具有表面微孔的3D打印PCL網狀支架的制備及性能

郭芳，曾輝，劉寧，黃碩，郭亞媛，劉昌奎

(西安醫學院口腔醫學院牙頜面組織再生與修復研究中心，西安 710021)

三維支架或骨移植物是骨組織工程的重要組成部分，它們為細胞附著和增殖、蛋白質生產和骨組織再生提供了機械支持和仿生環境[1]。聚己內酯(PCL)是一種人工合成高分子有機化合物，經美國食品藥品監督管理局批準，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且易成型[2-3]，但其本身不具有生物活性，且表面光滑、疏水性強，如果作為植入物使用，其表面不具有利于細胞生長的物理、生理特性。盡管3D打印技術在實現骨移植物制造的復雜幾何形狀方面取得了成功[4-5]，但在植入物-生物表面方面仍不夠理想。而材料的親疏水性，對其潤濕性、生物相容性等方面起到非常重要的作用，PCL的化學惰性以及低的表面能導致其與生物表面的相互作用不足[6]，而成骨細胞更喜歡黏附在粗糙材料的表面[7]。近年來的研究證實[8-9]，表面形貌的改變，直接影響依附于支架生長的細胞增殖分化行為，表面粗糙的多孔支架對于細胞成骨分化具有促進作用。

已有學者采用通過蛋白質涂層、等離子體等技術改善骨組織工程親水性的策略[10]。然而綜合時間成本、技術復雜程度、設備經費等問題，開發一種簡單的、能夠有效改善3D打印PCL骨組織工程支架親水性的方法是十分必要的。據報道，用堿性溶液水解聚合物材料表面可以改善細胞的表面性能，從而更好地促進細胞附著和增殖[11]。Gao等[12]對聚乙醇酸納米纖維進行氫氧化鈉(NaOH)處理，結果顯示，纖維直徑隨著處理時間的增加而減小，纖維保持了完整的纖維網狀結構，改善了血管平滑肌細胞的附著。梅倩倩等[13]為了優化PCL納米纖維膜的蛋白吸附性能，利用乙醇和NaOH對其進行改性處理，結果顯示改性處理提升了PCL納米纖維膜的蛋白吸附能力。由此可見，使用NaOH處理3D打印PCL骨組織工程支架，對于改善支架表面微形貌具有重要的意義。筆者為了系統研究NaOH處理對3D打印PCL網狀支架表面孔隙生成過程的影響，共采用了25組濃度和時間的參數組合，這些參數組合涵蓋了從溫和至極強處理的范圍。研究了不同反應參數組合對PCL網狀支架表面孔隙生成及其親水性的影響，檢測分析3D打印PCL網狀支架經過NaOH誘導蝕刻后在微觀形貌、能譜元素、親水性、強度、細胞附著等方面的變化，優化反應參數，在強度損失更小的情況下獲得最理想的NaOH處理反應參數，為改善3D打印PCL網狀支架表面親水性及細胞反應提供借鑒和參考。

1 實驗部分

1.1 主要原材料

PCL：PCL-05，吉林省科瑞斯生物科技有限公司；

NaOH：分析純，純度≥96%，國藥集團化學試劑有限公司；

胎牛血清：美國Gibco公司；

青霉素、鏈霉素、DMEM/F12培養基：美國Hyclone公司。

1.2 主要儀器和設備

3D打印機：Professor 300，陜西聚康高博醫療科技有限公司；

掃描電子顯微鏡(SEM)：Sigma 300，德國ZEISS公司；

離子濺射鍍膜儀：SC7620，英國Quorum公司；

能量色散X射線光譜儀(EDX)：Oxford Xplore 30，英國牛津公司；

接觸角測量儀：OCA20，德國Dataphysics公司；

電動液壓伺服機械測試機：SANS CMT4304，美國MTS公司。

1.3 3D打印PCL網狀支架的制備及NaOH處理

PCL網狀支架采用熔融沉積成型(FDM)打印方法進行制備。支架設計及打印參數如下：孔徑為500 μm，絲徑為400 μm，打印速度為20 mm/s，層層纖維夾角為90°，噴嘴溫度為80 ℃，平鋪掃描。3D打印PCL網狀支架如圖1所示。

圖1 3D打印PCL網狀支架外觀及SEM表面微觀結構Fig. 1 3D printed PCL mesh scaffold appearance and SEM surface microstructure

