用礦物元素指紋識別中華絨螯蟹產地及其養殖水體

宋學宏，黃芳，梁鳳玲，胡建國，陸彬，蔡春芳

（1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州市農產品質量安全監測中心，江蘇 蘇州 215104；3.蘇州市陽澄湖大閘蟹行業協會，江蘇 蘇州 215137）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，以下簡稱河蟹）是我國重要的淡水養殖對象，2020 年全國產量達77.6 萬t。江蘇是河蟹的主產區，養殖產量（35.9 萬t）接近全國產量的一半，形成了包括陽澄湖大閘蟹在內的多個知名品牌地理標志產品。河蟹以其特有的鮮甜滋味著稱，不同產地的河蟹滋味各有特色[1]。為了保護生產者、經營者和消費者的利益，許多品牌的河蟹都配有防偽標識，像陽澄湖大閘蟹還用不同顏色的防偽標識來區分養殖水體是陽澄湖湖區（藍色）還是周邊池塘（綠色）。盡管如此，市售河蟹魚目混珠現象仍較突出，大閘蟹被戲稱“大雜蟹”。開發河蟹產地及養殖水體識別技術對河蟹產業的健康發展意義重大。

水生動物具有富集礦物元素的特點[2,3]，不同水體中礦物元素的種類和含量差異明顯，這會影響到水生動物體內礦物元素指紋[4]。研究表明：用礦物元素指紋識別水生動物產地具有較高的準確率[5-8]。趙鑒等[9]、張政權等[10]報道元素指紋也可用于河蟹產地識別。但元素指紋可否用于同一地區不同養殖水體的河蟹的識別還鮮有研究。

水產養殖動物體內的礦物元素不僅可從養殖環境中富集，還來自人工飼料或餌料。在河蟹飼料中常添加充足的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn、Cu 等礦物元素[11,12]。此外，河蟹生產管理中還常投入硫酸銅、硫酸鋅等控制青苔與纖毛蟲的生長[13,14]，這可能干擾以礦物元素指紋為依據的產地識別，而以往基于元素指紋的河蟹產地判別技術研究中，都納入了上述部分元素[8-10]。剔除這些礦物元素對判別準確率的影響尚不清楚。

本研究通過比較江蘇境內不同產區及養殖水體的河蟹體內礦物元素含量的差異，驗證礦物元素指紋用于河蟹養殖產地和養殖水體識別的可行性，分析剔除了養殖中外源輸入量較大的礦物元素后對判別準確率的影響，為河蟹產地和養殖水體識別技術開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

2021 年10 月中旬,采集陽澄湖湖區（YCL）、陽澄湖周邊池塘（YCP）以及洪澤湖（HZL）、高郵湖（GYL）、固城湖（GCL）湖區出產的河蟹。根據湖泊的大小及陽澄湖流域池塘分布情況確定采樣位點數（表1）。鑒于河蟹對礦物元素的富集與性別不相關[15]且成蟹中雄蟹占比高，本研究僅以雄蟹為實驗材料。從每個位點采集10 只附肢齊全、體質健壯的雄蟹樣品，平均體質量如表1 所示。將采自同一位點的河蟹處死后合并粉碎，速凍，保存于-20 ℃冰箱備用。

表1 實驗用中華絨螯蟹樣品信息Tab.1 Sample information of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis for experiment

1.2 礦物元素分析

從冰箱中取出樣品，冷凍干燥，采用電感耦合等離子體質譜法（GB 5009.268）測定礦物元素。測定中，稱取樣品0.5 g（精確至0.001 g）于微波消解罐中，加入6 mL 硝酸（北京化學試劑研究所），先在石墨趕酸器（BHW-09C，海博通化學科技有限公司）上120 ℃預消解30 min，再采用微波消解儀（Mars6，美國CEM公司）進行消解。消解程序分3 步，每步升溫時間均為5 min，控制溫度分別為120 ℃、180 ℃、190 ℃，保溫時間分別為6 min、10 min、15 min。冷卻后取出，緩慢開蓋排氣，適當趕酸后，用超純水定容至10 mL，混勻，上機測定。所用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）為美國Thermo Fisher 公司產品（iCAPQ），儀器工作條件為：采用動能歧視消除模式（KED），射頻功率1 550 W，冷卻氣流速14 L/min，輔助氣流速0.8 L/min，霧化氣流速1.0 L/min，Q Cell 氣體（He）4.5 mL/min，駐留時間0.02 s，掃描次數100次，進樣時間45 s，蠕動泵轉速45 r/min。點燃等離子體后，儀器預熱30 min 至穩定，引入多元素混合調諧溶液調節ICP-MS 的各項參數，選擇低中高質量數元素調諧ICP-MS 的靈敏度，同時調節氧化物以及雙電荷等指標至滿足測定要求。通過三通在線引入內標溶液，依次測定標準曲線、空白溶液和樣品溶液。采用標準曲線定量法定量，使用扇貝生物成分分析標準物質作為全程質控樣（檢測結果均在允許誤差范圍內）。測定的元素有Ca、Mg、K、Na、Sr、Fe、Ba、Al、Ti、Mn、Zn、Cu、As、Cr、Ni、Se、V、Pb、Ce、Y、La、Co、Nd、Eu、Hg、Sb、Dy、Pr、Gd、Cd、Sm、Er、Yb、Lu 和Tm 共35 種，所用標樣均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.3 數據處理

