腫瘤壞死因子樣細胞凋亡弱誘導物/成纖維細胞生長因子誘導早期反應蛋白14軸及下游核因子κB通路的關鍵因子mRNA及蛋白表達差異與老年肥胖的相關性

趙艷姣,卓婭·買買提烏斯滿,劉金玲,王紅梅

(新疆維吾爾自治區人民醫院綜合保健內科二病區,烏魯木齊 830000)

肥胖是由能量攝入較高或體力活動較少等因素引起的體內能量正平衡,是多種慢性病的嚴重危險因素。Yamada等[1]發現老年人群中心血管疾病、高脂血癥和糖尿病的患病率隨體質量指數(body mass idex,BMI)增加而增加,且肥胖組的值相對較大。老年肥胖的并發癥較多,嚴重危害身體健康。肥胖的病因涉及多方面,包括由促炎細胞因子水平升高介導的低度慢性炎癥狀態,與脂肪組織產生并釋放各種促炎和抗炎因子有關,如脂肪因子瘦素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等細胞因子[2]。腫瘤壞死因子樣細胞凋亡弱誘導物(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)屬于腫瘤壞死因子超家族促炎細胞因子,被認為與多種疾病相關,TWEAK/成纖維細胞生長因子誘導早期反應蛋白14(fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14,Fn14)軸也可能參與肥胖的炎癥失衡。

TWEAK與Fn14結合可激活下游信號通路,如核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路,這些通路涉及細胞增殖和分化[3]。眾所周知,NF-κB信號通路是多種疾病炎癥的核心調節因子。雖然TWEAK/Fn14軸和NF-κB通路分別被證實在肥胖的發病中具有重要地位,但二者在肥胖發生中的相互作用尚缺乏依據。本研究通過病例-對照研究來分析TWEAK/Fn14軸及激活NF-κB通路的關鍵因子表達差異與老年人中心性肥胖的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2017年9月至2018年5月在新疆農牧區常住居民中采用多級隨機抽樣方法進行流行病學調查,共2100名居民參與,其中不配合222名,數據不完整40名,最終完成調查居民1838名。其中中心性肥胖836名,無肥胖1002名,按照1∶1比例由計算機隨機生成的數字分為中心性肥胖組(n=40)和無肥胖組(n=40)。調查時,由經過統一培訓的專職人員收集性別、年齡、身高、體質量指數、腰圍、收縮壓、舒張壓、民族、學歷、婚育史等信息。本研究經新疆自治區人民醫院醫學倫理委員會認定符合醫學倫理(倫理審查號:KY2021031027),所有參與者簽署知情同意書。

中心性肥胖的診斷標準:根據《中國居民肥胖防治專家共識》[4],無肥胖為男性腰圍<90cm、女性腰圍<85cm;中心性肥胖為男性腰圍≥90cm、女性腰圍≥85cm。

納入標準:年齡≥60歲;能獨立行走,未使用輔具。排除標準:認知障礙;言語障礙;精神疾病;疾病急性發作期;重要器官功能衰竭;近期手術史;服用激素類藥物;感染性疾病;惡性腫瘤及肺結核等消耗性疾病。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及檢測指標 每位研究對象采集空腹靜脈血至少5ml,放入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管中,輕輕顛倒8～10次,充分混勻;立即進行梯度離心,分離血清與外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),血清樣本測定血清谷草轉氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)、肌酐(creatinine,Cr)、總膽固醇(total cholesterol,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量。將分離好的PBMC添加1ml Trizol試劑,儲存于-80℃冰箱,待實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測mRNA表達;另外一部分PBMC直接儲存于-80℃冰箱,用于Western blotting檢測蛋白表達。

1.2.2 PCR檢測 采用PCR檢測PBMC中TWEAK、Fn14、IκB激酶-α(inhibitor of kappa B kinase-α,IKKα)、IκB激酶-β(inhibitor of kappa B kinase-β,IKKβ)、NF-κBp65的mRNA表達。使用primer5軟件設計TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κBp65基因引物序列,詳見表1;反應體系包括Evagreen 2×qPCR master mix 10μl、上游引物0.6μl、下游引物0.6μl、cDNA 2μl、RNase-free water6.8μl,總反應體積為20μl。PCR條件:預變性95℃ 10min、1個循環,變性95℃ 15s,退火/延伸60℃ 60s,共40個循環。通過SYBR法進行熒光定量檢測,采用2-△△ct的方法計算基因的相對表達量。

