高糖高脂環境下抑制自噬對矢車菊素-3-O-葡萄糖苷保護胰島β細胞損傷的影響

李 恒, 張翠蘭

(海南西部中心醫院內分泌科, 海南 儋州 571700)

胰島β細胞是主要的胰島細胞,其主要功能是合成并分泌胰島素,調節機體血糖水平。胰島β細胞損傷后功能障礙和胰島素抵抗是2型糖尿病的主要致病因素[1]。處于高糖高脂(high glucose and high fat,HGHF)環境下的胰島β細胞不僅會發生死亡,還會影響胰島素分泌水平,導致糖尿病的發生發展[2]。因此,減少或抑制HGHF環境下胰島β細胞損傷能夠延緩糖尿病的發生,這也是有效控制病情持續性惡化而引起多種發病癥的關鍵步驟。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)是一種廣譜存在的花青素類型,屬于類黃酮組多酚,主要源于黑色、紫色或紅色蔬菜水果中。C3G具有抗炎、抗氧化作用,對于多種疾病如癌癥、心血管疾病、腸道疾病和神經退行性疾病的防治中均能夠產生積極效應[3]。研究表明,較高的膳食花青素攝入量與較低的糖尿病發生風險相關[4],此外,C3G能夠減輕胰島蛋白和β-淀粉樣蛋白(amyloid β peptide 1-42,Aβ1-42)刺激下的胰島β細胞損傷[5]。然而,C3G抗糖尿病作用的潛在分子機制尚未明確。鑒于此,本研究采用葡萄糖與棕櫚酸建立體外HGHF環境,觀察C3G對HGHF環境下胰島β細胞糖脂毒性的抵抗效果并探究其作用機制,以期為糖尿病新治療方案的開發提供思路。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑:MIN6小鼠胰島β細胞購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司,胎牛血清購于南京森貝伽生物科技有限公司,RPMI-1640 培養液和胰蛋白酶購于美國ScienCell公司,葡萄糖、棕櫚酸及3-MA購于美國Sigma公司,C3G和DCFH-DA活性氧熒光探針購于北京康瑞納生物科技有限公司,CCK-8檢測試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司,MDA比色法測試盒、SOD比色法測試盒及GSH比色法測試盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,胰島素ELISA檢測試劑盒購于上海遠慕生物科技有限公司,Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司,通用反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司,蛋白裂解液購于上海雅吉生物科技有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司,PVDF膜和ECL化學發光液購于上海碧云天生物研究所,LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記抗體購于英國Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養:胰島β細胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養,置于37℃、5%CO2恒溫箱內,待細胞生長至融合度達到80%以上時,采用0.25%胰蛋白酶消化,進行常規傳代。

1.2.2CCK-8法:將胰島β細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中,過夜培養后,換用含10、20、30、40、50μmoL/L C3G的培養液處理24h,以未經處理的胰島β細胞作為對照組,采用CCK-8法檢測各處理組細胞活力,按照試劑盒說明書步驟操作,多功能酶標儀測定各孔在490 nm 處的吸光度(OD),計算細胞活力,細胞活力(%)=[(OD處理組-OD空白組)/(OD正常組-OD空白組)]×100%。再將胰島β細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸的培養液建立高糖高脂環境,同時添加10、20、30、40、50μmoL/L C3G處理,同樣以未經處理的胰島β細胞作為對照組,單獨25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸處理的胰島β細胞作為HGHF組,24h后收集細胞,按照CCK-8法檢測各處理組細胞活力。

1.2.3分組與處理:將胰島β細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板中,在37℃、5%CO2恒溫箱過夜培養至細胞貼壁后,分為4組:①對照組,胰島β細胞在普通培養液中培養24h;②HGHF組,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸的培養液建立HGHF模型,培養細胞24h;③HGHF+C3G組,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸、40μmoL/L C3G的培養液培養細胞24h[6];④HGHF+C3G+3-MA組,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸、40μmoL/L C3G的培養液培養細胞24h,同時添加10mmoL/L自噬抑制劑3-MA處理細胞,3-MA給藥劑量參考文獻中的劑量[7]。結束后,收集以上4組細胞,CCK-8法檢測各處理組細胞活力。

1.2.4氧化應激指標檢測:將胰島β細胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中,按1.2.3分組處理后,添加1μmoL/L DCFH-DA熒光探針,37℃孵育30min,PBS洗滌,采集熒光圖像,Image J分析熒光強度。并收集各處理組細胞,棄上清,加入裂解液提取總蛋白,分別按照MDA、SOD、GSH的檢測試劑盒說明書,對細胞總蛋白中各指標進行測定。

