生防枯草芽孢桿菌Czk1固體發酵工藝條件優化

賀春萍 翟純鑫 吳賀 梁艷瓊 譚施北 吳偉懷 易克賢

摘??要：枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Czk1是一株具廣譜拮抗、促生和誘導植株產生抗病性的根際益生菌。為了全面資源化利用農業廢棄物中的有機養分和促進對植物土傳病害的生物防治，本研究以Czk1為研究對象，以雞糞為底肥，分別利用玉米秸稈、菌糠、椰糠堆肥為原料，采用液固兩相發酵工藝，以稀釋平板菌落計數法測定活菌總數和芽孢數，經過單因素和正交試驗方法，明確Czk1固體發酵物料的配方、工藝參數和培養條件。得出Czk1固體發酵的最優條件：最佳原料為菌糠雞糞堆肥，Czk1接種重量為10%，黃豆粉添加量為10%，含水量為40%，發酵溫度為37?℃，翻拋1次/72?h，在此條件下，Czk1菌株中的芽孢活菌數量總量可以達到8.63×108?CFU/g，芽孢數為8.37×108?CFU/g。其次，發酵效果較佳的原料為秸稈雞糞堆肥，Czk1接種量為10%，添加5%黃豆粉，40%含水量，發酵溫度為37?℃，翻拋1次/72?h，此條件下，Czk1接種菌株中的活菌數量總量可達到6.53×108?CFU/g，芽孢數為5.97×108?CFU/g；另外，在此配方條件下再添加30%菌糠，Czk1菌株的活菌數量總量及芽孢數分別可達到8.70×108?CFU/g和6.90×108?CFU/g。4種發酵生物肥原料的理化性質測定表明，其有機質含量、碳氮比均有較大差異，其中以雞糞為原料其pH、全磷和全鉀含量均最高，碳氮比最低，氮、磷、鉀總含量均高于秸稈、椰糠和菌糠；秸稈為原料其電導率、有機質含量最高；椰糠為原料其全氮含量最高，菌糠為原料碳氮比最高。不同雞糞與菌糠、秸稈及椰糠組合的生物有機肥的種子發芽指數均大于80%。因此，枯草芽孢桿菌Czk1具有良好的開發利用價值，選擇合適的發酵生產條件可將農業廢棄物制備出高質量的生物有機肥。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；固體發酵；發酵工藝優化；生物有機肥；芽孢產量中圖分類號：TQ455；S476.1??????文獻標識碼：A

Optimization?of?Solid-state?Fermentation?Conditions?of?Antagonistic?Bacillus?subtilis?Czk1

HE?Chunping1，2，?ZHAI?Chunxin2*，?WU?He3，?LIANG?Yanqiong1，?TAN?Shibei1，?WU?Weihuai1，?YI?Kexian1，2**

1.?Environment?and?Plant?Protection?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences?/?Key?Laboratory?of?Integrated?Pest?Management?on?Tropical?Crops，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs?/?Key?Laboratory?of?Low?Carbon?Green?Agriculture?in?Tropical?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs?/?Hainan?Key?Laboratory?for?Monitoring?and?Control?of?Tropical?Agricultural?Pests，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?2.?College?of?Plant?Protection，?Nanjing?Agricultural?University，?Nanjing，?Jiangsu?210095，?China;?3.?College?of?Agronomy?and?Biotechnology，?Yunnan?Agricultural?University，?Kunming，?Yunnan?650201，?China

