乳酸菌素對肉雞生長性能、血清指標和腸道健康的影響

王麗君 徐靜雅 賴欣宇 岳閆蕊 馬 慧 崔夢鴿 馮 嘉 姜艷芬 閔育娜*

(1.西北農林科技大學動物科技學院,楊凌 712100;2.西安若翰生物飼料有限公司,西安 710300;3.西北農林科技大學動物醫學院,楊凌 712100)

隨著抗生素藥物殘留和耐藥性等問題在動物生產中日益凸顯,在無抗、減抗飼養背景下,開發用于家禽業的綠色、安全和無殘留抗生素替代品已成為研究熱點。細菌素是細菌核糖體合成的小分子抗菌肽,能夠損傷細菌細胞膜和細胞壁[1],抑制革蘭氏陰性菌和陽性菌活性,被認為是安全和毒副作用小的抗菌肽[2],具有“替抗”潛力[3]。乳酸菌素是乳酸菌代謝過程中合成和分泌的一類抑制革蘭氏陽性菌(尤其是親緣性較近的細菌)生長的殺菌蛋白或多肽[4]。乳酸菌素能抑制腸道產氣莢膜梭菌,降低有害菌豐度,調節腸道菌群結構從而利于肉雞腸道健康和生長性能[5-6]。Kierończyk等[7]研究發現,肉雞飼糧中添加乳酸菌素能提高飼料轉化率,且抗菌作用方式與莫能菌素相似,在肉雞腸道微生物群的正向調節中發揮重要作用。羊秀美等[8]研究發現,飼糧中添加乳酸菌素可顯著改善肉雞抗氧化性能以及腸道組織形態。目前,關于乳酸菌素在愛拔益加(AA)白羽肉雞飼糧中的應用以及乳酸菌素對其生長性能、血清生化指標、血清抗氧化指標和腸道健康的影響的綜合分析的報道較少。因此,本研究旨在探究乳酸菌素對肉雞生長性能、血清生化指標、血清抗氧化指標、腸道形態和盲腸微生物的影響,為其在肉雞無抗養殖中的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用乳酸菌素是一種多肽(98%),為淡黃色粉末,活性為0.8×106IU/g,由大棗、豆粕、玉米粉、麥麩、葡萄糖通過嗜酸乳桿菌和釀酒酵母菌深度發酵而成(產品中乳酸菌已滅活)。

1.2 主要試劑以及儀器

主要試劑:0.9% NaCl溶液、4%多聚甲醛溶液、蘇木精-伊紅染液、瓊脂糖、超純水、75%酒精。

主要儀器:電子體重秤、手術器械(無齒鑷、尖刃手術刀、組織剪、眼科剪)、Agilent 2100生物分析儀、Illumina文庫定量試劑盒。

1.3 試驗動物及試驗設計

試驗選取健康且體重相近的1日齡白羽肉仔雞270只,隨機分為3組,每組6個重復,每個重復15只雞。對照組飼喂基礎飼糧,試驗組在基礎飼糧中分別添加1%、2%乳酸菌素?；A飼糧為玉米-豆粕型飼糧,分為1～21日齡階段飼糧、22～42日齡階段飼糧,均根據《愛拔益加商品代肉雞營養標準》推薦營養需要量配制,其組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.4 化學分析

飼糧干物質含量參照GB/T 6435—2014,使用DGX-9243B-2電熱恒溫鼓風干燥箱進行測定;粗蛋白質含量參照GB/T 6432—2018,使用KDY-9820凱氏定氮儀測定; 賴氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量參照GB/T 18246—2019的常規酸水解法和氧化酸水解法,使用L-89001001A氨基酸自動分析儀測定;鈣含量參照GB/T 13885—2017,利用原子吸收光譜法使用AA300型原子吸收分光光度計測定;飼料磷含量參照GB/T 6437—2018,使用島津UV-2550紫外可見分光光度計測定。

1.5 飼養管理

試驗雞自由采食,自由飲水。每日08:30和14:30分別記錄雞舍溫度和濕度,試驗開始前3天保持雛雞生長溫度34 ℃,之后每周降溫2 ℃,直到平均溫度維持在(24±2) ℃,相對濕度保持在60%～70%。及時打掃,保證雞舍環境整潔,試驗過程中按常規的操作程序進行疫苗接種防疫,記錄防疫情況;試驗場地和雞舍清潔衛生,并進行正常消毒;試驗雞舍通風良好,并保持溫度穩定;飼料生產按標準進行,保證試驗雞生長環境良好,降低對試驗的干擾。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 生長性能