表1 熒光定量mRNA檢測引物信息

表2 中心性肥胖組及對照組臨床資料比較

1.2.3 Western blotting 采用Western blotting檢測TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達情況。將細胞樣本經胰酶消化后,加300μl裂解液充分混勻。4℃放置1h,12000轉/min,4℃,離心15min,收集上清。80V恒壓使溴酚藍至分離膠處,恒壓100V,90min。十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳結束,將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜在甲醇中浸泡10s,蒸餾水中漂洗1min,然后將聚丙烯酰胺凝膠、濾紙及處理過的PVDF膜在Transfer buffer中浸泡10min,制備轉膜“三明治”。轉膜后將PVDF膜水洗3次,10min/次。用含5%脫脂奶粉封閉液封閉轉印膜1h,然后TBST洗3次,10min/次。隨后進行一抗和二抗的孵育。將顯色液混合,加2ml至膜上,化學發光儀檢測、拍照。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組臨床特征比較

兩組間年齡、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)及性別構成差異有統計學意義(P<0.05);但收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、生化指標、民族、文化程度、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、冠心病構成差異均無統計學意義(P>0.05;表3)。

2.2 兩組外周血PBMC各基因mRNA含量比較

中心性肥胖組外周血PBMC中的Fn14、IKKα、IKKβ基因mRNA含量高于對照組,且差異有統計學意義(P<0.05);中心性肥胖組TWEAK及NF-κBp65基因mRNA含量也高于對照組,但差異無統計學意義(P>0.05;表4)。

表4 外周血PBMC中基因mRNA表達水平分析

2.3 兩組外周血PBMC各因子的蛋白表達水平比較

與對照組相比,中心性肥胖組外周血PBMC中的Fn14、IKKα、IKKβ蛋白表達水平升高,且差異有統計學意義(P<0.05);兩組間TWEAK、NF-κBp65差異無統計學意義(P>0.05;表5,圖1)。

圖1 Western blotting 檢測各蛋白表達Figure 1 Protein expression band diagram TWEAK: tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis; Fn14: fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14; IKKα: inhibitor of kappa B kinase-α; IKKβ: inhibitor of kappa B kinase-β; NF-κBp65: nuclear factor-kappa-B p65.

表5 血清分離PBMC中各蛋白表達水平分析

2.4 TWEAK/Fn14及各基因間雙變量Pearson相關性分析

外周血PBMC中TWEAK與Fn14的mRNA水平呈正相關(P<0.01),與IKKα、IKKβ水平無相關性;而Fn14的mRNA水平與IKKα、IKKβ的水平均呈正相關(P<0.05);IKKα、IKKβ的mRNA水平與NF-κBp65的水平也均呈正相關(P<0.01;表6)。

表6 外周血PBMC中各基因mRNA含量相關性分析

3 討 論

肥胖會引起老年人多器官免疫系統的改變,使脂肪組織、肝臟、胰島等呈低度慢性炎癥[5]。實際上肥胖與脂肪組織升高有關,脂肪組織生長可能是每個成熟脂肪細胞的脂質負荷增加或數量增多,亦或是兩者兼有。脂肪組織除儲存能量外,也是一種內分泌細胞,會產生多種炎癥分子,稱為脂肪細胞因子,如TNF-α、IL-6、瘦素等[6],因促炎因子升高導致體內長期處于低度慢性炎癥狀態。