Abstract：?Bacillus?subtilis?Czk1?is?a?rhizosphere?antagonist?with?a?very?broad-spectrum?antagonistic，?growth?promotion?and?induction?of?plant?resistance.?In?order?to?fully?utilize?organic?nutrients?in?agricultural?wastes?and?promote?biological?control?of?soil-borne?plant?diseases，?Czk1?was?used?as?the?research?object?in?this?study，?chicken?manure?as?the?base?fertilizer，?corn?straw，?mushroom?bran?and?coconut?bran?compost?were?used?as?the?raw?materials，?and?the?liquid-solid?two-phase?fermentation?process?was?adopted.?The?total?number?of?viable?bacteria?and?the?number?of?spores?were?determined?by?the?dilution?plate?colony?counting?method.?The?formula，?process?parameters?and?culture?conditions?of?Czk1?solid?fermentation?materials?were?determined?by?the?single?factor?and?orthogonal?experiment?method.?The?results?showed?that?the?optimal?conditions?for?solid?fermentation?of?Czk1?are?raw?material?was?mushroom?bran?and?chicken?manure?compost?with?the?inoculated?weight?of?Czk1?at?10%，?the?added?amount?of?soybean?powder?at?10%，?the?water?content?at?40%，?the?fermentation?temperature?at?37?℃?and?the?turning?once?every?72?h.?Under?the?conditions，?the?total?number?of?viable?bacteria?in?Czk1?strain?could?reach?8.63?108?CFU/g.?The?number?of?spores?was?8.37?108?CFU/g.?The?best?fermentation?material?was?corn?straw?and?chicken?manure?compost，?Czk1?inoculation?amount?of?10%，?adding?5%?soybean?powder，?40%?water?content，?fermentation?temperature?of?37?℃，?turning?once?every?72?h，?the?total?number?of?viable?bacteria?in?Czk1?inoculation?strain?could?reach?6.53?108?CFU/g.?The?number?of?spores?was?5.97?108?CFU/g.?The?total?number?of?viable?bacteria?and?the?number?of?spores?of?Czk1?strain?could?reach?8.70?108?CFU/g?and?6.90?108?CFU/g，?respectively，?when?30%?mushroom?bran?was?added.?The?physical?and?chemical?properties?of?four?fermentation?biological?fertilizer?raw?materials?were?determined，?and?significant?differences?were?observed?in?their?organic?matter?content?and?carbon?to?nitrogen?ratio.?Among?them，?chicken?manure?had?the?highest?pH，?total?phosphorus，?and?total?potassium?content，?while?the?carbon?to?nitrogen?ratio?was?the?lowest.?The?total?content?of?nitrogen，?phosphorus，?and?potassium?was?higher?than?that?of?corn?straw，?coconut?bran，?and?mushroom?bran;?Corn?straw?has?the?highest?electrical?conductivity?and?organic?matter?content?as?the?raw?material;?Coconut?bran?has?the?highest?total?nitrogen?content，?while?mushroom?bran?has?the?highest?carbon?to?nitrogen?ratio.?The?seed?germination?index?of?bio-organic?fertilizer?with?different?combinations?of?chicken?manure，?mushroom?bran，?corn?straw，?and?coconut?bran?is?greater?than?80%.?Therefore，?high?quality?bioorganic?fertilizer?can?be?prepared?from?agricultural?waste?by?selecting?suitable?fermentation?production?conditions.?B.?subtilis?Czk1?has?good?development?and?utilization?value.

Keywords：?Bacillus?subtilis;?solid-state?fermentation;?fermentation?condition?optimization;?bio-organic?fertilizer;?spore?production

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2024.02.019

橡膠樹根病廣泛分布于世界各植膠區，其中以熱帶地區東南亞國家發生較為嚴重，在我國以海南和云南主要植膠區發生較為普遍，該病害是限制我國天然橡膠產量提高的重要生物因子[1]。目前，國內發現的7種類型根病中，以紅根病發病率最高（10%～40%）和分布最為廣泛，若未及時防治，病株死亡率可達100%[2]。由土傳病害病原橡膠樹靈芝菌（Ganoderma?pseudoferreum）引起的紅根病可侵染橡膠樹根頸部，能引起根部腐爛，發生嚴重時植株枯萎死亡。一直以來，生產上防治橡膠樹紅根病多數以化學藥劑十三嗎啉灌根為主，但長期單一施用此殺菌劑存在藥劑成本高、病原菌耐藥性、防效下降及對膠林生態不安全等一系列問題[3]。利用生防技術治理土傳病害因具有高效、安全、環保等諸多優勢日益受到人們的重視，利用有益微生物制備生物有機肥在防治植物土傳病害研究中取得了許多研究成果[4-9]。因此，篩選高效、安全的植物根際促生菌及拮抗微生物，開發具良好防效、環保的微生物肥料具有重要的現實意義。

