辛硫磷對羅氏沼蝦的毒性效應研究

紀鵬，許文靜，敖士齊，吳聰聰，張曉君，高曉建，姜群

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

隨著現代農業的發展，使用農藥已成為農業生產必不可少的環節，全球每年約消耗200 萬噸的農藥，其中大部分是有機磷農藥[1,2]。辛硫磷是一種典型的有機磷農藥，具有廣譜高效和對哺乳動物低毒等特點[3]，廣泛應用于農業生產中鱗翅目害蟲的防治。近年來，農業生產中濫用辛硫磷導致了嚴重的環境殘留問題。據報道，山西某農場土壤中辛硫磷含量達89.9 μg/L[4]。土壤中殘留的辛硫磷可通過淋濾、滲透等方式匯聚到水體中，污染水體。例如墨西哥西北部某農場長期使用辛硫磷，導致周圍水域辛硫磷含量達2.4 μg/L[5]；我國珠三角河網水環境中辛硫磷含量最高為344.94 ng/L[6]，嚴重影響水生生物[7]。除在農業生產中廣泛應用，辛硫磷也被用于防治水產動物寄生蟲病害以及魚類敗血癥[8]。有報道發現，辛硫磷可導致水生動物發生行為障礙、氧化應激損傷、肝胰腺功能障礙、神經系統及免疫系統損傷等[9]。例如，辛硫磷可引起巖原鯉（Procypris rabaudi）谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-pX）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性下降，削弱抗氧化能力[10]；造成鯽（Carassius auratus）乙酰膽堿酶（Acetylcholinease,AChE）活性降低，抑制神經系統信號傳導[11]，并抑制鯽的色素酶450（Cytochrome P450，CYP450）活性[12,13]。目前，辛硫磷對水產動物的毒害作用研究主要集中在魚類[14,15]，甲殼動物相關研究較少，辛硫磷對甲殼動物的影響仍需探究。

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）主要分布于亞洲地區，生長速度快、體型大、耐鹽性好、與其他魚類相容性強，是淡水養殖主要經濟蝦類之一。本試驗研究了辛硫磷對羅氏沼蝦的急性毒性，并將羅氏沼蝦暴露于濃度低于96 h LC50的辛硫磷4 d，之后轉移至清水養殖7 d，分析辛硫磷暴露對羅氏沼蝦的氧化防御、免疫、神經功能和組織病理損傷及可逆性，旨在探究辛硫磷對羅氏沼蝦的潛在危害，并為辛硫磷對甲殼動物風險評估體系的建立提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用羅氏沼蝦取自江蘇揚州富源水產有限公司，體質健康，平均體質量為（1.2±0.2）g，在100 L水體中適應一周。期間每日投喂兩次商品飼料，水溫（21.0±0.5）℃，pH 約7.0，養殖水體定期更換。

試驗用辛硫磷購自艾森公司，有效濃度為40%。適應期后，開展預試驗，確定急性毒性試驗的最佳試驗濃度范圍。

1.2 方法

將羅氏沼蝦暴露于按照等比間距選擇的6 種辛硫磷濃度：3.125 μg/L、6.25 μg/L、12.5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L 水體中，以不添加辛硫磷的清水作為對照組，每組30 尾羅氏沼蝦，每個濃度設3個平行，采用半靜水試驗法進行96 h 急性毒性試驗，試驗水體為30 L。每日觀察試驗蝦活動與死亡狀況，以羅氏沼蝦僵直沉底且對外界刺激無反應確定為死亡特征。記錄死亡數和死亡時間，按Bliss 統計法計算各時間的半數致死濃度（LC50）。

為進一步探究辛硫磷對羅氏沼蝦的毒性及損傷的可逆性，將羅氏沼蝦暴露于1/3 96 h LC50濃度的辛硫磷水體中飼養4 d 后，轉至清水中飼養7 d，每天更換1/2 水體，試驗組與對照組均設置3 個平行，每組40 尾羅氏沼蝦。在第0 d、4 d、11 d 隨機取3尾羅氏沼蝦，解剖獲得肝胰腺、鰓和腸道組織，置于Bouin’s 試液固定，用于組織病理學觀察；在第0 d、1 d、2 d、4 d、11 d 隨機取5 尾羅氏沼蝦，解剖獲得肝胰腺和肌肉組織，置于液氮中快速冷凍，-80 ℃保存，用于酶活和基因表達測定。