5 組河蟹體內礦物元素含量采用平均值±標準差表示，所用統計軟件為SPSS19.0。采用單因子方差分析法對5 組河蟹體內礦物元素含量進行差異顯著性檢驗，差異顯著時（P＜0.05）進行鄧肯氏多重比較。采用Fisher 判別分析法進行產地和養殖水體識別，其中自變量采用Wilks’lambda 步進法引入。先以全部35 種所測礦物元素作為自變量進行判別分析，在自變量集內剔除Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn和Cu 共8 種人為輸入較大的礦物元素[11-14]同法運算，比較兩者判別準確率的差異。

2 結果與分析

2.1 不同來源河蟹體內礦物元素含量均值比較

由表2 可見，除了Al、Cr 和V 外，其他32 種礦物元素組間都存在顯著差異（P＜0.05）。其中，YCL 蟹的Ni 和Sb 顯著高于其他3 個湖產的河蟹（P＜0.05），且YCP 蟹中含量也較高，而Eu 和Lu含量顯著低于其他3 個湖產的河蟹（P＜0.05），且YCP 蟹中含量也較低。HZL 蟹的Sr 含量顯著高于其他各組（P＜0.05），其次是GYL 蟹。GCL 蟹中Eu、Hg、Dy、Er、Yb、Lu 和Tm 均顯著高于其他各組（P＜0.05，表2）。

表2 5 個來源的雄性中華絨螯蟹體內礦物元素含量(mg·kg-1)Tab.2 Contents of mineral elements in male Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins

2.2 基于礦物元素指紋的河蟹產地和養殖水體判別分析

以35 種礦物元素為自變量進行Fisher 判別分析，結果顯示：Ca、K、Sr、Al、Zn、Cu、As、Y、Co 和Lu這10 種元素進入了判別模型。上述元素可以有效區分不同來源的河蟹，其中HZL 和GYL、YCL 和YCP 出產的河蟹在領域圖上距離較近，其他3 個來源的河蟹距離較遠（圖1）。

圖1 基于35 種元素對5 個來源中華絨螯蟹進行判別分析的領域圖Fig.1 Canonical plot scores from discriminant analysis on Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 35 elements

對測試集樣本判別準確率達98.3%，交叉驗證正準確率98.3%（表3）。其中，對產自YCL、YCP、GYL 和GCL 的河蟹交叉驗證準確率是100.0%。對產自HZL 的河蟹判別準確率為88.9%，有11.1%被判入GYL。

表3 基于35 種元素對5 個來源中華絨螯蟹判別分析的準確率Tab.3 Accuracy of discriminant analysis of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 35 elements

剔除河蟹養殖過程中人為輸入量較高的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn 和Cu 8 種元素后，用余下的27 種元素再行判別分析，Sr、As、Pb、Y、Sb 和Lu 這6種元素進入判別分析模型，可區分不同來源的河蟹，且仍表現為HZL 和GYL、YCL 和YCP 出產的河蟹在圖上距離較近（圖2）。由表4 可見，對測試集樣本判別準確率為100.0%，交叉驗證總體準確率為96.7%。從誤判情況看，產自HZL 的河蟹有11.1%被判入GYL，產自GCL 的河蟹有11.1%被判入GYL。

圖2 基于27 種元素對5 個來源中華絨螯蟹判別分析的領域圖Fig.2 Canonical plot scores from discriminant analysis on Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 27 elements

表4 基于27 種元素對5 個來源中華絨螯蟹判別分析的準確率Tab.4 Accuracy of discriminant analysis of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 27 elements

3 討論

3.1 不同來源的河蟹體內礦物元素含量

不同水域環境影響養殖河蟹的礦物元素沉積。趙鑒等[9]以河蟹第三步足為材料比較了遼寧省盤錦、江蘇省洪澤湖、江蘇省興化、湖北省梁子湖產的河蟹體內Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr、Ba 和Ti 共12 種元素含量，發現不同產地河蟹間Na、Mg、Al、K、Mn、Fe、Cu、Sr、Ba 和Ti 含量差異達到極顯著水平（P＜0.01）。張政權等[10]分析了崇明、陽澄湖和興化3 個地區河蟹肌肉組織中K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu 和Fe 共8 種礦物元素的含量，發現所有元素均差異顯著（P＜0.05）。本研究檢測了5 個來源雄性河蟹全蟹樣本的35 種元素，結果表明，32 種元素差異達顯著水平（P＜0.05），與上述報道一致，表明不同產地河蟹體內礦物元素差異較大，可能與養殖水體內礦物元素差異有關[4]。