利用已腐熟有機肥添加有益微生物二次發酵制備生物有機肥，其中應用最為廣泛的微生物菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus），因其具有拮抗病原菌、促生、抗逆及產生芽孢的功能而廣受各大生物有機肥生產企業的青睞。但受制于肥料中功能菌活菌數的限制，肥料的質量良莠不齊，因此迫切需要提升肥料中的活菌數來提升肥料質量。有研究表明，在雞糞堆肥過程中添加菌劑[10-11]、玉米秸稈[10，?12-13]、菌糠（蘑菇渣）[12，?14-16]、椰糠[17]、木屑[18]、香蕉莖葉[19]、菠蘿莖葉[20]等均可改善堆肥質量。資源化利用多種農業廢棄物而腐熟有機肥，我國每年可產生秸稈、中藥渣、牛糞、豬糞等廢棄物約6000萬t，充分利用這些有機養分資源，可以減少化肥的投入和對環境的污染，大幅度地提高土壤的有機質含量，并且可以改善土壤的生物活性[21]。

枯草芽孢桿菌（B.?subtilis）Czk1分離自橡膠樹根際，其具有促生、拮抗和增強植株抗病性的特性，對根病、炭疽病、白粉病等多種橡膠樹病害均有較強的拮抗作用[22-24]，該菌株能分泌多種脂肽類抗菌物質[25]和產生33種揮發性物質[26]，并可與化學殺菌劑協同抑制橡膠樹根病病原[3]，應用潛力大。本課題組前期通過研究Czk1菌株的液體發酵條件獲得優化培養基組分和最佳培養參數，使Czk1菌株的生長量得到了顯著提高[27]，但菌液難以大規模保存和實現產業化，而研究固體菌劑不僅能提供相同的菌量，還具有貨架期長、可長期發揮生防功能等優勢。為了實現Czk1菌株的產業化，本研究對枯草芽孢桿菌Czk1的固體發酵條件進行優化，探究各發酵條件下活菌量及芽孢數量的變化情況，為后期生產制備生物肥料提供理論參考。

1??材料與方法

1.1??材料

供試原料：腐熟雞糞購于豐潤農資超市，金針菇菌糠購于連云港貝森生物科技有限公司，椰糠購于中國熱帶農業科學院農資公司，玉米秸稈粉購于聯豐農產品深加工公司。

供試培養基[28]：LB液體培養基、LA培養基。

供試生防菌株：枯草芽孢桿菌Czk1，由筆者所在實驗室分離、鑒定和保藏。

1.2??方法

1.2.1??生防菌株接種液的制備??將冷凍保存的生防菌株Czk1轉接于LA培養基平板，然后置于37?℃培養箱中培養48～72?h；挑取Czk1菌株單個菌落于LB液體培養基中，于37?℃、180?r/min條件下培養12～16?h，制成Czk1菌液，終濃度約108?CFU/mL。

1.2.2??固體發酵載體的篩選??分別選取菌糠、秸稈和椰糠為發酵載體，采用250?mL三角瓶固體發酵培養[28]，以腐熟雞糞為底肥，將菌糠、秸稈和椰糠添加量分別設為0、33%、38%、41%和100%。原料均粉碎過20目篩，三角瓶內裝40?g不同配比的雞糞堆肥，置于121?℃、30?min條件下間歇性滅菌2次，于雞糞堆肥中接入5%?Czk1種子液，使用無菌水調節含水量至40%，置于30?℃培養箱中靜置發酵7?d，每隔24?h翻拋1次，每處理重復3次。統計Czk1活菌數及芽孢數。

