雞傳染性法氏囊病病毒VP5 的原核表達、多抗制備及初步應用

韓金澤，牛鑫鑫，王國棟，葛成菲，張玉龍，黃萌萌，許萌萌，于航博，劉潤杭，韓京哲，吳子文，于曉雪，高玉龍，李留安，祁小樂

（1.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津300392；2. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，動物疫病防控全國重點實驗室禽免疫抑制病創新團隊，黑龍江哈爾濱 150069；3. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，世界動物衛生組織傳染性法氏囊病參考實驗室，黑龍江哈爾濱 150069）

傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種主要危害雛雞的急性傳染病。IBDV 的主要靶器官是雞的中樞免疫器官法氏囊，可導致法氏囊的急性損傷和B淋巴細胞的壞死、崩解，進而導致嚴重的免疫抑制，給養禽業造成了巨大經濟損失[1-2]。IBDV 屬于雙RNA 病毒科（Birnaviridae）禽雙RNA 病毒屬（Avibirnavirus），其基因組由A 和B 兩個雙股RNA 節段組成，其中A 節段編碼VP2、VP3、VP4、VP5 蛋白，B 節段編碼VPl 蛋白[3-4]。

在IBDV 編碼的5 個蛋白中，VP5 是最后一個被鑒定的蛋白，它是由病毒基因組A 節段的一個獨立讀碼框編碼的，分子質量大小約17 kDa，屬于病毒的非結構蛋白[5]。VP5 蛋白也是一個毒力因子，其在病毒復制早期抑制細胞凋亡，而在病毒復制晚期促進細胞凋亡[6-8]。研究[9-12]還發現，VP5 是病毒復制非必需蛋白，因此利用反向遺傳操作技術可拯救出VP5基因缺失的IBDV。作為一個多功能蛋白，VP5 的更多生物學功能尚待鑒定，其分子機制尚待挖掘。本試驗利用原核表達系統表達了IBDV 超強毒株（vvIBDV）中的優勢流行毒株VP5 蛋白，用鎳柱純化了呈可溶性表達形態的重組VP5 蛋白，用BALB/c 小鼠制備了鼠源VP5 多抗，并進行了初步應用，為深入探究VP5 蛋白的結構和功能提供了物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體和細胞 IBDV rHLJ0504-HT株及其VP5基因缺失株rHLJ0504-HT-KOVP5，由中國農科院哈爾濱獸醫研究所禽免疫抑制病團隊（簡稱本實驗室）制備。原核表達載體pCold-I、真核表達載體pCAGGS、重組真核表達質粒pCAGGS-HLJ0504-VP5（將IBDVVP5基因克隆入pCAGGS 中）、DF-1 細胞，均由本實驗室保存。E.coliBL21（DE3）工程菌，購自于寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶EcoRI 和XhoI，為TaKaRa 公司產品；His 標簽蛋白純化樹脂Ni瓊脂糖凝膠，購自Cytiva 公司；抗β-actin 標簽的抗體、HRP 標記的兔抗鼠IgG、FITC 標記的山羊抗兔IgG 抗體、弗氏佐劑、脫脂奶粉、IPTG，為Sigma 公司產品；山羊抗小鼠IgG（IRDye800CW標記），為LiCor Bio-Sciences 公司產品；His 標簽抗體為上海仝元生物科技有限公司產品；辣根過氧化氫酶DAB 顯色試劑盒（超敏型）為生工生物工程（上海）股份有限公司產品；PageRuler 預染蛋白Marker 26616，為Thermo Scientific 公司產品；DNA Marker（DL 2000）、DNA 聚合酶Mix、同源重組試劑盒，為諾唯贊生物科技股份有限公司產品；IBDV VP1 蛋白單克隆抗體，由本實驗室制備和保存；膠回收試劑盒，為Omega 公司產品；質粒中提試劑盒，為 QIAGEN 公司產品；轉染試劑TransIT-X2?Dynamic Delivery System，為Mirusbio公司產品；考馬斯亮藍染色液，為索來寶公司產品。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜、臺式低溫高速離心機，為Thermo Scientific 公司產品；PCR 儀，為TaKaRa 公司產品；組織研磨儀，為Retsch 公司產品；超微量分光光度計，為Implen 公司產品；凝膠電泳儀，為北京六一儀器廠產品；Odyssey 紅外掃描儀，為Licor 公司產品；ELISA 酶標板，為Costar 公司產品；全自動酶標儀，為BioTek 公司產品；超聲細胞破碎儀，為SONICS 公司產品。

