基于CNA35靶向液態氟碳納米粒的超聲分子成像檢測糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的實驗研究

馮鈺瑾 楊曉云 趙 昆 劉 芬 宗美男 王 一

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的晚期微血管并發癥之一，透析治療的DN患者5 年生存率僅約50%，早期檢出率低、干預不及時是導致DN 患者高死亡率的主要原因之一［1］。腎臟纖維化是DN 的主要病理表現，也是識別早期DN的關鍵［1-2］。腎穿刺活檢是目前臨床診斷DN 的金標準，但其為有創操作，可能引起腰痛、血尿、腎周血腫等并發癥。超聲分子成像是在超聲造影和分子標記基礎上發展起來的一種新興檢查手段，其原理是將特定的分子探針結合在液態氟碳納米粒（fluorocarbon nanoparticles，PFP-NPs）上，從而獲得靶向特定抗原或抗體的能力，然后將其通過靜脈注入體內，分子探針會靶向結合其配體，繼而使PFPNPs 在分子探針高表達區域累積，PFP-NPs 在低強度聚焦超聲的誘導下轉化為微米級微泡，再通過超聲進行檢測［3-4］，其具有靶向性好、能實時顯示病變結構等優勢，為組織定性和定量檢測提供了一種無創、實時的新型成像技術，具有極好的臨床應用前景。超聲分子成像的關鍵在于分子探針的選擇。近期研究［5-6］發現了一種可與Ⅰ型膠原特異性結合的新型分子探針——膠原結合蛋白35（CNA35），可用于Ⅰ型膠原的標記。本實驗通過探討CNA35 靶向PFP-NPs 在超聲分子成像檢測DN 大鼠腎臟纖維化中的應用價值，旨在為臨床DN 診斷提供理論依據。

材料與方法

一、主要實驗材料及儀器

1.主要材料：二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰甘油鈉鹽（DSPG）、二硬脂?；字Ｒ掖及罚―SPE）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-氨基（DSPE-PEG2000-NH2）、3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、膽固醇（CH）均購于德國Merck 公司；細胞膜紅色熒光探針（DiI）購于美國MCE 公司；全氟正戊烷（PFP）、2-嗎啉乙磺酸（2-MES）、PBST 緩沖液均購于阿拉丁控股集團有限公司；含10%胎牛血清的DMEM培養基購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；轉化生長因子-β（TGF-β）、HRP 標記二抗、DAB 染色試劑盒均購于英國Abcam 公司；DAPI 染色液、鏈脲佐菌素（STZ）均購于德國Sigma公司；FITC標記的抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體購于美國Arigo公司。

2.主要儀器：旋轉蒸發儀（BK-RE-1A，濟南程騰生物技術有限公司）；超聲波處理器（FS-150N，上海生析超聲儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（DMIL，德國徠卡公司）；低強度聚焦超聲儀（重慶醫科大學超聲影像學研究所）；正置顯微鏡（Axioscope 5，德國蔡司公司）；超聲成像系統［東芝Aplio 500，上海電氣（集團）公司］。

二、主要實驗方法

（一）CNA35靶向PFP-NPs的制備及相關檢測

1.CNA35 靶向PFP-NPs 的制備：分別稱取10 mg DPPC、4 mg DSPG、3 mg DSPE-PEG2000-NH2或DSPE、3 mg CH 溶解于10 ml 三氯甲烷中，然后再加入100 ml DiI；使用旋轉蒸發儀在50℃條件下真空旋轉蒸發1 h，除去有機溶劑。加入4 ml PBS 緩沖液，在冰水?。?～4℃）條件下，使用超聲波處理器聲振乳化，得到半透明的混懸液，加入液態PFP后，再次使用超聲波處理器聲振乳化，12 000 g 離心3 次取沉淀，將其加入2-MES 溶液（pH 值為8.0）中混勻即得帶有熒光標記的非靶向PFP-NPs 混懸液。另取4 mg EDC、3 mg NHS 溶于1 ml 2-MES 溶液（pH 值為5.2）中，加入50 ml CNA35，冰?。?℃）條件下置于搖床孵育1 h，然后調節溶液pH 值至8.0，即為CNA35 溶液。取500 ml 上述制備好的帶有熒光標記的非靶向PFP-NPs 混懸液，加入CNA35溶液，4℃避光孵育過夜，即得帶有熒光標記的CNA35 靶向PFP-NPs 混懸液。將上述帶有熒光標記的非靶向PFP-NPs 混懸液和帶有熒光標記的CNA35 靶向PFPNPs混懸液于4℃離心取沉淀，即制得帶有熒光標記的非靶向PFP-NPs和CNA35靶向PFP-NPs［5］。

