春季桑溝灣硅藻群落結構對硅酸鹽加富的響應研究

張凱，姜娓娓，萬東杰，高亞平，張義濤，蔣增杰

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室，山東 青島 266071；3.榮成楮島水產有限公司，山東 榮成 264312）

硅藻光合作用速率和有機物生產速率可與高等陸生植物相媲美，是重要的初級生產者[1，2]和生物硅的主要生產者，介導海洋生態系統中的硅循環，產生了巨大的礦質資源，形成了重要的海洋碳匯[3]。單細胞藻類是養殖雙殼貝類幼蟲和稚貝的最佳餌料[4]，而硅藻是浮游植物中最主要的類群，約占沿海浮游植物物種豐富度的75%。硅藻富含二十碳五烯酸（EPA）與二十二碳六烯酸（DHA）等長鏈多不飽和脂肪酸[5]。BROWN 等[6]在分析雙殼貝類幼體發育所需的多不飽和脂肪酸的含量時發現，硅藻的多不飽和脂肪酸含量較其他藻類占優勢。因此，硅藻為濾食性貝類最重要的天然餌料之一。

硅酸鹽是硅藻類浮游植物生長發育不可或缺的營養元素[7]。硅酸鹽是構成硅藻硅質細胞壁的主要成分，參與生物體蛋白質合成、細胞分裂等多個生長和代謝過程。但研究表明，我國的一些典型養殖海域在春季普遍缺乏硅酸鹽，例如在乳山灣西側海域，硅酸鹽濃度的變化為：秋季＞夏季＞冬季＞春季，春季硅酸鹽濃度較低[8]；在膠州灣，春季和冬季也存在著硅酸鹽限制的現象[9]。桑溝灣是我國北方典型的貝類規?；B殖海灣，養殖長牡蠣（Crassostrea gigas）和櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的年產量達60 000 t 和15 000 t[10,11]。歷史資料表明，桑溝灣未產生硅限制的季節為夏季，其硅酸鹽濃度變化范圍為2.20～16.34 μmol/L[28-30]，產生硅限制的季節為：①秋季，其硅酸鹽濃度變化范圍為0～13.28 μmol/L[25,28-30]，但大部分調查站位的硅酸鹽濃度高于絕對閾值，只有少部分調查站位的硅酸鹽濃度低于絕對閾值；②冬季，其硅酸鹽濃度變化范圍為0～24.44 μmol/L[25,28-30]，冬季硅酸鹽濃度平均值遠高于絕對閾值2 μmol/L；③春季，其硅酸鹽濃度變化范圍為0～1.82 μmol/L，低于絕對閾值2 μmol/L，存在硅酸鹽限制現象，硅酸鹽濃度可能已經成為桑溝灣春季影響浮游植物生長的主要限制因子之一[12,24,25,28-30]。

春季是濾食性貝類等養殖生物的快速生長期，此時若養殖海域發生硅酸鹽限制，將會影響養殖海域硅藻類浮游植物的生長[27]，進而影響以浮游植物為食的養殖生物生長[9,13]。本研究采用現場陸基圍隔實驗法，探討和分析春季添加不同濃度硅酸鹽對桑溝灣原位海水中浮游植物豐度（以葉綠素a 濃度表征）、粒徑結構以及群落結構等影響，以期為探索養殖水域關鍵時段補充硅元素策略，提升浮游植物初級生產力和貝類養殖容量提供基礎數據和參考。

1 材料與方法

1.1 方法

2021 年5 月12—19 日在山東榮成桑溝灣楮島碼頭建成長200 cm、寬160 cm、高120 cm，容積約3 800 L 的長方體陸基圍隔。圍隔由外周鐵框架、不透水帆布的圍隔幔和實驗單元組成。進水口位于圍隔幔底部，出水口位于圍隔幔上層，略低于水面，圍隔內海水溫度與自然海水溫度一致。每個實驗單元由上層開口、體積為100 L 的直筒型透明聚乙烯袋制成，開口處以方形PVC 塑料管保持形狀，用麻繩將其固定后懸掛在圍隔內水面以上10 cm 處（圖1）。實驗設3 個處理組，每組三個平行：①自然海水組（對照組）1.41 μmol/L SiO3-Si；②低濃度組（LS 組）20.00 μmol/L SiO3-Si；③高濃度組（HS 組）100.00 μmol/L SiO3-Si；泵取桑溝灣近岸表層海水70 L，經200 μm 篩絹過濾后注入實驗單元。實驗單元內的水體不與外部水體交換，每個實驗單元中均配置2 W的小型抽水泵，保持海水始終處于混勻狀態，添加的硅酸鹽為九水硅酸鈉（分析純）。實驗持續時間7 d，分別于第0 d、1 d、3 d、5 d、7 d 取樣，每天8：00、12：00 和17：00 測定溫度、光照強度等環境因子。