然而，本研究結果表明，同為陽澄湖地區，YCL出產的河蟹與YCP 出產的河蟹在24 種礦物元素上差異顯著（P＜0.05，表2），提示這些元素受生產方式的影響較大。究其原因，可能與蟹塘的水草有關：河蟹養殖水體均栽種大量水草，水草對底泥和水體中礦物元素的吸附能力較強[16,17]。在湖泊內，水在不斷流動，會使被水草吸收的礦物元素得到補充。而在池塘中，整個養殖周期中通常只是少量注水以補償蒸發，因此水體中部分礦物元素濃度會因水草吸附而下降，這會影響到河蟹對水體中礦物元素的直接富集。同時，在池塘半封閉環境中，水草光合作用導致水體pH 較高[18]，而高pH 環境影響底泥礦物元素釋放[19]以及水生植物對礦物元素的吸附[20]，這也會影響到河蟹對環境中礦物元素的富集。河蟹還會采食部分水草，水草對水體和底泥中的礦物元素富集效率越高，這些元素向河蟹體內轉移效率也會越高。而池塘和湖泊水深差異較大，水草生長速度不同，影響草體中礦物元素的濃度。所有這些因素可能導致了YCL 和YCP 出產的河蟹體內礦物元素含量差異較大（表2）。因此，使得用元素指紋來識別同一地區池塘和湖泊出產的河蟹成為可能。

在陽澄湖地區的河蟹中Ni 和Sb 含量較高，而Eu 和Lu 含量較低。HZL 蟹中Sr 含量較高，與HZL地理距離較近的GYL 蟹中含量其次。這是否具有普遍意義還有待確認，或可成為河蟹產地鑒別的輔助證據。同理，GCL 蟹中Eu、Hg、Dy、Er、Yb、Lu 和Tm 均顯著高于其他各組（P＜0.05，表2），也值得關注。

3.2 采用礦物元素指紋識別河蟹產地和養殖水體的可行性

礦物元素指紋已被應用于水產動物的溯源研究。郭利攀等[5]報道基于礦物元素指紋信息的產地判別技術可應用于近海3 個產地的4 種經濟魚類的產地判別。王紫曄等[6]發現，礦物元素可作為大西洋鮭（Salmo salar）的特征元素來表征其地理來源，而且基于礦物元素所建立的判別模型對大西洋鮭的整體及交叉驗證判別準確率均高達98.8%。楊健等[7]報道，用體內元素的積累特征進行大銀魚（Protosalanx hyalocranius）產地判別具有較高的準確性。趙鑒等[9]報告基于礦物元素對盤錦、洪澤湖、興化和梁子湖河蟹的判別準確率達100%。本研究結果表明，無論是否剔除養殖過程中人為輸入量較大的元素，識別準確率均較高，與上述報道一致，表明元素指紋可用于河蟹產地識別。

由圖1 和圖2 可見，在判別分析領域圖上YCL出產的河蟹和YCP 出產的河蟹距離最近，地理位置上較近的GYL和HZL出產的河蟹在領域圖上分布也相對較近，這從側面證明了元素指紋具有地域特點[21,22]，即河蟹體內元素指紋蘊含了產地信息。但這也決定了地理尺度較小時，判別準確率就會下降[8,23,24]。本研究中的河蟹均來自江蘇境內，地理尺度較小，但兩個模型中交叉驗證判別準確率分別達98.3%和96.7%。YCP 蟹采自距離YCL 3 km 內的池塘，盡管這樣，本研究2 個模型中YCP 和YCL 出產的河蟹判別準確率均達100%（表3，表4），表明元素指紋不僅可用于小尺度領域內河蟹產地的識別，對同一地區池塘和湖泊養殖的河蟹也能有效識別。

3.3 剔除養殖過程中人為輸入量大的元素對河蟹來源識別的影響

河蟹飼料中常添加大量的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn 和Cu 等元素[11,12]，蟹塘水草管理和病害防控過程中還會輸入銅和鋅[13,14]，這可能會影響河蟹體內這些元素的含量。本研究結果表明，用全部35 種元素對5 個來源的河蟹進行判別時，11.1%的HZL出產的河蟹被判入了地理距離較近的GYL，其他產地的河蟹判別準確率均為100%（表3），暗示人為輸入的礦物元素對判別準確率影響較小。剔除這8 種元素后的判別分析結果顯示，除了仍有11.1%的HZL 出產的河蟹被判入GYL 外，還有11.1%的GCL出產的河蟹被判入地理距離較遠的GYL，導致交叉驗證準確率從98.3%降為96.7%（表4）。其原因可能是河蟹體內Ca、K、Cu、Zn 等元素受產地水土中含量的影響更大。判別模型能自動剔除不適用的變量，元素越多，變量篩選的余地越大，判別準確率也會越高。因此，在以元素指紋作為產地判別依據時，應盡可能增加檢測元素的種類。

3.4 結論

可用礦物元素指紋識別河蟹產地和養殖水體。河蟹養殖過程中人為輸入量較大的元素對產地和養殖方式識別準確率無負面影響。

致謝：蘇州大學食品質量與安全專業2018 級汪旻卿、張禧騰、許戊江、張思宇等同學參與了部分研究工作，在此表示感謝！