組織病理學觀察：將試驗開始后第0 d、4 d、11 d 在Bouin’s 溶液固定24 h 的肝胰腺、鰓、腸道組織樣本放入75%的乙醇脫水低溫保存。通過組織包埋、切片后，用蘇木精—伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察及拍攝主要病理變化。

酶活的測定：將凍存的肝胰腺和肌肉組織按比例加入生理鹽水勻漿，4 ℃3 000 r/min 離心取上清液，采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測肝胰腺中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和過氧化物（Hydrogenperoxide,H2O2）的含量，檢測SOD、GSH-pX、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase,GOT）、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase,GPT）和肌肉中的AChE 活性。

免疫相關基因表達測定：取試驗第0 d、1 d、2 d、4 d、11 d 的肝胰腺樣品，TRIzol 法提取總RNA，通過微型分光光度計和瓊脂糖電泳檢測總RNA 的純度和完整性。按照PrimeScriptTMRT 反轉錄試劑盒說明書具體步驟，將RNA 反轉錄成cDNA，反轉錄后得到的cDNA 于-20 ℃保存。使用Primer 6 軟件設計羅氏沼蝦免疫基因引物。引物信息見表1，以β-actin 和ef1α 管家基因作為內參。本試驗選取抗脂多糖因子alf 基因、熱休克蛋白hsp 基因、血藍蛋白hemocyanin 基因和酚氧化酶原proPO 基因四個免疫基因，按照GreenTMPremix Ex TaqTMII 試劑盒（南京諾唯贊生物）的步驟，進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR），檢測不同時間點肝胰腺組織中免疫相關基因的表達量。

表1 熒光定量PCR 試驗所用引物序列Tab.1 Sequence of the primers used in qRT-PCR in this experiment

1.3 數據處理

采用Excel 2010 軟件對羅氏沼蝦的24 h、48 h、72 h、96 h 的死亡數據進行統計分析，利用Bliss 方法計算得到LC50。采用SPSS 20.0 軟件對實驗得出的酶活數據及定量數據進行單因素方差（ANOVA）分析，通過SNK（Student-Newman-Keuls）q 檢驗方法進行多重比較，采用GraphPad Prism 8.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 辛硫磷對羅氏沼蝦的急性毒性

在急性毒性試驗中，對照組羅氏沼蝦均存活，試驗組羅氏沼蝦呈現不同程度的活力下降和死亡情況。暴露初期游動異常迅速，短暫興奮后游動遲緩，活力衰減。死亡多集中在暴露試驗的第1～2 d，死亡率隨辛硫磷濃度增加而升高。根據統計的死亡個體數據和Bliss 方法計算，辛硫磷對羅氏沼蝦的24 h、48 h、72 h、96 h LC50分別是16.83 μg/L、10.64 μg/L、8.57 μg/L和6.98 μg/L。根據國家《水與廢水監測分析方法》判定辛硫磷對羅氏沼蝦劇毒[14]。

2.2 辛硫磷對羅氏沼蝦的組織病理損傷

對照組羅氏沼蝦肝胰腺中肝小管排布緊密，管內間隙分明，具有大小不一的轉運泡，組織未見明顯異常（圖1-a）。與對照組相比，辛硫磷暴露4 d 的肝胰腺組織肝小管緊密排布，管內間隙消失，轉運泡消失（圖1-b）。清水養殖7 d 后肝胰腺組織管內空隙部分恢復，肝小管排布緊密，轉運泡結構未恢復（圖1-c）。未經辛硫磷處理的對照組鰓組織結構如圖1-d 所示，鰓絲和鰓絲基部結構分明，無明顯異常，辛硫磷暴露4 d 的鰓組織鰓絲基部出現空泡（圖1-e）。清水養殖7 d 后鰓絲基部空泡消失（圖1-f）。對照組腸道組織腸道結構分明，腸道黏膜層上皮細胞排列緊密，腸道絨毛分明，肌層分界明顯，未出現異?，F象（圖1-g）。辛硫磷暴露4 d 的腸道腸絨毛結構消失，黏膜層細胞脫落（圖1-h）。清水養殖7d 后腸道絨毛結構恢復，但上皮細胞缺失嚴重，排布稀疏（圖1-i）。