1.1.4 實驗動物 6 周齡雌性BALB/c 小鼠，購自遼寧長生生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1VP5基因擴增和原核表達載體構建參 考IBDV HLJ0504 株 基 因 組（GenBank 號GQ451330），設計VP5基因特異性引物（上游引物pCold 1-VP5-F：5'-atggagctcggtaccctcgagGTTAGTAGAGATCAGACAAACGATCGC-3'；下游引物pCold 1-VP5-R：5'-caggtcgacaagcttgaattcTCACTCAGGCTTCCTTGGAAGG-3'），送睿博興科生物技術（哈爾濱）有限公司合成。以rHLJ0504-HT株為模板，通過RT-PCR 進行VP5基因擴增。按常規方法提取病毒RNA 并反轉錄為cDNA，然后進行PCR 擴增。PCR 反應體系：DNA 聚合酶Mix 25 μL、cDNA 1 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、ddH2O 20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃5 min。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按凝膠回收試劑盒說明書進行目的片段回收。以EcoRI和XhoI 為酶切位點線性化pCold I 載體，將膠回收的目的片段與pCold I 空載體，在37 ℃利用同源同組試劑盒進行同源重組。將同源重組產物轉化感受態細胞大腸桿菌BL21（DE3），12 h 后從LB 固體培養基（氨芐抗性）上挑取單克隆菌落，通過菌液PCR 篩選陽性克隆，并將陽性克隆送睿博興科生物技術有限公司進行測序。將鑒定正確的重組原核表達質粒命名為pCold-HLJ-VP5。

1.2.2 VP5 蛋白誘導表達 首先將重組質粒pCold-HLJ-VP5 轉化工程菌E.coliBL21（DE3），12 h 后挑單菌落接種到5 mL 氨芐抗性的LB 培養液中，于200 r/min 37 ℃過夜培養；次日，將過夜培養的菌種以1:100 接種于1 L 氨芐抗性的LB 中，200 r/min、37 ℃振蕩培養；待OD 值達到0.4～0.6時，加終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 進行誘導，150 r/min 20 ℃振蕩培養，22 h 后、10 000g/min 室溫離心10 min 收集菌體，并用超聲細胞破碎儀破碎菌體，12 000g/min 室溫離心10 min。離心后分離回收沉淀和上清，進行聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）。

1.2.3 VP5 蛋白純化和鑒定 將誘導表達后的菌體用超聲細胞破碎儀進行裂解，用His 標簽蛋白純化樹脂Ni 瓊脂糖凝膠作為填料，純化目的蛋白。通過考馬斯亮藍染色法檢驗洗脫液洗脫效率，選用50、100、150、200、250、300 mmol/L 咪唑進行蛋白洗脫的最佳條件摸索。利用摸索得到的最佳洗脫條件洗脫目的蛋白，最后使用超微量分光光度計檢測純化后蛋白濃度。將純化的目的蛋白進行SDS-PAGE 電泳鑒定，然后用His 標簽抗體進行Western Blot 鑒定。Western Blot 鑒定過程：將轉印有VP5 的硝酸纖維素膜（NC 膜）用5%的脫脂乳于4 ℃封閉過夜，用PBST 緩沖液洗滌3 次，5 min/次；加入按1:1 000 稀釋的His 標簽抗體，室溫孵育1.5 h；用PBST 洗滌3 次，5 min/次；加入1:20 000 稀釋的抗鼠熒光二抗，于室溫孵育50 min；用PBST 洗滌3 次，5 min/ 次；最后在Odyssey 紅外掃描儀下鑒定表達情況。

1.2.4 VP5 鼠源多抗制備 將純化的重組VP5 蛋白與等體積弗氏佐劑混勻乳化（首次免疫用弗氏完全佐劑，此后均用弗氏不完全佐劑）。首次免疫以200 μg/只的劑量通過腹腔注射方式免疫小鼠，間隔14 d 進行下一次免疫，共免疫5 次。每次免疫后7 d，使用間接ELISA 方法測定血清抗體效價，在效價達到標準后采集小鼠血液并分離血清，作為VP5 蛋白的多克隆抗體（多抗）血清。間接ELISA 檢測過程：用碳酸鹽包被液稀釋VP5 蛋白至質量濃度1.3 μg/mL 時包被ELISA 板，4 ℃過夜孵育，PBST 洗板5 次；每孔加入200 μL 5%脫脂乳封閉液，37 ℃下孵育1 h，PBST 洗板5 次；每孔加入100 μL 稀釋的待檢血清樣品，37 ℃下孵育30 min，PBST 洗板5 次；每孔加入100 μL 稀釋的HRP-兔抗雞抗體IgG，37 ℃下孵育30 min，PBST 洗板5 次；每孔加入100 μL TMB 底物顯色液，作用15 min；每孔加入100 μL 終止液終止反應，用全自動酶標儀測定吸光值OD450。