TWEAK是TNF超家族的Ⅱ型膜蛋白,其膜結合形式(a membrane anchored form,mTWEAK)和可溶性變體(a cleaved soluble form,sTWEAK)都有生物活性,均可結合受體Fn14,進而控制許多生物活動[7]。Fn14是TWEAK的特異性受體,在細胞外結構域與TWEAK相互作用,通過腫瘤壞死因子受體相關因子結合位點與該因子家族蛋白相結合而傳導TWEAK信號。TWEAK在成人組織中廣泛表達,如單核細胞、骨骼肌和脂肪細胞等。研究表明在肥胖者的皮下和內臟脂肪組織中TWEAK及Fn14的水平升高[8],但也有研究表明[9]TWEAK和相應的激動性抗體具有防止脂肪組織生長的潛力。Ponce-de-Leon等[10]發現皮下或內臟脂肪與TWEAK呈負相關。本研究提示中心性肥胖組人外周血PBMC中的Fn14基因mRNA含量及蛋白表達水平明顯高于對照組,且差異有統計學意義;而中心性肥胖組TWEAK基因mRNA含量及蛋白表達水平雖高于對照組,但差異無統計學意義。Fn14作為TWEAK的受體,在本研究中二者呈正相關(r=0.472,P<0.01)。Gomez-Martin等[11]在肥胖者中檢測到sTWEAK水平降低,其原因有兩種可能:一種是在炎癥因子刺激下Fn14表達增加,從而增加了sTWEAK的可用性,這可能導致血清sTWEAK的外周減少[12];另一種假設提出了分化簇163(cluster of diffe-rentiation 163,CD163)的參與,CD163是一種單核細胞-巨噬細胞表面受體,已被認為是sTWEAK的清道夫受體?？扇苄訡D163(a soluble form CD163,sCD163)是一種巨噬細胞特異性血清標志物,炎癥條件下升高,在體外可促進sTWEAK降解[13]。因此,sTWEAK的減少可能與sCD163的存在有關。本研究中老年中心性肥胖組與對照組之間TWEAK表達差異無統計學意義可能與sTWEAK的減少有關。

TWEAK與Fn14結合已被證明可激活多種細胞內信號通路,包括NF-κB通路。NF-κB是一種普遍存在的轉錄因子,與增殖、分化、凋亡、炎癥等相關?；罨腘F-κB可促進大多數炎癥細胞因子分泌[14]。NF-κB作為二聚體發揮作用,在細胞中最常見形式是p50/p65和p50/p50,其次是p50/c-Rel和p52/RelB,取決于細胞類型和激活刺激物。NF-κB通路是通過IKK復合物激活的,該復合物主要由兩個催化亞基IKKα、IKKβ和一個寡聚調節亞基IκB激酶-γ(inhibitor of kappa B kinase-γ,IKKγ)組成[15]。在生理條件下,NF-κB位于細胞質中,與抑制劑IκB結合而無活性。據報道IKK-β是多種促炎因子激活NF-κB通路的必要亞基。在刺激先天免疫受體(如Toll樣受體)或細胞因子受體(如Fn14受體)后,IKKβ被激活并磷酸化IκB蛋白,導致IκB失活后與NF-κB解離,誘導NF-κB從細胞質轉移到細胞核,進而激活基因轉錄[16],此為NF-κB經典途徑激活。相比之下,替代途徑需激活上游NF-κB誘導激酶(NIK或MAP3K14)和IKKα,并將p100亞基蛋白水解加工成p52[17]。研究證實通過IKK抑制劑可下調脂肪組織中IKK/NF-κB通路,以減弱肥胖的慢性炎癥狀態[18]。Romo等[19]發現肥胖釋放的細胞外基質可使IKKα、IKKβ的mRNA和蛋白質水平增加,并激活NF-κB通路發揮促炎作用。然而Tsaousidou等[20]證明表達刺豚鼠相關肽的神經元中的IKK2激活不會導致肥胖。本研究發現,與對照組相比,中心性肥胖組PBMC中IKKα、IKKβ基因mRNA含量及蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);Fn14的mRNA水平與IKKα、IKKβ的水平均呈正相關(r=0.262、0.275;P<0.05);IKKα、IKKβ與NF-κBp65基因mRNA含量呈正相關(r=0.747、0.692;P<0.01);提示TWEAK/Fn14可能與NF-κB激活相關?？紤]到NF-κB轉錄因子廣泛分布于不同類型的細胞中,發揮作用的二聚體類型較多,且具體取決于細胞類型和激活刺激物,故該研究NF-κBp65蛋白表達水平減低可能與脂肪細胞中的表達較其他細胞(如骨骼肌細胞、肝細胞等)較低相關,但仍需進一步驗證。

綜上,本研究通過探討TWEAK/Fn14及激活下游NF-κB通路的關鍵炎癥因子表達與老年中心性肥胖的關系,發現新疆農牧區常駐老年人中心性肥胖與外周血PBMC中Fn14、IKKα、IKKβ的蛋白、mRNA的高表達相關,TWEAK/Fn14可能通過調節IKK激活NF-κB通路,參與老年中心性肥胖的進展。但該研究為橫斷面研究,只能探究其相關性,且樣本量較少,未來需擴大樣本量進一步開展前瞻性研究進行驗證,并開展細胞及動物實驗研究相關機制。