圖1 辛硫磷對羅氏沼蝦肝胰腺、鰓、腸的組織病理損傷Fig.1 Histopathological injury of the hepatopancreas,gill,and intestinal tissues of giant river prawn M.rosebergii exposed to phoxim

2.3 肝胰腺功能損傷

與對照組相比，辛硫磷暴露后羅氏沼蝦肝胰腺組織GOT 和GPT 活性均顯著降低。GPT 活性在第2 d 達到最低點，第4 d 時顯著上升（P＜0.05），清水恢復后GPT 活性略有上升，與第1 d、2 d、4 d 時存在顯著差異，但仍顯著低于對照組水平（P＜0.05）；GOT 活性在第1-4 d 期間顯著降低，清水恢復后GOT 活性顯著上升，與第1 d、2 d、4 d 存在顯著差異（P＜0.05），但仍顯著低于對照組水平（圖2）。

圖2 辛硫磷對肝胰腺GOT 和GPT 活性的影響Fig.2 Changes in the activities of GOT and GPT in hepatopancreas tissues of giant river prawn M.rosenbergii exposed to phoxim

2.4 氧化應激功能損傷

如圖3-a 和3-b 所示，與對照組相比，辛硫磷處理可導致羅氏沼蝦肝胰腺組織MDA 和H2O2的大量累積，MDA 含量在辛硫磷暴露第4 d 達到峰值，與第1 d、2 d 無顯著差異（P＞0.05），而H2O2含量在暴露第1 d 即達最高水平，第4 d 后含量顯著降低，仍顯著高于對照組水平（P＜0.05）；經過清水養殖7 d 后，MDA 和H2O2含量均下降至對照組水平，MDA含量與第1 d、2 d、4 d 存在極顯著差異（P＜0.05），H202含量與第1 d、2 d 存在極顯著差異，與第4 d 存在顯著差異（P＜0.05）。圖3-c 和3-d 所示，辛硫磷暴露第1 d 羅氏沼蝦SOD 和GSH-pX 的活性即下降，與對照組差異顯著，4 d 的暴露試驗周期內，SOD 和GSH-pX 的活性一直處于較低水平，期間無顯著差異（P＞0.05），清水恢復7 d 后二者活性上升，與第1 d、2 d、4 d 相比，SOD 和GSH-pX 活性均存在顯著差異，SOD 活性恢復至對照組水平，GSH-pX 活性仍顯著低于對照組水平。

圖3 辛硫磷對羅氏沼蝦肝胰腺MDA 和H2O2 含量及SOD和GSH-pX 活性的影響Fig.3 Alterations in H2O2 and MDA levels and the activity of GSH-Px and SOD in hepatopancreas tissues of giant river prawn M.rosenbergii exposed to phoxim

2.5 神經系統損傷

與對照組相比，辛硫磷暴露后第2 d AChE 的活性顯著下降，第4 d 略有上升，與第2 d 無明顯差異（P＞0.05），清水恢復后，與第1 d、2 d、4 d 相比，AChE 活性顯著上升，但仍顯著低于對照組水平（P＜0.05，圖4）。

圖4 辛硫磷對羅氏沼蝦肌肉AChE 活性的影響Fig.4 Changes in the activity of AChE in muscle tissues of giant river prawn M.rosenbergii exposed to phoxim