每周以重復為單位稱料重,以重復為單位計算1～21日齡、22～42日齡、1～42日齡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

ADG=(末重-初重)/(試驗雞數×試驗天數);ADFI=總采食量/(試驗雞數×試驗天數);F/G=ADFI/ADG。

1.6.2 血清生化、抗氧化指標

在21和42日齡,每組選取6只雞(每個重復選取1只雞)進行翼下靜脈采血3 mL,用采血軟管采集血液后45 °斜置,待血清析出后使用Eppendorf Centrifuge 5425離心機3 000 r/min離心10 min,收集血清于1.5 mL離心管中,標記好后于-20 ℃保存待測。血清生化指標分別按照試劑盒說明使用BCA微板法測定總蛋白含量,使用微量酶標法測定白蛋白含量和堿性磷酸酶活性,使用脲酶法測定尿素氮含量,使用酶比色法測定尿酸含量,使用ABTS自由基清除法測定總抗氧化力,使用5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法測谷胱甘肽過氧化物酶活性,使用羥胺法測定總超氧化物歧化酶活性,使用TBA硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量。試劑盒購自南京建成生物工程研究所,測定方法嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.6.3 腸道組織形態

在21和42日齡,每個重復選取1只接近平均體重肉雞進行屠宰,將雞處死后打開腹腔,迅速分離并取出腸段(十二指腸、空腸、回腸),分別剪取中1/3段的腸道組織2 cm左右,去除附著物并用生理鹽水沖洗干凈后,置于4%多聚甲醛溶液中固定。將固定好的腸道樣品經修塊、脫水、透明、浸蠟、包埋等處理后,切成約6 μm厚的切片,蘇木精-伊紅(HE)染色。采用Nicon NIS-Elements圖像分析系統,測定腸道絨毛高度和隱窩深度,并計算絨毛高度/隱窩深度(VCR)。

1.6.4 腸道微生物菌群組成

取5～8 cm十二指腸、空腸和回腸中1/3段,縱向剖開,使用載玻片刮取黏膜,迅速裝入凍存管,置于液氮中速凍后,存放于-80 ℃待測;分離盲腸,收集盲腸內容物置于凍存管中,使用液氮速凍后,存放于-80 ℃待測。

取0.3 g腸道內容物,選擇十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量,同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。以獲得的DNA為模板,使用引物5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’(341F)和5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’(805R)對微生物16S rRNA基因的V3～V4可變區域進行PCR擴增。擴增條件為:95 ℃預變性2 min,隨后進行35個循環反應(98 ℃下,變性40 s;54 ℃,退火30 s;72 ℃,延伸45 s),最后,72 ℃,延伸10 min。PCR擴增產物使用2%瓊脂糖凝膠進行檢測,并用AMPure XT beads回收試劑盒進行回收、純化。隨后對純化的產物進行定量、混合。最后使用NovaSeq 6000測序系統進行2×250 bp的雙端測序。

1.7 數據分析

試驗數據用Excel2019進行統計整理,用SAS 9.4統計軟件的ANOVA程序進行單因素方差分析,以Duncan氏法進行多重比較,最終結果用“平均值±標準差”表示。P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著,0.05≤P<0.10表示有提高或降低的趨勢。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌素對肉雞生長性能的影響

由表2可知,與對照組相比,乳酸菌素對肉雞生長性能無顯著影響(P>0.05)。

表2 乳酸菌素對肉雞生長性能的影響

2.2 乳酸菌素對肉雞血清生化指標的影響

由表3可知,與對照組相比,添加1%乳酸菌素極顯著降低21日齡肉雞血清中尿素氮含量(P<0.01)以及42日齡血清尿酸含量(P<0.01),添加2%乳酸菌極顯著降低21和42日齡肉雞血清尿酸含量(P<0.01)。

表3 乳酸菌素對肉雞血清生化指標的影響

2.3 乳酸菌素對肉雞血清抗氧化指標的影響

由表4可知,與對照組相比,飼糧中添加2%乳酸菌素可顯著或極顯著提高21(P<0.05)和42日齡(P<0.01)肉雞血清總抗氧化能力,顯著降低了42日齡肉雞血清丙二醛含量(P<0.05)。各組間的血清谷胱甘肽過氧化物酶和總超氧化物歧化酶活性的差異不顯著(P>0.05)。