1.2.5 VP5 多抗鑒定

1.2.5.1 VP5 多抗的間接免疫熒光法（IFA）檢測 將DF-1 細胞培養于12 孔細胞培養板中，當細胞匯合度達到70%時，在TransIT-X2 轉染試劑介導下分別轉染真核表達質粒pCAGGS-HLJ0504-VP5 和空質粒pCAGGS，均1 μg/孔。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養30 h；棄掉培養液，用PBS 洗滌3 次；加入4%的多聚甲醛，于4 ℃固定細胞30 min；PBS 洗滌3 次后用5%的脫脂乳于37 ℃溫箱封閉1 h；將1:200 稀釋的VP5多抗加入細胞單層，于37 ℃濕盒孵育1 h；PBS 洗滌3 次，加入1:200 稀釋的FITC 標記的山羊抗兔IgG 抗體，37 ℃孵育1 h；PBS 洗滌3 次，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5.2 VP5 多抗Western Blot 鑒定 將重組蛋白VP5 進行SDS-PAGE 后，轉印至NC 膜上，用VP5 多抗通過Western Blot 進行檢測。

1.2.6 VP5 多抗初步應用 通過IFA 和Western Blot 檢測，用VP5 多抗對rHLJ0504-HT 株及其VP5基因缺失株rHLJ0504-HT-KOVP5 進行鑒別檢測。

1.2.6.1 IFA 檢測 將r H L J 0 5 0 4-H T 株和rHLJ0504-HT-KOVP5 株分別感染飼養于12 孔板的70%匯合度的DF-1 細胞，同時設空白對照細胞。病毒感染后24 h，用VP5 多抗進行IFA 檢測。

1.2.6.2 Western Blot 檢測 將1.2.6.1 收集的細胞樣品用VP5 多抗進行Western Blot 檢測。同時，采用β-actin 抗體、IBDV VP1 單抗對樣品進行Western Blot 檢測。

2 結果

2.1 VP5 基因擴增及原核表達質粒構建

通過RT-PCR 擴增獲得了IBDV HLJ054 株的VP5基因，擴增片段長435 bp（圖1）。測序結果顯示，克隆有IBDV HLJ0504 株VP5基因的重組原核表達質粒pCold-HLJ-VP5 構建正確。

圖1 IBDV VP5 基因PCR 擴增結果

2.2 VP5 重組蛋白表達

SDS-PAGE 鑒定結果顯示，VP5 蛋白主要以上清形式可溶性表達（分子質量約17 kDa），在菌體沉淀（包涵體形式）中量較少（圖2）。

圖2 重組VP5 蛋白的表達與純化結果

2.3 VP5 重組蛋白純化

SDS-PAGE 鑒定結果顯示，表達的重組VP5蛋白在200 mmol/L 咪唑洗脫條件下獲得了良好純化（圖2）。經測定，該蛋白的質量濃度為850 ng/μL。

2.4 VP5 重組蛋白鑒定

對純化后的表達蛋白進行Western Blot 鑒定。結果（圖3）顯示，在約17 kDa 處出現清晰的特異條帶，說明所表達和純化的VP5 重組蛋白與His標簽抗體可以發生特異性反應。

圖3 His 標簽抗體介導的重組VP5 蛋白Western Blot 鑒定結果

2.5 VP5 多抗制備

用包被VP5 的ELISA 檢測VP5 多抗效價，將多抗樣品孔OD450與陰性對照孔比值（P/N）＞2.1 時的多抗樣品最高稀釋度作為VP5 多抗效價。結果（圖4）顯示，VP5 多抗效價可達1:64 000。

圖4 免疫小鼠血清中VP5 多抗效價ELISA 測定結果

2.6 VP5 多抗鑒定

2.6.1 IFA 檢測 檢測結果（圖5）顯示，重組真核表達載體pCAGGS-HLJ0504-VP5 轉染組的DF-1細胞呈現特異性的紅色熒光，而pCAGGS 空載體對照組細胞沒有熒光，說明所制備的VP5 多抗能夠通過IFA 特異性識別IBDV 的VP5 蛋白。

圖5 IBDV VP5 多抗的IFA 鑒定結果

2.6.2 Western Blot 檢測 檢測結果（圖6）顯示，重組真核表達載體pCAGGS-HLJ0504-VP5 轉染組可見約17 kDa 的條帶，而pCAGGS 空載體對照組無該條帶，且兩組樣品均可檢測到細胞β-actin，說明所制備的VP5 多抗能夠通過Western Blot 特異性識別IBDV 的VP5 蛋白。

圖6 IBDV VP5 多抗的Western Blot 鑒定結果

2.7 VP5 多抗初步應用

2.7.1 IFA 檢測 對分別感染rHLJ0504-HT 株和rHLJ0504-HT-KOVP5 株的DF-1 細胞用VP5 多抗進行IFA 檢測。結果（圖7）顯示，rHLJ0504-HT感染組呈現特異性的紅色熒光，而不表達VP5 的rHLJ0504-HT-KOVP5 感染組以及空白細胞對照組沒有熒光，說明本研究所制備的VP5 多抗可用于通過IFA 鑒別IBDV 及其VP5基因缺失毒株。