2.CNA35靶向PFP-NPs體外靶向性檢測及體外超聲分子成像觀察

（1）體外靶向性檢測：將人腎小管上皮HK-2 細胞加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞貼壁生長至80%左右時，加入濃度為5 ng/ml TGF-β誘導上皮細胞間充質轉化，24 h后將細胞分為非靶向組和靶向組（每組6個復孔），然后分別將非靶向PFP-NPs 和CNA35 靶向PFP-NPs（1×104個/ml）加入細胞培養液中，37℃孵育1 h，棄細胞培養液，PBS緩沖液洗滌3次，加入DAPI染色液進行細胞核染色，并于倒置熒光顯微鏡下觀察非靶向組和靶向組細胞上PFP-NPs熒光信號（即紅色區域面積）。

（2）體外超聲分子成像觀察：取上述1 ml CNA35靶向PFP-NPs 混懸液置入凝膠模具中，低強度聚焦超聲儀體外給予超聲輻照（工作頻率：650 kHz，焦距：125 mm，功率：0.2 W/cm2，輻照時間：60 s），觀察并比較輻照前后超聲分子成像信號強度。

（二）DN大鼠模型建立

選擇健康清潔級6～8 周齡SD 大鼠［北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK（京）2022-0026］30 只，體質量180～220 g，單籠飼養，自由飲食，12 h 晝夜節律飼養。其中20 只采用腹腔注射大劑量STZ（65 mg/kg）的方式制備DN 大鼠模型，STZ 注射前禁食、禁水12 h。注射后連續3 d采集尾靜脈血檢測空腹血糖，當空腹血糖均＞16.7 mmol/L，且尿白蛋白＞15 μg/ml視為DN 大鼠模型構建成功［7］。本實驗經我院動物倫理委員會批準（2022-AE182）。

（三）CNA35 靶向PFP-NPs 體內超聲分子成像觀察及體內靶向性檢測

1.體內超聲分子成像觀察：將20 只DN 大鼠隨機分為非靶向組和靶向組，每組各10只。使用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，待完全麻醉，使用超聲成像系統（LA523 探頭，頻率5～9 MHz）對比脈沖序列造影模式進行超聲成像，非靶向組與靶向組超聲成像增益、機械指數、脈沖重復頻率、掃描深度、聚焦位置等參數均相同，待圖像穩定后，將30 mg/ml 非靶向PFP-NPs和CNA35 靶向PFP-NPs（1×106個/ml）經大鼠尾靜脈分別注入非靶向組和靶向組大鼠體內，劑量均為2 ml/kg，隨即推注1 ml生理鹽水沖管，注射10 min、30 min后于造影模式下觀察兩組大鼠腎臟，選取固定大小的感興趣區檢測超聲分子成像信號強度［7］。

2.體內靶向性檢測：于避光條件下處死兩組中各5只DN 大鼠并取出腎臟組織，制備冰凍切片，FITC 標記的抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體37℃孵育1 h，PBST 緩沖液洗滌后，加入DAPI 染色液進行細胞核染色，并于倒置熒光顯微鏡下檢測PFP-NPs 熒光信號強度及Ⅰ型膠原熒光信號強度。

（四）腎臟組織病理學觀察及Ⅰ型膠原免疫組織化學檢測

將剩余的10只DN大鼠及10只健康大鼠均處死，取腎臟組織制備石蠟切片，對腎臟組織進行Masson染色，于正置顯微鏡下觀察腎小球、腎小管的纖維化情況（藍色區域面積，陽性組織被染成藍色）；同時使用抗原修復液對DN 大鼠腎臟組織進行抗原修復，山羊血清37℃封閉2 h，FTTC 標記的兔抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體（1∶1000）4℃孵育12 h，PBST 緩沖液洗滌3 次，使用HRP 標記二抗37℃孵育1 h，PBST 緩沖液洗滌3次，使用DAB染色15 min，蘇木素復染、封片，于正置顯微鏡下觀察Ⅰ型膠原陽性（即棕黃色染色）情況，采用ImageJ 軟件計算Ⅰ型膠原染色面積占比，分析超聲分子成像信號強度與Ⅰ型膠原染色面積占比的相關性。

