及其反捕食防御特征的抑制作用加劇。此外,魚類信息素的存在增強了高濃度氨對蚤狀溞部分生活史性狀(如首窩產卵時間、繁殖數量等)的不利影響。這些結果很好地支持了該研究的科學假設,即氨脅迫干擾了枝角類經捕食者信息素誘導的防御響應,同時捕食風險也降低了枝角類對氨脅迫的耐受性。

3.1 氨對蚤狀溞生活史特征的影響

關于高濃度氨作用于枝角類產生的一系列生理后果已被廣泛報道,包括產卵時間延遲、種群數量下降、死亡率增加等[19-21]。該研究中,高濃度氨同樣延遲了蚤狀溞的產卵時間、削減了蚤狀溞的后代數量,還對蚤狀溞的存活構成威脅。此外,隨著實驗時間的延長,高濃度氨顯著削減了大型溞的體長,這說明氨對蚤狀溞的毒性作用可能存在時間累積效應,即氨可能會通過長期慢性接觸而損害枝角類的生長發育[33]。事實上,除氨以外,這種時間累積效應在其他污染物(如光污染、抗抑郁藥舍曲林、微塑料等)對枝角類的毒性研究中也有報道[6]。

3.2 氨對蚤狀溞誘導型生活史防御策略的影響

捕食者(如魚類)信息素會誘導枝角類在生長和繁殖之間進行能量權衡,即削弱用于生長的能量并增加用于繁殖的能量(體型顯著減小和繁殖力增加),這種權衡不僅有利于降低枝角類被視覺性捕食者魚類發現的可能性,還有利于增加被捕食前的繁殖概率和輸出[7]。然而,水體中的其他環境脅迫可能改變枝角類的能量權衡,從而干擾其經捕食者誘導的這種反捕食防御反應[34]。高濃度氨同時抑制了蚤狀溞表現在生長速率、體長和繁殖數量上的防御。據報道,枝角類的繁殖指標對含氮污染物的敏感性遠高于生長指標對其的敏感性[35]。因此推測在捕食風險和氨共存的情況下,枝角類可能會放棄在繁殖上過多的能量消耗,優先把能量分配給生長指標,從而干擾或抑制了枝角類表現在生長指標上的防御。這表明在自然環境中受到多重環境脅迫的枝角類為了有利于自身生存,會將能量重新投資分配給生長、繁殖,這種資源再分配會干擾它們為了適應性地應對捕食風險而表現出的資源分配權衡[5,14],從而可能導致枝角類的誘導型防御受到抑制。此外,應對壓力(包括枝角類應對捕食壓力)是動物消耗能量的過程,可能會影響新陳代謝。LYU等[36]的研究顯示,氨可以誘導氧化應激并破壞枝角類的正常代謝,因此這也可能是氨干擾枝角類應對捕食風險響應的重要原因之一。

在魚類信息素作用下,蚤狀溞后代亦表現出明顯的防御特征。值得說明的是,隨著氨濃度的升高和暴露時間的延長,蚤狀溞后代表現出的防御特征不僅沒有被抑制和影響,反而在第3窩時后代表現出更加穩定的防御,即相比于無信息素的對照組體長顯著減小,尾刺長和相對尾刺長顯著增加。相反,蚤狀溞母體表現出的誘導防御則隨著暴露時間的延長而被高濃度氨顯著抑制。一般來說,環境脅迫會降低反捕食防御帶來的個體生存機會和繁殖成功率,但是一旦成功繁殖,枝角類則會以削弱自身防御為代價,通過母體效應將其長時間應對捕食風險而產生的防御更好地傳遞給后代[7,37],以增強后代應對捕食風險的能力[10]。

3.3 捕食風險對枝角類耐受氨脅迫的影響

該研究中,在高濃度氨脅迫下蚤狀溞的繁殖特征受到明顯抑制,其中魚類信息素處理組中蚤狀溞總后代數和每窩后代數的削減率(42.7%和31.9%)均高于對照組(39.7%和28.5%)。不僅如此,高濃度氨下魚類信息素處理組中蚤狀溞的平均存活時間縮短至13.2 d,而對照組則縮短至13.4 d,這表明經魚類信息素誘導后形成反捕食防御的枝角類更容易受到環境壓力的脅迫。事實上,早在20世紀90年代就有研究報道幽蚊幼蟲釋放的化學物質能夠降低枝角類(Daphniaambigua)對環境脅迫(如高溫、食物短缺、低溶氧等)的耐受性[38]。近年來,YIN等[39]亦研究發現,暴露于捕食風險的盔形溞更容易受到隨后的寄生蟲感染。一方面,捕食者誘導的防御會改變獵物的能量分配和消耗能量[34],由此可以預期在捕食風險下枝角類耐受其他環境脅迫的能力會減弱。另一方面,捕食者暴露會削弱獵物的免疫反應[40],從而增加獵物對環境脅迫和病原體的易感性?？傊?投資防御威脅生命的捕食者會降低枝角類對環境脅迫的耐受。

4 結論

綜上所述,隨著暴露時間的增加,高濃度的氨不僅能夠改變蚤狀溞的生長和繁殖特性、抑制蚤狀溞響應捕食風險的能力,同時捕食風險下的蚤狀溞也會反過來削弱蚤狀溞對高濃度氨的耐受性。捕食風險下枝角類耐受環境脅迫(如高濃度氨)的能力降低,這可能會加速環境脅迫對枝角類反捕食防御的抑制作用,增加其防御特征被削弱的程度,從而進一步增加枝角類被捕食的風險,最終影響湖泊中枝角類的種群穩態。該研究不僅促進了對枝角類如何在環境脅迫下響應捕食風險的理解,而且為捕食風險如何改變枝角類對環境脅迫的耐受性提供了新的見解。