圖1 圍隔實驗示意圖Fig.1 Schematic diagram of the enclosures used in the experiment

樣品采集前，緩慢攪拌實驗單元內的水體，保證采集樣品的均勻性。利用YSI（ProODO）型多參數水質分析儀（YSI 公司，美國）進行現場測定溫度、光照強度等環境因子。

葉綠素a 采用分光光度法測定，先后使用20 μm 篩絹、2 μm、0.45 μm 醋酸纖維濾膜現場過濾海水1 L，分別用于表征小型浮游植物（粒徑20～200 μm），微型浮游植物（粒徑2～20 μm），微微型浮游植物（粒徑0.45～2.00 μm）葉綠素a 濃度，濾膜于-20 ℃避光冷凍保存，測定方法參考GB 17378.7-2007；濾液加入三氯甲烷固定后，-20 ℃冷凍保存。水樣在實驗室由德國Seal QUAATRO 營養鹽自動分析儀測定，測定方法參考GB 17378.4-2007。

浮游植物細胞豐度的測定方法是：取1 L 海水樣品加入10 mL 魯哥氏液固定保存，采集方法參照《海洋調查規范—海洋生物調查》（GB/T 12763-2007），用顯微鏡（OLYMPUS BX51）分類鑒定浮游植物，統計數量。浮游植物多樣性指數、物種均勻度和物種豐富度指數采用以下公式計算[26]：

物種多樣性指數采用香農-威爾多樣性指數（H′,Shannon-Weaver index）:

物種均勻度采用Pielou 指數（J）:

物種豐富度指數采用Margalef 指數（d）:

式中，N 為某個樣品中所有物種的總個體數；Pi為某個樣品中第i 種的個體數與該樣品個體數的比值；S 為某個樣品中的總物種數；Ni為所有樣品中第i 種的總個體數。

1.2 數據統計

數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示，采用Graphpad prism 7.0 軟件處理數據，繪制圖表。不同處理組間的數據差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）及Tukey 多重比較處理。圖中“*”表示與對照組間存在顯著差異（P＜0.05），“**”表示與對照組間存在極顯著差異（P ＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 實驗期間水體理化環境因素變化特征

實驗期間，水溫變化在13.83～16.96 ℃之間，各組間無顯著性差異（P＞0.05，圖2-A）。受陰雨天氣影響，第0～3 d 光照強度從981.30 μmol/m2/s 降到252.20 μmol/m2/s，隨后有所回升，在第7 d 時因陰雨降到221.10 μmol/m2/s；各實驗組間光照強度無顯著性差異（P＞0.05，圖2-B）。

圖2 實驗圍隔水體環境參數變化特征Fig.2 Variations in environmental parameters in the experimental land-based enclosure

浮游植物對營養鹽的吸收使各圍隔內營養鹽濃度逐漸降低（圖3）。對照組在第0 d 時硅酸鹽濃度為1.41 μmol/L（低于閾值2 μmol/L），總溶解態無機氮濃度為5.60 μmol/L，磷酸鹽濃度為0.36 μmol/L，硅氮比為0.25，小于1；硅磷比為3.92，小于10，對照組處于硅限制狀態（圖3-A、B、F）。至第7 d 時，浮游植物的快速生長導致磷酸鹽快速消耗，并低于閾值0.03 μmol/L（圖3-F）?？側芙鈶B無機氮（包括硝酸鹽、亞硝酸鹽和氨氮）濃度隨時間推移逐漸降低，至實驗結束，各實驗組內總溶解態無機氮濃度均高于1 μmol/L，第5 d、7 d 時LS 和HS 組顯著低于對照組（P＜0.01，圖3-B）。氨氮濃度隨時間推移逐漸降低，但LS 組和HS 組的氨氮濃度與對照組之間無顯著性差異（P＞0.05，圖3-C）。從第3 d 開始，LS 組和HS 組的硝酸鹽濃度低于對照組，從第5 d 開始顯著低于對照組（P＜0.01），至實驗結束，硝酸鹽濃度從高到低依次為：對照組、LS 組、HS 組（圖3-D）。亞硝酸鹽濃度從第1 d 開始HS 組顯著高于對照組（P＜0.01），LS 組雖高于對照組，但兩者之間無顯著性差異（P＞0.05，圖3-E）。