2.6 免疫系統損傷

與對照組相比，辛硫磷處理抑制了羅氏沼蝦肝胰腺組織4 個免疫基因的表達，proPO 基因和alf 基因的表達量在第1-4 d 顯著下降，與對照組有顯著差異（P＜0.05），hsp 基因和hemocyanin 基因表達量呈下降趨勢，第2 d 表達量顯著下降（P＜0.05），第4 d 略有上升，與對照組有顯著差異（圖5）。經過清水養殖7 d 后，hemocyanin 基因和proPO 基因的表達量，與第1 d、2 d、4 d 相比均存在極顯著差異（P＜0.01），與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），alf 基因和hsp 基因表達量未恢復對照組水平，與辛硫磷暴露后的第1 d、2 d、4 d 相比，alf 基因存在顯著差異（P＜0.05），hsp 基因表達量存在極顯著差異（P＜0.01），與對照組存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖5 辛硫磷對肝胰腺組織免疫相關基因mRNA 表達的影響Fig.5 The effect of phoxim on the relative mRNA expression of immune-related genes in hepatopancreas tissues of giant river prawn M.rosenbergii.

3 討論

頻繁過量使用的辛硫磷可通過淋濾等作用進入水環境[16-19]，導致水體中辛硫磷的富集。辛硫磷在水產養殖寄生蟲病害和魚類敗血癥防治中的應用，也加劇了水產動物暴露于辛硫磷水體的危險。雖然辛硫磷相對易分解，不易殘留，但辛硫磷的蓄積作用對水產動物存在潛在危害[21]，因此有必要開展辛硫磷對水產動物毒性效應評估。辛硫磷對鯉（Cyprinus carpio）、金魚（Carassius auratus）和黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）幼魚的96 h LC50分別為1.0 mg/L、10 mg/L 和0.30 mg/L[22,23]。本研究結果顯示，辛硫磷對羅氏沼蝦96 h LC50為6.988 μg/L，顯著低于魚類，相似的結果在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）中也有報道。周桂嫻等[8]發現，辛硫磷對凡納濱對蝦24 h 和48 h LC50分別為6.32 μg/L 和1.03 μg/L，表明甲殼類動物比魚類對辛硫磷更敏感。根據國家《水與廢水監測分析方法》規定，判定辛硫磷對羅氏沼蝦劇毒。為進一步分析辛硫磷對羅氏沼蝦的毒性作用，將GOP、GPT、SOD、GSH-pX 和AChE 活性，MDA 和H2O2含量，以及proPO 基因、hsp 基因、alf 基因和hemocyanin 基因mRNA 表達量變化作為生物標志物，衡量羅氏沼蝦生理變化，評估辛硫磷對羅氏沼蝦的損傷。

3.1 辛硫磷對羅氏沼蝦肝胰腺功能及免疫系統的影響

肝胰腺是羅氏沼蝦重要的代謝和免疫器官，GPT 和GOT 作為動物細胞中的重要氨基酸轉氨酶，是衡量肝細胞功能的敏感指標[24]。本試驗中，辛硫磷暴露導致羅氏沼蝦GOT 和GPT 活性急劇下降，表明辛硫磷可能損害羅氏沼蝦肝胰腺功能，這與組織切片表現出的肝胰腺組織結構的破壞結果一致。在泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）中也有相似的報道。于敏等[25]研究發現，高濃度辛硫磷處理可導致泥鰍谷丙轉氨酶GPT 活性迅速下降，蛋白濃度顯著降低，推測辛硫磷暴露可影響氨基酸轉氨酶活性與蛋白質的合成，進而影響肝胰腺功能。辛硫磷處理導致羅氏沼蝦肝胰腺免疫相關基因（proPO 基因、hsp 基因、alf 基因和hemocyanin 基因）表達發生顯著變化，推測辛硫磷可影響免疫系統。酚氧化酶原激活系統是甲殼類動物先天性免疫中重要一環，控制病原的識別、防衛和信息傳遞[26]。辛硫磷處理導致羅氏沼蝦酚氧化酶原基因（proPO）表達先升高后顯著下降，相似的研究結果在毒死蜱對凡納濱對蝦的損傷[26]中也有報道，推測辛硫磷處理初期可刺激酚氧化酶原激活系統，隨著辛硫磷處理時間的延長及其對肝胰腺的損傷，顯著抑制了酚氧化酶原激活系統。除proPO 基因外，hsp 基因、alf 基因和hemocyanin 基因在辛硫磷處理后均表現為顯著下降。熱休克蛋白（Heat Shock Proteins,hsp）作為動物機體內的熱應激蛋白，可以提高細胞的應激能力，也是重要的非特異性免疫因子[28]；血藍蛋白是體液免疫的重要組成，具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤的作用[29,30]；抗脂多糖因子（antilipopolysaccharide factor,alf）是甲殼動物體內的一種抗菌肽，可以和脂多糖特異性結合，起抑菌作用。上述三種免疫基因表達的顯著下調暗示了辛硫磷對羅氏沼蝦非特異性免疫系統的損傷，這與焦陽等[31]報道的農藥可抑制中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的免疫基因表達的研究結果一致。