1.2.5ELISA法:收集各處理組胰島β細胞,棄上清后,PBS洗滌,分別添加含2.8mmoL/L和16.7mmoL/L葡萄糖的KRBH緩沖液,37℃孵育1h,1000r/min離心20min,收集上清,按照胰島素ELISA試劑盒說明書測定上清液中胰島素分泌量。

1.2.6實時熒光定量PCR:采用Trizol法提取各處理組胰島β細胞的總RNA,檢測RNA純度與濃度。通過逆轉錄反應獲得cDNA,使用熒光定量試劑盒進行擴增,按照說明書配置25μL反應體系,設置條件為95℃、30s;95℃、5s,60℃、30s,40cycles,在CFX96儀上進行反應。反應結束后,獲得擴增曲線與溶解曲線,通過2-△△Ct法分析各個待測樣本內目的基因的mRNA相對表達量,以GAPDH作為內參。引物見表1。

表1 基因引物序列

1.2.7Western blot:在各處理組胰島β細胞中加入裂解液充分裂解細胞,離心后收集上清,BCA法定量。根據蛋白濃度在上樣孔中加入等量蛋白,通過10%SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜,脫脂奶粉封閉 2h,TBST 洗滌,分別加入Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3抗體(1∶1000),4 ℃搖床孵育過夜,次日,TBST洗膜,加入對應二抗(1∶5000)繼續孵育2h,采用ECL化學發光液顯影,凝膠成像儀采集蛋白條帶,ImageJ分析灰度值,以 GAPDH 作為內參,以目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比作為目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1C3G對高糖高脂環境下胰島β細胞活力的影響:與對照組比較,10、20、30、40、50μmoL/L C3G處理對胰島β細胞活力均具有顯著的促進作用(P<0.05),但各濃度之間的活力差異無統計學意義(P>0.05),見圖1A。HGHF組胰島β細胞活力顯著低于對照組(P<0.05),而與HGHF組比較,在高糖高脂環境下,20、30、40、50μmoL/L C3G能夠顯著提高胰島β細胞活力(P<0.05),且隨著C3G濃度升高,細胞活力越高(P<0.05),但40、50μmoL/L C3G處理下細胞活力之間差異無統計學意義(P>0.05),見圖1B,因此后續選擇40μmoL/L作為C3G的處理濃度。

圖1 各處理組胰島β細胞活力

加入自噬抑制劑3-MA抑制自噬水平后,對4組胰島β細胞活力進行檢測比較發現,與對照組比較,HGHF組細胞活力顯著降低(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞活力顯著升高(P<0.05);而與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞活力則顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各處理組胰島β細胞活力

2.2C3G對高糖高脂環境下胰島β細胞氧化應激的影響:利用DCFH-DA熒光探針法檢測各組胰島β細胞內ROS含量,以綠色熒光評價ROS水平。與對照組比較,HGHF組細胞熒光強度顯著升高(P<0.05),表明ROS含量增加;與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞熒光強度顯著降低(P<0.05),表明ROS含量減少;與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞熒光強度顯著降低(P<0.05),表明ROS含量增加。此外,對各組胰島β細胞內MDA、SOD、GSH進行檢測發現,與對照組比較,HGHF組細胞中MDA含量顯著上升(P<0.05),SOD活性和GSH-Px含量顯著下降(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中MDA含量顯著下降(P<0.05),SOD活性和GSH-Px含量顯著上升(P<0.05);與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞中MDA含量顯著上升(P<0.05),SOD活性和GSH-Px含量顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 各處理組胰島β細胞中各氧化應激指標比較

2.3C3G對高糖高脂環境下胰島β細胞胰島素分泌水平的影響:分別以2.8mmoL/L和16.7mmoL/L濃度的葡萄糖刺激各組胰島β細胞后對胰島素分泌水平進行檢測,結果顯示,HGHF組胰島素分泌水平顯著低于對照組(P<0.05);HGHF+C3G組胰島素分泌水平顯著高于HGHF組(P<0.05);但與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組胰島素分泌水平又顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各處理組胰島β細胞分泌胰島素水平比較

2.4C3G對高糖高脂環境下胰島β細胞中自噬信號相關蛋白表達的影響:qRT-PCR檢測結果顯示,與對照組比較,HGHF組胰島β細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA相對表達量顯著下調(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA相對表達量顯著上調(P<0.05);與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA相對表達量顯著下調(P<0.05)。見圖3。

圖3 各處理組胰島β細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA表達水平

Western blot 檢測結果顯示,HGHF組胰島β細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達量顯著低于對照組(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達量則顯著上調(P<0.05);但HGHF+C3G+3-MA組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達量又顯著低于HGHF+C3G組(P<0.05)。見圖4。