圖3 圍隔實驗水體溶解態營養鹽濃度變化Fig.3 Variation in dissolved nutrient concentration in the seawater in the experimental land-based enclosure

2.2 硅酸鹽加富對浮游植物粒徑結構的影響

實驗結果顯示，葉綠素a 濃度范圍為1.83～4.40 μg/L，第7 d 時LS 組濃度最高；實驗期間，從第5 d 開始，LS 組和HS 組極顯著高于對照組（P＜0.01），第7 d 時，LS 組和HS 組葉綠素a 濃度分別是對照組的1.95 倍和1.94 倍。隨著實驗進行，對照組硅酸鹽濃度低于絕對閾值并不斷降低，影響浮游植物的生長，導致浮游植物細胞的沉降速率大于浮游植物的繁殖速率，因此，在第7 d 時對照組浮游植物葉綠素a 濃度與第5 d 相比有所下降（圖4-A）。LS 組自第3 d 小型浮游植物葉綠素a 濃度開始顯著高于對照組，HS 組自第5 d 開始顯著高于對照組（P＜0.01，圖4-B）。HS 組微型浮游植物葉綠素a 濃度從第1 d 開始顯著高于對照組（P＜0.01），第7 d 時，LS 組與HS 組極顯著高于對照組（P＜0.01），LS 組葉綠素a 濃度是對照組的2.34 倍，HS 組是對照組的7.50 倍，且HS 組葉綠素a 濃度是LS 組葉綠素a 濃度的3.21 倍（圖4-C）。微微型浮游植物除第3 d 外，其他時間的葉綠素a 濃度各實驗單元之間無顯著差異（P＞0.05，圖4-D）。

圖4 圍隔實驗水體不同粒徑浮游植物葉綠素a 濃度變化Fig.4 Variation in chlorophyll a concentration of phytoplankton with different size particles in the seawater of the experimental enclosures

2.3 硅酸鹽加富對浮游植物群落結構的影響

桑溝灣春季原位海水（取自第0 d 的對照組）中的浮游植物主要由硅藻、甲藻、綠藻組成，共計44種，其中硅藻34 種，甲藻9 種，綠藻1 種（表1）。浮游植物種類組成以硅藻占優勢，約占物種豐富度的77.27%，其次是甲藻，硅藻門中小新月菱形藻、小環藻等硅藻細胞豐度較高。

表1 桑溝灣春季原位海水浮游植物物種組成及細胞豐度Tab.1 In situ seawater phytoplankton species composition and cell abundance in Sanggou Bay

實驗期間，硅藻細胞豐度變化范圍為0.96×103～1.62×103cells/L。第7 d 時HS 組的硅藻細胞豐度最高。從第1 d 開始，HS 組硅藻細胞豐度顯著高于對照組，從第3 d 開始，LS 組硅藻細胞豐度顯著高于對照組（P＜0.05）；至實驗結束，LS 組和HS 組的硅藻細胞豐度分別比對照組增加了53.53%和69.77%（圖5-A）。

圖5 實驗圍隔水體硅藻細胞豐度變化特征Fig.5 Characteristics of diatom cell abundance changes in the seawater of the experimental enclosures

硅酸鹽加富對小新月菱形藻、小環藻、圓海鏈藻等硅藻的促生長效果明顯（圖5-B、C、D）。小新月菱形藻細胞豐度增加顯著，其豐度變化范圍為0.07×103～0.39×103cells/L；實驗期間HS 組顯著高于對照組（P＜0.05），與對照組藻細胞豐度相比平均增加181.69%（圖5-B）。從第1 d 開始，HS 組小環藻細胞豐度顯著高于對照組，從第5 d 開始，LS 組硅藻細胞豐度顯著高于對照組（P＜0.05）；至實驗結束，LS 組和HS 組的小環藻細胞豐度分別比對照組增加了200.00%和228.54%（圖5-C）。實驗初期，圓海鏈藻的細胞豐度較低，為0.04×103cells/L，實驗期間，與對照組相比，LS 組和HS 組藻細胞豐度增加明顯，至實驗結束，LS 組和HS 組的圓海鏈藻細胞豐度分別為0.16×103cells/L 和0.19×103cells/L，分別比對照組增加了174.87%和224.79%（圖5-D）。

各實驗組間不同浮游植物物種多樣性指數變化不大，無顯著性差異（P＞0.05，圖6-A）。各實驗組的均勻度無顯著性差異（P＞0.05，圖6-B）。LS組和HS 組物種豐富度指數與對照組間差異性顯著（P＜0.05，圖6-C），從第1 d 開始，HS 組豐富度指數顯著高于對照組；從第5 d 開始，LS 組豐富度指數顯著高于對照組。