表4 乳酸菌素對肉雞血清抗氧化指標的影響

2.4 乳酸菌素對肉雞腸道形態的影響

由表5可知,與對照組相比,飼糧中添加2%乳酸菌素極顯著提高21日齡肉雞十二指腸絨毛高度以及絨毛高度/隱窩深度(P<0.01),極顯著降低十二指腸和回腸隱窩深度(P<0.01);飼糧中添加1%乳酸菌素極顯著降低21日齡肉雞回腸隱窩深度(P<0.01),顯著提高回腸絨毛高度/隱窩深度(P<0.05)。

表5 乳酸菌素對21日齡肉雞腸道形態的影響

由表6可知,與對照組相比,飼糧中添加乳酸菌素(1%和2%)可極顯著降低42日齡肉雞十二指腸隱窩深度(P<0.01),極顯著提高十二指腸絨毛高度/隱窩深度(P<0.01)。

表6 乳酸菌素對42日齡肉雞腸道形態的影響

2.5 乳酸菌素對肉雞腸道微生物的影響

2.5.1 肉雞盲腸微生物的擴增子序列變異(ASV)數目比較分析

上機測序完成后,將原始數據RawData中的雙端數據進行拼接,并進行質控、嵌合體過濾,獲得CleanData。DADA2(Divisive Amplicon Denoising Algorithm)通過“去重復”等步驟,獲得單堿基精度的代表序列,然后使用ASV構建類操作分類單元(OTU)表,獲得ASV特征表以及特征序列。

由圖1可得,共得到6 840個ASV,對照組有3 268個ASV,1%乳酸菌素組有2 709個ASV,2%乳酸菌素組有2 629個ASV。

圖1 盲腸微生物的ASV數目

2.5.2 Alpha多樣性分析

乳酸菌素對肉雞盲腸微生物Alpha多樣性的影響見表7,各組Goods _coverage指數均為1.00,反映了本次測序結果可準確代表肉雞盲腸微生物的菌群情況。

表7 乳酸菌素對肉雞盲腸微生物Alpha多樣性指數的影響

對21日齡肉雞盲腸微生物Alpha多樣性指數進行分析可得:2%乳酸菌素組Observed_OTUs指數顯著高于1%乳酸菌素組及對照組(P<0.05),2%乳酸菌素組Chao1指數高于1%乳酸菌素組及對照組(0.05≤P<0.10);對42日齡肉雞盲腸微生物Alpha多樣性指數進行分析可得:各組間各指數無顯著差異(P>0.05)。

2.5.3 Beta多樣性分析

由圖2-A可知,21日齡肉雞Beta多樣性第1主成分的貢獻率為14.57%,第2主成分的貢獻率為11.90%,對照組和1%乳酸菌素組、2%乳酸菌素組間的樣本分散較遠,群落結構相似性可能有較大差異。

圖2 乳酸菌素對21(A)和42日齡(B)肉雞盲腸微生物Beta多樣性的影響

由圖2-B可知,42日齡肉雞Beta多樣性第1主成分的貢獻率為21.27%,第2主成分的貢獻率為13.70%,對照組和1%乳酸菌素組間的樣本分散較遠,群落結構相似性可能有較大差異,對照組和2%乳酸菌素組間的樣本分散較近,群落結構相似性差異較小。

2.5.4 菌群組成分析

在分類學水平上,肉雞盲腸中共檢測到41個門和678個屬。從41個門中選擇相對豐度排名前10的物種,生成門水平物種相對豐度柱形圖。由圖3-A可知,21日齡肉雞盲腸中,各組相對豐度均大于1%的物種為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota);42日齡肉雞盲腸中,各組相對豐度均大于1%的物種為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門(Proteobacteria)。從679個屬中選擇相對豐度排名前30的物種,生成屬水平物種相對豐度柱形圖。由圖3-B可知,21日齡肉雞盲腸中,各組相對豐度均大于1%的物種為未分類梭狀芽孢桿菌_UCG-014(Clostridia_UCG-014_unclassified)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、未分類梭狀芽孢桿菌vadinBB60群(Clostridia_vadinBB60_group_unclassified)、未分類毛螺菌科(Lachnospiraceae_unclassified)、另枝菌屬(Alistipes)、未分類瘤胃球菌科(Ruminococcaceae_unclassified)和分枝桿菌屬(Negativibacillus)。由表8可知,與對照組相比,在飼糧中添加2%乳酸菌素可顯著降低21日齡肉雞盲腸中糞桿菌屬相對豐度(P<0.05),極顯著增加UCG-005的相對豐度(P<0.01)。