1.2.3??固體發酵條件優化??根據1.2.2的試驗結果，以最優固體發酵載體為基礎，進一步優化Czk1菌株的固體發酵條件。

優化Czk1菌株接種量：于雞糞堆肥中分別接入為5%、10%、15%（m/m）的Czk1菌株發酵液，含水量調節至40%，每24?h翻拋1次，于30?℃培養箱中靜置發酵7?d，每處理重復3次。統計Czk1活菌數及芽孢數。

優化黃豆粉添加量：于雞糞堆肥中分別添加為0、5%、10%（m/m）的黃豆粉，調節含水量為40%，每24?h翻拋1次，于30?℃培養箱中靜置發酵7?d，每個處理重復3次。統計Czk1活菌數及芽孢數。

固體發酵條件正交試驗：于雞糞堆肥中接入10%?Czk1菌株接種量，添加10%黃豆粉，檢測不同含水量（30%、40%、50%）、培養溫度（20、30、37?℃）和翻拋時間（24、48、72?h各1次）對Czk1菌體總量和芽孢的影響。每處理重復3次，置于相應條件下靜置7?d。統計Czk1活菌數及芽孢數。

堆肥輔料配方優化：于篩選出的最佳比例秸稈雞糞堆肥中分別添加0、10%、20%、30%、40%（m/m）菌糠，于37?℃培養箱中靜置發酵7?d，每隔72?h翻拋1次；于篩選出的最佳比例菌糠雞糞堆肥中分別添加0、10%、20%、30%、40%（m/m）秸稈，于37?℃培養箱靜置發酵7?d，每隔72?h翻拋1次。每處理重復3次。統計Czk1活菌數和芽孢數。

采用無菌水系列稀釋平板涂布計數法統計Czk1活菌數和芽孢數，三角瓶中加入90?mL無菌水，放入10顆玻璃珠，取10?g生物有機肥加至三角瓶中，置于180?r/min條件下震蕩培養30?min，系列稀釋，取100?μL稀釋液涂布于平板，置于37?℃培養箱過夜培養并進行菌落計數。將懸浮液放于80?℃溫度下水浴處理20?min，再依照稀釋平板菌落計數法計算芽孢數量[29]。

1.2.4??原料及生物有機肥理化性質檢測??pH及電導率（EC）測定：樣品與去離子水按1∶10（m/V）混合均勻，置于水平搖床上震蕩2?h，靜置30?min后用pH計（FE28-Standard，瑞士）和電導率儀（FE30K，瑞士）分別測定pH及EC。樣品經濃硫酸-過氧化氫消煮，采用凱氏定氮儀（海能K9840，山東）測定全氮含量；采用火焰光度計（M410，英國）測定全鉀含量；采用釩鉬黃比色法測定全磷含量；采用元素分析儀（EA2400-Ⅱ，英國）測定有機質含量。

1.2.5??發芽指數測定??取單因素試驗有機肥樣品測定種子發芽指數，以表明其物料腐熟度及有機肥毒性。具體方法：黃瓜種子（博優青瓜王308F1）置于60?℃熱水中燙種10?min，用2%次氯酸鈉消毒3?min，用蒸餾水沖洗3～4次。在培養皿中均勻放入20顆種子，種子下墊2張滅菌濾紙。將已測定pH與EC的有機肥過濾，在放有種子的培養皿中加入5?mL濾液，置于28?℃培養箱中黑暗培養48?h，統計發芽種子數，測定根長，計算發芽率和發芽指數，每個處理重復3次。用蒸餾水培養作對照。發芽率=（發芽種子數/供試種子總數）×100%；發芽指數（GI）=（樣品發芽率×平均根長）/（對照發芽率×平均根長）×100%。