圖7 VP5 多抗對IBDV 不同毒株的IFA 檢測結果

2.7.2 Western Blot 檢測 對分別感染rHLJ0504-HT 株和rHLJ0504-HT-KOVP5 株的DF-1 細胞進行Western Blot 檢測。如圖8 所示：基于β-actin 抗體的Western Blot 結果顯示，2 個IBDV 感染組和空白細胞對照組均能檢測到約43 kDa 的β-actin，說明3 個組均有細胞樣品?；贗BDV VP1 單抗的Western Blot 結果顯示，2 個IBDV 感染組均能檢測到約97 kDa 的VP1 蛋白，說明2 個感染組均成功感染了IBDV?；赩P5 多抗的Western Blot 結果顯示，rHLJ0504-HT 感染組可檢測到約17 kDa 的VP5 條帶，而不表達VP5 的rHLJ0504-HT-KOVP5 感染組以及空白細胞對照組無VP5 條帶，說明本研究所制備的VP5 多抗可用于通過Western Blot 鑒別IBDV 及其VP5基因缺失毒株。

圖8 VP5 多抗對IBDV 不同毒株的Western Blot 檢測結果

3 討論

IBDV VP5 雖然是一個非結構蛋白，但它在IBDV 的生命過程中發揮著重要作用，其分子機制尚需要進一步被揭示。IBDV 不同毒力毒株由于使用不同的起始密碼子而編碼出的VP5 蛋白長度不同，這是否影響病毒的生物學功能，也需要更深入地探索。另外，VP5基因是IBDV 唯一可以缺失的基因，因而IBDV 反向遺傳研究系統的建立也使得IBDVVP5基因缺失毒株的拯救成為可能[9，13]。與親本毒株相比，VP5缺失毒株雖然復制有延遲，但其致病力也顯著下降，所以非結構蛋白VP5 的缺失是IBDV 新型疫苗研究的一個重要思路[9-12]。VP5缺失毒株不會誘導機體產生VP5 抗體，如果這種疫苗與VP5 抗體ELISA 檢測試劑盒相配合，將能夠實現疫苗免疫與野毒感染的鑒別檢測，具有重要意義。

正是基于以上考慮，本試驗開展了vvIBDV 優勢流行毒株VP5 蛋白表達及VP5 多抗制備的研究。本研究利用大腸桿菌BL21 表達系統表達并純化了融合了His 標簽的vvIBDV 優勢流行毒株的VP5蛋白。本研究最初曾嘗試使用pGEX 表達系統表達IBDV VP5 蛋白，但獲得的可溶性VP5 蛋白量很低。后經過摸索，最終應用pCold 表達系統成功表達了VP5 蛋白，試驗過程中對誘導溫度、誘導劑濃度、誘導時間等表達條件對重組蛋白表達量的影響進行了探索，發現采用20 ℃、IPTG 終濃度為1 mmol/L 的條件誘導22 h 后，所獲得的蛋白表達量最高。對菌體超聲波裂解物的SDS-PAGE 分析表明，VP5蛋白大部分表達于超聲破碎的菌體上清，在菌體沉淀中表達量極低，說明重組VP5 蛋白大部分以可溶性狀態表達，僅有少量蛋白以包涵體形式存在。包涵體是外源基因在原核細胞中表達時形成的一種由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒。當蛋白表達速度過快時，沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，從而導致過多的蛋白間非特異性結合，進而造成蛋白質無法達到足夠的溶解度，而以包涵體形式存在。包涵體蛋白不可溶，不利于后期的蛋白純化和應用。重組蛋白的可溶性表達有利于蛋白天然構象的維持，而且也利于后續的純化和高通量制備。應用鎳柱，使用50 mmol/L 咪唑作為洗雜液最大程度洗脫雜質，再經200 mmol/L咪唑洗脫的重組VP5 蛋白純度可達90%以上。用BALB/c 小鼠制備的鼠源VP5 多抗的ELISA 效價可達1:64 000，說明本試驗應用pCold-I 表達系統表達的重組VP5 蛋白具有良好的免疫原性，免疫BALB/c 小鼠后產生了高滴度抗體。IFA 和Western Blot 結果顯示，本研究制備的VP5 多抗不僅可特異性地識別VP5 蛋白，而且可對IBDV 及其VP5缺失毒株進行鑒別檢測。

綜上，本研究建立了一種基于原核表達系統的IBDV VP5 蛋白可溶性表達和制備的方法，并制備了特異性良好的鼠源VP5 多抗；制備的VP5 蛋白可用于進一步研制IBDV VP5 抗體ELISA 檢測方法；制備的VP5 多抗為IBDV 基因功能和新型疫苗研究提供了物質基礎。