利用NaOH溶液對支架表面進行刻蝕處理，為了系統地研究孔隙生成過程，對支架從溫和至極強進行處理。實驗分為兩組：未處理組、處理組。處理組用去離子水清洗后加入不同濃度的NaOH溶液，將樣件固定在室溫下不同時間進行處理，處理完成后取出支架，流水徹底沖洗12 h，再用去離子水離心清洗3次，然后在37 ℃烘箱內烘干。NaOH溶液的濃度分別為0.5，1，5，10，15 mol/L，處理時間分別為1，6，12，24，48 h。

1.4 測試與表征

1.4.1 SEM與EDX表征

使用SEM對處理組及未處理組PCL網狀支架的表面形貌進行觀察。將未經過刻蝕和不同條件下刻蝕的PCL網狀支架粘在樣品臺的導電膠上，經濺射鍍膜儀噴金處理后使用SEM拍攝樣品形貌，同時使用EDX觀察和測試NaOH處理后未徹底清洗的PCL網狀支架表面。采用SEM拍攝形貌時加速電壓為3 kV，采用EDX測試時加速電壓為15 kV，探測器為SE2二次電子探測器。

1.4.2 接觸角測試

采用FDM打印10 mm×10 mm×3 mm實體塊材，按上述方法進行NaOH處理，置于接觸角測量儀測試平臺，利用設備自動滴定系統滴上水滴，拍攝測試照片，用量角法量取接觸角角度，每個測量3個平行樣件。

1.4.3 壓縮性能測試

參照GB/T 1041-2008進行單軸壓縮試驗，樣件尺寸為10 mm×10 mm×4 mm，測試25%應變對應的壓縮強度，使用電動液壓伺服機械測試機以1 mm/min壓縮速率對未處理組及處理組支架進行壓縮性能測試，每組測試3個樣本。

1.4.4 支架表面細胞形態學觀察

使用的SD大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)為本實驗室凍存，采用含體積分數10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養基在37 ℃，5% CO2培養箱中培養BMSCs，待BMSCs貼壁生長至細胞密度70%～80%融合狀態時傳代，筆者采用3～5代BMSCs進行后續試驗。將60Co輻照滅菌的未處理組、處理組PCL網狀支架(尺寸為10 mm×10 mm×3 mm)放入24孔板內，每組3個復孔。將BMSCs細胞以5×104個/mL的密度滴種于支架表面，在37 ℃的CO2孵箱內孵育6，24 h后，移除培養基，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后用2.5%戊二醛固定細胞1 h，然后無水乙醇梯度脫水。樣品噴金后以SEM觀察細胞在微結構上的黏附以及黏附的形態。

1.4.5 統計學分析

采用SPSS13.0軟件，應用單因素方差分析法(One-way ANOVE)進行均數比較，各組數據均用均數±標準差表示，對比處理組與未處理組PCL網狀支架的親水性和力學差異，p＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 NaOH處理對3D打印PCL網狀支架表面形貌的影響

利用SEM觀察NaOH濃度和反應時間對3D打印PCL網狀支架表面粗糙度的影響，為了系統地研究孔隙生成過程，共采用了25種濃度和時間的組合，從極溫和到極強處理，限于篇幅，只進一步討論和分析具有代表性的表面形貌及其對應的參數組合，如圖2所示。未處理組支架表面光滑(這可以從圖1b和圖1c看出)，而從圖2可以看出，3D打印PCL網狀支架經不同NaOH反應參數處理后主要產生了3種類型的表面形態：第1種是溫和處理形成的褶皺表面(圖2a～圖2c)；第2種是較強處理形成的粗糙表面(圖2d～圖2f)；第3種是NaOH處理強度進一步增加后形成凹坑和孔洞(圖2g～圖2i)。結果表明在較低的NaOH濃度下，NaOH針均勻地分散在PCL的表面，表面的起伏較為均勻；隨著NaOH濃度的增加，起伏增加，在高濃度下，它們聚集并形成針簇，從而形成更大的孔隙。與Wang等[14]報道較為一致，NaOH處理板材表面粗糙，隨著NaOH濃度增加表面形成小孔。