1.3??數據處理

利用Excel?2016和SPSS?25.0軟件進行數據統計與分析，采用Duncans新復極差法檢驗處理間的差異顯著水平（P<0.05）。

2??結果與分析

2.1??4種原料的理化特性

4種原料的理化性質測定結果表明（表1），4種原料中腐熟雞糞的pH最高，椰糠的pH最低；電導率、全氮含量相差不大，電導率最高和最低的原料分別為秸稈和椰糠，全氮含量的最高為椰糠，其他3種原料的全氮含量相差不大；雞糞的全磷含量、全鉀含量均最高，而椰糠的全磷含量、全鉀含量均較低；秸稈的有機質含量最高，有機質含量最低的原料為雞糞；菌糠的碳氮比最高，最低為腐熟雞糞。腐熟雞糞中氮、磷、鉀總含量高于其他3種原料。

2.2??載體種類及配比對Czk1液體發酵的影響

通過研究菌糠、秸稈、椰糠與雞糞不同配比對Czk1液體發酵的影響，結果表明，添加量＜41%時，隨著菌糠、秸稈添加量的增加，Czk1的活菌數及芽孢數均逐漸增加，但當菌糠、秸稈的添加量≥41%時，發酵后Czk1的活菌數、芽孢數均逐漸減少（圖1A、圖1B）。因此，菌糠和秸稈添加的最適合比例均為38%，在此添加量下Czk1活菌量及芽孢數達最大值。而椰糠的適宜添加量為33%，在此添加量下Czk1活菌量及芽孢數達最大值（圖1C）。與菌糠、秸稈相比，添加椰糠并未顯著促進活菌量及芽孢量的增加，因此，不適宜添加椰糠進行Czk1菌株生物有機肥的發酵。

2.3??Czk1生物有機肥對種子發芽的影響

利用不同堆肥原料制備的Czk1生物有機肥浸出液測定黃瓜種子的發芽指數，結果表明，48?h后，除秸稈添加100%的處理外，其余生物有機肥浸出液的發芽指數均達80%以上（圖2）。秸稈添加比例為100%處理的發芽指數僅60%左右，不利于種子的萌發。

2.4??Czk1固體發酵條件優化

2.4.1??菌糠雞糞堆肥最佳發酵參數篩選??（1）Czk1接種量和黃豆粉添加量的優化。結果如圖3

所示，接種量＜15%時，隨著Czk1接種量的逐漸增大，Czk1活菌數及芽孢數均逐漸增加，但當Czk1接種量為15%時，Czk1活菌數及芽孢數均所下降（圖3A），因此，在菌糠雞糞生物肥發酵中Czk1接種量以10%較適宜。隨著黃豆粉添加量的增加，Czk1活菌數及芽孢數均逐漸增加（圖3B），表明在菌糠雞糞堆肥中最適宜的黃豆粉添加量為10%。

（2）培養溫度、含水量和翻拋時間的正交組合優化。由表2、表3極差分析結果發現，對Czk1總菌數和芽孢數量影響最大的因素為培養溫度，極差分別為3.90和4.32，含水量和翻拋時間的影響較小。在試驗設置的發酵溫度范圍內，當溫度逐漸上升，發酵的菌量和芽孢數量逐漸增高。不同含水量對發酵后Czk1的總菌量和芽孢數均有影響，當溫度在20?℃和30?℃時，低、中含水量間的差異大于中、高含水量間的差異。在翻拋時間上，每24?h翻拋1次的Czk1總菌數和芽孢數均低于其余處理。

Fig.?3??Effects?of?inoculum?dose?of?Czk1?（A）?and?supplementation?of?soybean?powder?（B）?on?the?fermentation?of?chicken?manure?and?mushroom?residue?compost

由表2、表3可以看出，菌糠雞糞堆肥中最佳發酵條件組合為：培養溫度為37?℃，物料含水量為40%，每72?h翻拋1次，發酵后的總菌數為8.63×108?CFU/g，芽孢數為8.37×108?CFU/g。