圖3 乳酸菌素對肉雞盲腸微生物門水平(A)和屬水平(B)相對豐度的影響

表8 乳酸菌素對肉雞盲腸微生物屬水平相對豐度的影響

由圖3-B可知,42日齡肉雞盲腸中,各組相對豐度均大于1%的物種為未分類梭狀芽孢桿菌_UCG-014、糞桿菌屬、未分類梭狀芽孢桿菌vadinBB60群、未分類毛螺菌科、另枝菌屬、未分類瘤胃球菌科、分枝桿菌屬、擬桿菌屬(Bacteroides)和未分類厚壁菌門(Firmicutes_unclassified)。由表8可知,與其他組相比,在飼糧中添加1%乳酸菌素可極顯著增加真桿菌屬產糞甾醇真桿菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)的相對豐度(P<0.01)。

3 討 論

3.1 乳酸菌素對肉雞生長性能的影響

肉雞的生長性能與腸道健康密切相關,研究表明,細菌素可以通過增強腸道健康改善動物生長性能[9]。乳酸菌素是乳酸桿菌、乳酸球菌、鏈球菌等的代謝物,是乳酸菌在腸道發揮益生特性的關鍵成分之一[10],能夠改善畜禽生產性能。林滉等[11]、Kierończyk等[12]在肉雞飼糧中添加乳酸菌素改善了肉雞平均日增重和料重比。然而,本研究結果顯示,乳酸菌素對肉雞的生長性能無顯著影響。Fajardo等[13]在肉雞飼糧中添加乳酸菌及其細菌素發現肉雞生長性能并未改善。Such等[14]研究發現,飼糧中添加乳酸桿菌和丁酸梭菌并不會造成肉雞體重、采食量和飼料轉化率差異。這可能是由于白羽肉雞生長速度快、飼養周期短,且乳酸菌素進入機體主要作用靶點在腸道發揮免疫調節作用,因此對照組與試驗組肉雞生長性能的差異相對不顯著,應激或病理條件下乳酸菌素可能產生更好效果[15],其對生長性能的影響仍有待進一步研究。

3.2 乳酸菌素對肉雞血清生化指標的影響

血清生化指標能夠反映動物機體的物質代謝能力和相關生理機能[16]。其中,血清總蛋白主要由白蛋白和球蛋白組成,是反映機體肝臟合成功能的重要指標[17]。血清尿素氮是家禽蛋白質代謝的終產物,其含量能夠反映肉雞蛋白質和氨基酸之間的平衡,是衡量機體蛋白質沉積的重要指標之一,其含量越低,表明氨基酸平衡越好,機體蛋白質合成率較高[18]。尿酸是禽類嘌呤代謝的終末產物,血清尿酸含量升高會引發痛風?？偟鞍?、尿素氮以及尿酸的含量能夠反映機體對蛋白質的吸收狀況。管樂琪等[19]、黃勝男等[20]研究表明,飼糧中添加乳酸菌能夠降低肉雞血清尿素氮及尿酸含量。本研究中,與對照組相比,添加1%乳酸菌素能夠極顯著降低21日齡肉雞血清尿素氮含量,添加2%乳酸菌素能夠極顯著降低21和42日齡肉雞血清尿酸含量。與前人研究結果相似,說明在飼糧中添加乳酸菌素不影響肉雞的肝臟健康,可促進機體蛋白質代謝,有利于機體氨基酸平衡及肉雞健康。