3.2 辛硫磷對羅氏沼蝦氧化防御系統的影響

生物體在受到外界有毒物質或者有害理化因子脅迫時，活性氧自由基增加，機體受損甚至死亡。氧自由基H2O2和脂質過氧化產物MDA 是2 種重要的氧化應激標志物。辛硫磷暴露導致羅氏沼蝦肝胰腺組織H2O2和MDA 含量顯著上升，這與楊帆等[10]的試驗結果相似，推測在受到毒性物質的脅迫時機體過量產生活性氧自由基，導致H2O2和MDA含量顯著上升，表明辛硫磷暴露可破壞羅氏沼蝦肝胰腺組織氧化還原平衡，氧自由基積累和脂質過氧化，為抵抗氧化損傷，生物體通過抗氧化酶等清除過多的氧自由基。超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-pX）是重要的抗氧化酶，可催化還原反應，消除活性氧，維持氧化平衡。本研究發現，辛硫磷暴露可顯著降低SOD 和GSH-pX 的活性，這可能是氧自由基的大量積累導致抗氧化酶與氧自由基相互作用而失活[32,33]。丁詩華對草魚（Ctenopharyngodon idella）的研究發現[34]，少量的活性氧對抗氧化酶有刺激作用，促使抗氧化酶活性上升，但是，在長時間或高濃度脅迫時，生物體內活性氧過度積累，抑制抗氧化酶的活性[35]。本研究中SOD 和GSH-pX 活性在辛硫磷暴露初期即處于抑制狀態，隨著時間的推移活性不斷下降，與上述高濃度脅迫試驗結果一致，表明2 μg/L 濃度的辛硫磷可嚴重破壞羅氏沼蝦抗氧化系統。

3.3 辛硫磷對羅氏沼蝦神經系統的影響

乙酰膽堿酶（AChE）可以特異性水解突觸釋放的乙酰膽堿，參與信號傳導，是神經系統正常工作的重要指標，大量存在于大腦、交感神經、肌肉等處[36]。本試驗檢測了肌肉組織中乙酰膽堿酶的活性來確定辛硫磷對羅氏沼蝦神經系統的損傷。汪鵬鵬等[37]報道，有機磷農藥進入生物體后，可抑制各組織器官內的膽堿酯酶活性，影響神經遞質傳遞神經信號。本研究發現，辛硫磷暴露導致羅氏沼蝦AChE活性下降，暴露初期游動加速，后期行動遲緩，推測羅氏沼蝦AChE 活性的下降導致乙酰膽堿大量蓄積，造成暴露初期的興奮表現，暴露時間延長后，神經系統受損嚴重，后期的運動遲緩，結果與斑馬魚（Danio rerio）和凡納濱對蝦研究結果一致[8,36]。

3.4 結論

辛硫磷對羅氏沼蝦劇毒，低于96 h LC50濃度的辛硫磷暴露可導致羅氏沼蝦的肝胰腺、腸道和鰓組織嚴重病理損傷，破壞氧化防御系統、免疫系統和神經系統，且部分損傷不可逆。