2.4.2??秸稈雞糞堆肥最佳發酵參數篩選??（1）Czk1接種量和黃豆粉添加量的優化。從圖4可看出，接種量＜15%時，隨著Czk1接種量的逐漸增大，活菌數及芽孢數均逐漸增加，但當接種量為15%時，Czk1活菌數及芽孢數均有所下降（圖4A），因此，在秸稈雞糞生物肥發酵中Czk1菌株的接種量以10%較適宜。隨著黃豆粉添加量的增加，Czk1活菌數及芽孢數均逐漸增加，5%與10%添加量之間差異不顯著（圖4B），為節約成本，在秸稈雞糞堆肥中選擇最適宜的黃豆粉添加量為5%。

（2）培養溫度、含水量和翻拋時間的正交組合優化。由表4、表5的極差分析結果發現，影響Czk1總菌數和芽孢數的主要因素為培養溫度，極差分別為2.81和3.57，含水量和翻拋時間的影響較小。在試驗設置的溫度范圍內，隨著溫度的升高，Czk1活菌數和芽孢數逐漸增大。不同含水量對Czk1總菌數和芽孢數均有一定的影響，除37?℃，溫度在20?℃和30?℃時，低、中含水量間的差異大于中、高含水量間的差異。在翻拋時間因素方面，每72?h翻拋1次發酵后的Czk1總菌數大于其余處理，每48、72?h翻拋1次發酵后的Czk1芽孢數高于每24?h翻拋1次處理。

由表4、表5可知，秸稈雞糞堆肥中最佳發酵條件為：培養溫度為37?℃，物料含水量為40%，每72?h翻拋1次，發酵后的活菌數為6.53×?108?CFU/g，芽孢數為5.97×108?CFU/g。

2.4.3??堆肥輔料配方的優化??（1）添加秸稈對菌糠雞糞肥Czk1發酵的影響。在菌糠雞糞中分別添加0、10%、20%、30%、40%秸稈，于37?℃培養箱中靜置發酵7?d，每72?h翻拋1次。結果表明，隨著秸稈添加量的增加，發酵后的Czk1活菌數及芽孢數均逐漸減少，表明菌糠雞糞發酵中不適宜添加秸稈（圖5A）。

（2）添加菌糠對秸稈雞糞肥Czk1發酵的影響。于秸稈雞糞堆肥中分別添加0、10%、20%、30%、40%菌糠，于37?℃培養箱中靜置發酵7?d，每72?h翻拋1次。結果表明，隨著菌糠添加量的增加，發酵后的Czk1活菌數及芽孢數也隨之增加，但當菌糠添加量超過30%時，發酵后的Czk1活菌數及芽孢數有所減少（圖5B）。因此，添加菌糠比例為30%時，活菌數及芽孢數均達最大。

2.5??Czk1發酵生物有機肥的理化性質

通過測定Czk1發酵生物有機肥的理化性質（表6），結果表明，3種生物有機肥中雞糞菌糠肥的全氮、全磷、全鉀、有機質含量均最高，而雞糞秸稈肥的全氮、全磷、全鉀、有機質含量均最低；雞糞秸稈肥的碳氮比最高，雞糞菌糠肥的碳氮比最低?？傮w而言，3種生物有機肥的理化性質有一定差異，并且3種生物有機肥總養分均在6%以上，均符合生物有機肥的要求。

3??討論

近年來，作為生防產品的枯草芽孢桿菌受到廣泛應用，而隨著使用量和生產量的增大，如何有效提高產品質量、降低生產成本顯得尤為重要。

通過優化培養基配方和培養條件來提高枯草芽孢桿菌的芽孢產量是降低生產成本的重要手段。目前，枯草芽孢桿菌大多采用液體深層發酵來生產液體菌劑，但菌液較難保存，且防效不穩定[30]，而固體菌劑在提供相同菌體數量的同時，還具有運輸方便、貨架期長等特點，微生物在生長過程中產生的代謝物（抑菌物質）也均保存于發酵培養基中，因而固體菌劑的使用效果明顯優于液體菌劑。