圖4 各處理組胰島β細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白表達水平

2.5C3G對高糖高脂環境下胰島β細胞凋亡信號相關蛋白表達的影響:Western blot檢測結果顯示,與對照組比較,HGHF組胰島β細胞中Bax、Cleaved Caspase-3的蛋白相對表達量顯著上調(P<0.05),Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中Bax、Cleaved Caspase-3的蛋白相對表達量顯著下調且Bcl-2蛋白相對表達量顯著上調(P<0.05);與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞中Bax和Cleaved Caspase-3的蛋白相對表達量顯著上調、Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(P<0.05)。見圖5。

圖5 各處理組胰島β細胞中Bax、Bcl-2及Cleaved Caspase-3蛋白表達水平

3 討 論

2型糖尿病是一種進展緩慢的全身性疾病,病因尚不明確。慢性高脂血癥和高血糖是2型糖尿病的典型特征,反復或持續暴露于高葡萄糖和高脂質如飽和脂肪酸環境中時,會導致胰島β細胞損傷,并損害胰島β細胞分泌胰島素的功能。近年來,關于C3G在糖尿病及其并發癥中的研究報道不斷增加。例如,C3G可以直接促進一氧化碳介導的內皮細胞轉運胰島素水平,從而改善胰島素抵抗[8];C3G抑制高血糖環境誘導的人視網膜內皮細胞的遷移與侵襲,并減少糖尿病視網膜病變小鼠的視網膜血管滲漏和血管生成[9];C3G能改善糖尿病腎病小鼠的腎功能以及腎組織損傷[10]。由此可見,C3G在糖尿病的治療中具有較高的潛在價值。本研究使用不同濃度C3G處理胰島β細胞后,結果顯示,胰島β細胞活力升高,提示C3G對胰島β細胞活力具有促進作用;此外,在HGHF環境下加入C3G進行干預,能提高胰島β細胞活力,增加胰島素分泌水平。以上結果表明,C3G對HGHF環境下的胰島β細胞具有保護作用。

糖毒性和脂毒性可誘導細胞發生氧化應激反應,這與胰島β細胞功能障礙和細胞凋亡的發生機制有關。長時間的高糖超負荷會增加細胞中ROS的產生,導致新陳代謝紊亂和細胞內信號傳導途徑異常。高濃度的游離脂肪酸也會誘導ROS生成,進而影響胰島β細胞的活性和功能[11]。MDA作為脂質過氧化的最終分解產物,其反映了細胞的脂質過氧化速率或強度,在高糖環境下MDA含量的高低能間接體現胰島β細胞的損傷程度,即濃度越高表示細胞受損程度越大。SOD作為一種關鍵的細胞內抗氧化劑,可去除細胞內超氧陰離子自由基,GSH-Px則作為清除劑,通過減少過氧化氫和脂質氫過氧化物來保護細胞膜結構和功能的完整性,這兩種指標升高也能反映胰島β細胞受損[12]。本研究結果顯示,HGHF環境下培養的胰島β細胞中ROS含量和MDA含量上升,SOD活性和GSH-Px含量下降;而在HGHF環境下加入C3G干預的胰島β細胞中ROS含量和MDA含量下降,SOD活性和GSH-Px含量上升,說明C3G能夠抑制HGHF環境下胰島β細胞內過度的氧化應激,改善細胞損傷。

自噬是一種溶酶體降解途徑,通過降解受損蛋白質和細胞器來維持細胞代謝穩態。胰島β細胞功能與自噬有著千絲萬縷的聯系。在HGHF環境下自噬通量被阻斷,胰島β細胞受損,胰島素分泌異常[13]。以往有研究表明,C3G會增加細胞進行選擇性自噬的能力,在不利因素下允許細胞靶向特定底物進行降解,以維持細胞內穩態[14]。本實驗結果顯示,在HGHF環境下加入C3G干預的胰島β細胞中,Atg5、LC3、Beclin-1 mRNA表達上調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白表達上調,促凋亡因子Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達下調而抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達上調。由此推測,C3G對HGHF環境下胰島β細胞的保護作用可能與其誘導自噬有關。為了驗證此推測,加入自噬抑制劑3-MA作用后,C3G對HGHF環境下胰島β細胞損傷的改善效應消失,該結果進一步明確了C3G對HGHF環境下胰島β細胞的保護作用與促進自噬有關。

綜上所述,本研究表明C3G對HGHF環境下胰島β細胞具有保護作用,C3G改善能HGHF刺激下的胰島β細胞活性和胰島素分泌水平,抑制氧化應激反應,下調促凋亡因子Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達,上調抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達,該作用機制可能與其促進HGHF環境下胰島β細胞的自噬水平有關。本研究進一步揭示了C3G作為抗糖尿病藥物的潛力,為新藥物開發提供了參考依據。