三、統計學處理

應用GraphPad 8.0 統計軟件，計量資料以x±s 表示，兩組比較采用t 檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、CNA35 靶向PFP-NPs 體外靶向性檢測及體外超聲分子成像觀察

本實驗制備的非靶向PFP-NPs 和CNA35 靶向PFP-NPs 平均粒徑分別為（268.03±4.73）nm、（277.06±5.62）nm。體外實驗結果顯示，靶向組人腎小管上皮HK-2細胞上的PFP-NPs熒光信號強度高于非靶向組（388.21±15.28 vs.25.79±3.62），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。CNA35靶向PFP-NPs 經體外低強度聚焦超聲輻照后的超聲分子成像信號顯著強于輻照前。見圖2。

圖1 靶向組與非靶向組人腎小管上皮HK-2細胞倒置熒光顯微鏡下觀（標尺為100 μm）

圖2 CNA35靶向PFP-NPs體外低強度聚焦超聲輻照前后超聲分子成像

二、CNA35靶向PFP-NPs體內超聲分子成像觀察

靶向組DN大鼠靜脈注射CNA35靶向PFP-NPs后10 min、30 min 腎臟組織超聲分子成像信號強度分別為8.37±1.27、9.73±1.25，均高于非靶向組（1.92±0.25、2.08±1.32），差異均有統計學意義（均P＜0.05）；且注射后10 min 超聲分子成像信號強度與注射后30 min 比較差異無統計學意義。見圖3。

圖3 靶向組與非靶向組靜脈注射PFP-NPs后10 min、30 min體內超聲分子成像

三、CNA35靶向PFP-NPs體內靶向性檢測

腎臟組織切片熒光檢測顯示，靶向組DN大鼠腎臟組織PFP-NPs 熒光信號強度高于非靶向組（946.02±83.55 vs.73.69±21.72），差異有統計學意義（P＜0.05）；靶向組Ⅰ型膠原熒光信號強度與非靶向組比較差異無統計學意義（969.07±96.67 vs.943.39±106.18），且PFPNPs熒光信號與Ⅰ型膠原熒光信號區域重合。見圖4。

圖4 靶向組DN大鼠體內靶向性檢測倒置熒光顯微鏡下觀（紅色區域為PFP-NPs熒光信號；綠色區域為Ⅰ型膠原熒光信號）。標尺為50 μm

四、DN大鼠腎臟病理檢測

Masson 染色顯示，DN 大鼠腎臟纖維化面積大于健康大鼠腎臟（1527.69±129.66 vs. 147.81±52.36），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 健康大鼠和DN大鼠腎臟病理圖（Masson染色，×200）

五、超聲分子成像信號強度與Ⅰ型膠原染色面積占比的相關性分析

相關性分析顯示，DN 大鼠腎臟超聲分子成像信號強度與Ⅰ型膠原染色面積占比呈正相關（r=0.838，P＜0.001）。見圖6，7。

圖6 DN 大鼠腎臟組織Ⅰ型膠原免疫組織化學圖（G：腎小球；V：腎內血管系統）

圖7 DN 大鼠腎臟超聲分子成像信號強度與Ⅰ型膠原染色面積占比的相關性分析散點圖

討論

纖維化是結締組織在損傷反應中逐漸積累，形成不可修復性器官損傷，并進一步導致器官衰竭的一種病理變化。超聲分子成像能夠使細胞和亞細胞活動過程可視化，理論上選擇合適的分子標記物可實現分子纖維化途徑的監測及量化評估［8］。糖尿病患者持續高血糖狀態會損傷腎臟，導致腎間質出現炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞也會凋亡，而來源于腎小管上皮細胞-間充質轉化的肌成纖維細胞將會聚集并使細胞外基質的生成與降解失衡，從而導致細胞外基質過度沉積，進而引發腎臟纖維化［9］。膠原沉積是DN患者腎臟纖維化的典型病理學特征。因此，通過合適的分子探針靶向膠原是DN 分子診斷的重要研究方向。既往實驗［10］制備了一種膠原結合蛋白CNA35，其可特異性結合纖維化組織中的膠原蛋白；且體內和體外成像實驗顯示，CNA35 較目前可用的其他膠原蛋白可視化技術具有更高的空間分辨率。靜脈注射CNA35 后，可在腎臟和肝臟觀察到膠原蛋白的標記，是目前應用較為廣泛的纖維化分子診斷標記物。