3.3 乳酸菌素對肉雞血清抗氧化指標的影響

肉雞在正常代謝過程中會不斷地產生自由基,其產生與消除失衡會引起氧化應激,造成動物體內不可修復的氧化損傷,進而影響整個機體的功能[21],為了在進化過程中處理各種類型的自由基和氧化應激,機體形成天然的抗氧化系統以保護機體免受氧化應激[22]。血清抗氧化指標能夠反映機體抗氧化系統的水平,其中,總抗氧化力是抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平,是衡量機體抗氧化能力的綜合指標。丙二醛是自由基作用于脂質發生過氧化反應的終產物,可以反映機體脂質過氧化速率和強度,也能間接反映組織過氧化損傷程度,其含量越高表明脂質受到氧自由基攻擊的程度就越高[23]。本研究發現,飼糧中添加乳酸菌素能夠提高21和42日齡肉雞總抗氧化力,顯著降低丙二醛含量,與Xu等[24]、Cao等[25]研究結果一致,說明飼糧補充乳酸菌素有利于增強肉雞抗氧化性能。但乳酸菌素對抗氧化酶活性無顯著影響,這可能是由于在抗氧化體系中乳酸菌素對抗氧化酶系統和非酶抗氧化系統的影響存在差異,有待進一步研究。

3.4 乳酸菌素對肉雞腸道形態的影響

家禽小腸上皮結構是影響營養物質消化吸收的關鍵因素[26]。已被證明一些消化過程和所有吸收過程發生在腸絨毛和隱窩內或周圍,絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度是判斷小腸吸收能力的關鍵參數[27],絨毛高度/隱窩深度增大,腸道消化吸收能力提高。已有的研究表明,在飼糧中添加益生菌能夠通過改善腸黏膜的組織形態進而促進其營養的代謝利用[28]。本試驗結果顯示乳酸菌素可對肉雞腸道形態產生積極效果,可顯著提高21和42日齡肉雞腸道絨毛高度/隱窩深度,這與Cole等[29]、程鵬等[30]試驗結果一致。De Giani等[31]研究發現,乳酸菌素能通過表皮生長因子(EGFR)作用于腸道上皮細胞,從而增強了健康細胞的增殖活力,因此提高了小腸絨毛高度/隱窩深度。這證實了本試驗所用乳酸菌素能夠在腸道發揮益生功能,改善腸道物理屏障。

3.5 乳酸菌素對肉雞腸道微生物的影響

腸道微生物及其代謝產物(細菌素、有機酸、維生素等)參與宿主腸道組織免疫調節,乳酸菌屬是腸道益生菌的核心組[32]。本試驗結果表明,添加乳酸菌素能夠在屬水平上顯著降低21日齡肉雞盲腸中糞桿菌屬和未分類毛螺菌科相對豐度,顯著增加UCG-005的相對豐度,1%乳酸菌素可顯著增加42日齡肉雞盲腸真桿菌屬產糞甾醇真桿菌群的相對豐度。這4類菌屬與胃腸道中丁酸鹽的濃度密切相關[32-35],其豐度結果不一致原因可能與微生物之間互作有關,研究表明,腸道共生菌產生的細菌素在腸道中可通過抵御敏感菌來調節菌群的競爭性動態變化[36]。因此,飼糧中添加乳酸菌素引起腸道UCG-005的相對豐度增高,造成丁酸鹽產生旺盛,因此可能抑制了糞桿菌屬與毛螺菌科未分類屬的生長。

乳酸菌素作為乳酸菌益生特性的介導者,能夠增加有益菌的豐度促進丁酸鹽和短鏈脂肪酸的產生,這與O’Reilly等[37]、Xu等[38]研究結果一致。研究發現,丁酸鹽能夠通過抑制組蛋白去乙?；傅幕钚院痛龠M肌動蛋白結合蛋白突觸蛋白(SYNPO)的表達來改善腸道屏障完整性并加速細胞運動[39]。這一結果與腸道絨毛高度/隱窩深度所反映的結果相一致,乳酸菌素可能通過增加產丁酸鹽豐富的菌群豐度來改善腸道屏障的機制。進一步證明乳酸菌素通過調節腸道微生物菌群平衡及其代謝物,從而有利于維持肉雞腸道健康?？赡苁怯捎贏A肉雞生長快、飼養周期短,乳酸菌素進入機體主要在腸道發揮其效益從而有助于機體健康,其對生長性能的影響有待進一步研究。

4 結 論

飼糧中添加乳酸菌素可提高肉雞血清總抗氧化力,調節肉雞盲腸微生物菌群結構,尤其是提高了產丁酸鹽的菌屬相對豐度,如UCG-005和真桿菌屬產糞甾醇真桿菌群,提高小腸絨毛高度/隱窩深度,有利于肉雞對飼糧蛋白質的利用,進而維持機體健康。