固體培養基的配方成分和發酵條件（如發酵溫度、時間、接種量、料水比、碳氮比等）都是影響生物菌量和芽孢形成的重要因素，且不同因素間相互影響。接種量大，菌體的繁殖速度快，亦會增加物料的含水量，從而影響菌體的透氣性，而接種量小，菌體發酵時間較長，會加大污染的風險。物料含水量過高將會影響物料溶氧能力、松散性和散失發酵熱量，但含水量過低會降低溶解能力、影響傳遞和微生物對基質的利用[31-32]。培養溫度過高對微生物會產生有害影響，溫度過低會延長發酵時間。C/N比過高，菌株會因生長緩慢而易被雜菌污染；C/N比過低，微生物會大量生長產生過量的氨，將抑制菌株生長[33]。因此，保證發酵效果的關鍵是摸索出適宜的接種量、發酵溫度和物料含水量等。

本研究中采用以雞糞為底肥的3種肥料原料，其有機質含量、碳氮比均有較大差異，以致Czk1在3種有機肥中的液體發酵效果不同。椰糠有機肥的碳氮比最低，為24.69，其作為發酵基質時，Czk1的活菌數和芽孢數也最低。通過添加輔料可調節物料的碳氮比、含水量和孔隙度[34-35]。因此，本研究通過添加黃豆粉來調節碳氮比，不同用量的黃豆粉會對發酵有明顯影響，研究得出黃豆粉最佳添加量為10%。另外，為了調節發酵原料的碳氮比和有機質，還進行了3種有機肥不同原料配比的優化試驗，研究表明，未添加黃豆粉，混合較單一的有機肥更利于Czk1菌株的生長繁殖，生產獲得高質量微生物有機肥。

種子發芽指數（GI）是通過測定植物毒性來判斷堆肥腐熟度的指標。通常GI>60%，基本腐熟；GI>80%，完全腐熟[34]。在本研究中，通過檢測不同配比的Czk1生物有機肥浸提液對黃瓜種子發芽的影響結果顯示，48?h后，除添加100%秸稈處理的種子發芽率僅60%毒性相對較大外，其余生物有機肥發酵后浸出液的種子發芽率均達到80%以上。綜上表明，農業廢棄物通過選擇適宜的工藝條件制備高質量的生物有機肥是完全可行的。

本研究表明，Czk1固體發酵的最佳條件：以菌糠雞糞堆肥為發酵原料，添加10%黃豆粉，Czk1接種量10%，含水量為40%，發酵溫度為37?℃，每72?h翻拋1次，發酵后Czk1活菌數為8.63×108?CFU/g，芽孢數為8.37×108?CFU/g；以秸稈雞糞堆肥為發酵原料，添加5%黃豆粉，Czk1接種量10%，含水量為40%，發酵溫度為37?℃，每72?h翻拋1次，發酵后Czk1活菌數為6.53×108?CFU/g，芽孢數為5.97×108?CFU/g；在以上配方下添加30%菌糠，發酵后Czk1活菌數及芽孢數分別可達到8.70×?108、6.90×108?CFU/g。這一研究結果與柳芳[36]利用枯草芽孢桿菌SQR9發酵菜粕堆肥的培養條件基本一致，但柳芳在豬糞堆肥、牛糞堆肥和中藥渣堆肥發酵中的含水量和翻拋時間與本研究有較大差異，究其原因可能是不同的畜禽糞便特性不同，以致研制生物有機肥的條件有可能存在差異[29，?36]。目前，本研究僅在小瓶量培養水平上開展枯草芽孢桿菌Czk1的固體發酵工藝研究，要實現產業化開發應用，還有待開展該菌劑的田間應用及固體反應器條件的放大試驗。

參考文獻

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