液態氟碳是一種全氟碳化合物，穩定性高且具有攜氧功能，近年來逐漸應用于超聲造影劑，并取得良好的效果。液態氟碳經由磷脂殼層包裹成納米級的顆粒后，相變閾值與其粒徑呈負相關，即粒徑越小，其相變閾值越高，反之則越低［11-12］。既往實驗［12］指出，PFP-NPs沸點為29℃，但被脂質包裹后，在37℃環境下1 h內粒徑未見明顯改變。本實驗成功制備Dil標記的非靶向PFP-NPs 及CNA35 靶向PFP-NPs，平均粒徑分別為（268.03±4.73）nm、（277.06±5.62）nm。TGF-β 能夠誘導人腎小管上皮HK-2 細胞間質轉化，導致大量膠原沉積［13］，因此發生間充質轉化的上皮細胞可用于體外檢測CNA35 靶向PFP-NPs 的靶向性。體外實驗結果顯示，靶向組人腎小管上皮HK-2 細胞上PFPNPs 熒光信號強度高于非靶向組（388.21±15.28 vs.25.79±3.62，P＜0.05），表明CNA35 靶向PFP-NPs 能夠靶向識別膠原蛋白。為了進一步探究CNA35 靶向PFP-NPs 對DN 大鼠腎臟纖維化的診斷效果，本實驗利用STZ 誘導構建DN 大鼠模型，結果顯示DN 大鼠腎臟組織有大量纖維沉積，與既往實驗［14］中DN 兔腎臟病理變化一致，提示成功建立了DN 大鼠模型。分別給予DN 大鼠注射CNA35 靶向PFP-NPs 和非靶向PFP-NPs，結果顯示靶向組DN 大鼠腎臟組織中PFPNPs 熒光信號強度高于非靶向組（P＜0.05）。進一步對上述大鼠腎臟組織進行Ⅰ型膠原免疫熒光染色發現，PFP-NPs 熒光信號與Ⅰ型膠原熒光信號區域重合，表明CNA35靶向PFP-NPs能夠靶向結合DN大鼠腎臟Ⅰ型膠原纖維沉積部位。體內CNA35 靶向PFP-NPs 經超聲輻照后，由液態轉變為氣態，超聲分子成像信號較輻照前明顯提高，表明其增強了超聲分子成像效果［15］。本實驗應用超聲分子成像觀察DN大鼠腎臟，結果顯示靶向組DN大鼠腎臟組織注射CNA35靶向PFPNPs 后10 min、30 min 超聲分子成像信號強度分別為8.37±1.27、9.73±1.25，均高于非靶向組（1.92±0.25、2.08±1.32），差異均有統計學意義（均P＜0.05）；且注射后10 min 超聲分子成像信號強度與注射后30 min 比較差異無統計學意義；表明CNA35靶向PFP-NPs 能夠靶向結合大鼠腎臟膠原高表達部位，實現了對DN 大鼠的靶向超聲分子成像。在超聲分子成像過程中，未與靶點結合的游離微泡會很快被消除，CNA35 靶向PFP-NPs 多在注射后10 min 即可觀察到，且持續至注射后30 min，這為今后單次造影劑注射后雙側腎臟同時成像提供了可能。腎臟纖維化是DN 的基本病理表現，病理學檢查是診斷DN 的“金標準”，其主要根據腎臟膠原沉積評估腎臟纖維化程度［16］。本實驗相關性分析顯示，DN大鼠腎臟超聲分子成像信號強度與Ⅰ型膠原染色面積占比呈正相關（r=0.838，P＜0.001），表明超聲分子成像在DN 診斷中有一定價值。但CNA35靶向PFP-NPs 與腎臟纖維化組織中膠原靶向結合效率仍需進一步探究。

綜上所述，CNA35 靶向PFP-NPs 能夠靶向結合大鼠腎臟膠原高表達部位，實現了對DN大鼠腎臟纖維化的靶向超聲分子成像，為臨床DN診斷提供了理論依據。