圖6 圍隔實驗多樣性指數、均勻度與豐富度指數Fig.6 Diversity index,evenness index and enrichment index of phytoplankton in the seawater of the experimental enclosures

3 討論

硅藻是沿海浮游植物的主要類群，目前已知種類超過20 000 種，約占沿海浮游植物物種豐富度的75%，貢獻了約20%的全球初級生產力[1,17]。實驗期間，硅藻細胞豐度變化范圍為0.96×103～1.62×103cells/L，與劉萍、侯興等關于桑溝灣春季浮游植物細胞豐度的研究結果一致[18，19]。春末桑溝灣硅藻等浮游植物細胞豐度較低的原因除了溫度影響以外，可能由于硅酸鹽的限制，影響近海浮游植物類群主要優勢種硅藻的生長[12]和春季濾食性貝類快速生長，攝食活動的增強影響桑溝灣貝類養殖區的浮游植物細胞豐度。

本研究中，LS 組和HS 組的硅藻細胞豐度比對照組分別增加了53.53%和69.77%，表明硅酸鹽加富可顯著促進桑溝灣春季硅藻類浮游植物的生長，而硅藻細胞豐度的增加勢必會對海水營養鹽的結構產生影響。已有研究發現，藻類健康生長及生理平衡所需的氮磷硅原子比率為16∶1∶16，高DIN或者高DIN/P 有利于甲藻生長,而低DIN/Si 或者高硅酸鹽含量有利于硅藻在與甲藻的競爭中占據優勢[21]。實驗中，人為硅酸鹽添加增加DIN/Si 和硅酸鹽濃度有利于硅藻在與甲藻的競爭中占據優勢，但同時，根據Redfield 規律，任何一種營養鹽加富，都可能導致其他營養鹽濃度降低。因此，需注意磷酸鹽等其他營養鹽濃度的變化，避免春季添加硅酸鹽的同時，產生其他營養鹽限制浮游植物生長的現象。

外源物質的添加對浮游植物群落結構的影響可從兩方面評判。一方面，添加硅酸鹽并未影響2021 年桑溝灣春季近海浮游植物群落結構優勢種組成的變化，可顯著促進小新月菱形藻、小環藻、圓海鏈藻等優勢種的生長，尤其是小新月菱形藻，藻細胞豐度比對照組增加了181.69%。小新月菱形藻等硅藻繁殖速度快，細胞內富含多不飽和脂肪酸，是水產經濟動物良好的生物餌料[20]。因此，添加硅酸鹽對小新月菱形藻等硅藻的促生長作用可為貝類提供更多優質的天然餌料。

另一方面，本研究中至實驗結束，LS 組和HS組小型浮游植物的葉綠素a 濃度比對照組分別提升了95.66%和52.90%，第7 d 時LS 組和HS 組微型浮游植物葉綠素a 濃度分別是對照組的2.34 倍和7.50 倍。這表明硅酸鹽加富可顯著提高小型浮游植物和微型浮游植物的生物量；而硅鹽加富并未影響微微型浮游植物的生長，各圍隔單元之間葉綠素a 濃度無顯著性差異（P＞0.05）。RIISGARD[14]、CRANFORD[15]和李鳳雪等[16]的研究表明，濾食性貝類的截留效率與食物粒徑大小密切相關。濾食性貝類如長牡蠣能夠有效截留50%以上粒徑大于3 μm的顆粒、100%截留粒徑大于7 μm 的顆粒物。本研究中通過硅酸鹽加富所提高的小型浮游植物和微型浮游植物粒徑正處于濾食性貝類的最佳攝食粒徑范圍內，這或許可以提高春季濾食性貝類對顆粒物的截留效率，提高貝類的生長速率。

營養鹽的含量和結構對浮游植物群落結構和初級生產力水平具有重要影響。營養鹽缺乏會限制浮游植物的生長和繁殖，過高或結構失衡則會影響浮游植物群落結構穩定，甚至會引發赤潮等災害[22,23]?；诖?，后續開展不同硅酸鹽加富對硅藻優勢種擴培的影響研究，尋求硅元素補充的合適濃度，并尋求向自然海域補充硅元素的硅酸鹽的合適替代物，以期在保證生態安全、維持營養鹽結構動態平衡和生態系統平衡的條件下，為后續探索養殖水域關鍵時段硅元素補充策略、研發浮游植物初級生產力提升技術，進而提高貝類養殖容量的可能性提供基礎數據和有價值的參考。