圖2 不同NaOH溶液濃度和處理時間的3D打印PCL網狀支架蝕刻后表面形態Fig. 2 Surface morphology formed after etching of the 3D printed PCL mesh scaffolds with different NaOH solution concentrations and treating times

PCL網狀支架的表面改性是通過兩種途徑形成的：一是PCL主鏈上的酯鍵發生皂化反應，其中NaOH中的氫氧根離子破壞PCL的主鏈，形成羥基和羧基，這些官能團與水相互作用，從而增強了材料的親水性；二是溶液中NaOH以針、束狀晶體的形式被固定在聚合物表面(圖3a)，其可蝕刻PCL支架的表面，從而產生凹坑和孔洞。為證實這些晶體的組成，通過EDX對PCL網狀支架進行表征，發現晶體含有Na，O兩種元素，可證實其為NaOH晶體(圖3b、圖3c)。此外，由于NaOH晶體聚集在蝕刻材料表面，因此在進行任何表征方法之前都需要徹底清洗支架。

圖3 3D打印PCL網狀支架的SEM和EDX分析Fig. 3 SEM and EDX analysis of 3D printed PCL mesh scaffold

2.2 NaOH處理對3D打印PCL網狀支架親水性的影響

微結構的粗糙度和接觸角的改變可影響材料表面的潤濕性，從而影響材料表面蛋白的黏附，進而影響細胞的黏附[15-17]。材料表面粗糙度會影響細胞的增殖和分化[18-20]。根據蝕刻后SEM分類結果，只進一步討論了以下5種處理反應參數組合制備的PCL支架的親水性和力學性能：5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h，10 mol/L-12 h，10 mol/L-24 h，15 mol/L-24 h。未處理組及處理組PCL網狀支架接觸角變化如圖4所示，相應接觸角大小見表1。由圖4和表1看出，經NaOH處理后的各組支架表面接觸角均顯著低于未處理組(F=271.591，p＜0.001)，處理組中NaOH反應參數組合為5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h，10 mol/L-12 h的組間無差異(p＞0.05)，其余組間差異均有統計學意義(p＜0.05)；PCL網狀支架未處理組接觸角為101.53°±1.71°，處理組中以15 mol/L NaOH處理24 h組的接觸角度數最低(43.67°±1.95°)。結果表明，堿處理組PCL網狀支架材料的接觸角較對照組均顯著降低。根據潤濕性的定義，接觸角在＞90°(或＜90°)時，材料表現為疏水性(或親水性)。當接觸角為65°時，材料表面最有利于成骨細胞的黏附[21]，大于或小于65°都會導致細胞的黏附能力降低。由測試結果可知，處理組支架均表現為親水性增強，其中10 mol/L-6 h處理支架的接觸角為62.80°±1.85°，最接近65°。

表1 未處理及經5種反應參數組合的NaOH處理后PCL網狀支架表面接觸角數據Tab. 1 Surface contact angle data of PCL mesh scaffolds without treatment and after NaOH treatment with five parameter combinations

圖4 未處理及經5種反應參數組合的NaOH處理后PCL網狀支架表面接觸角的變化Fig. 4 Changes in surface contact angle of PCL mesh scaffolds without treatment and after NaOH treatment with five parameter combinations

2.3 NaOH處理對3D打印PCL網狀支架壓縮強度的影響

理想的支架材料強度要適中，能夠承受得住生理壓力，為新生的組織提供較好的力學支撐。未處理及處理組(NaOH反應參數組合：5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h，10 mol/L-12 h，10 mol/L-24 h，15 mol/L-24 h)PCL網狀支架壓縮強度的變化如圖5所示。圖5結果顯示，與未處理組壓縮強度相比，NaOH處理參數為5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h的支架的差異沒有統計學意義(p＞0.05)；NaOH處理參數為10 mol/L-12 h，10 mol/L-24 h，15 mol/L-24 h的支架的差異具有統計學意義(p＜0.001)。

圖5 經不同反應參數組合的NaOH處理后PCL網狀支架壓縮強度的變化Fig. 5 Changes in compressive strength of PCL mesh scaffolds after NaOH treatment with different reaction parameter combinations

壓縮試驗結果表明，支架強度隨著NaOH處理強度的增加而不斷降低，經5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h NaOH處理后支架的壓縮強度分別為(11±1)MPa和(11.33±1.53) MPa，在松質骨抗壓強度范圍內，滿足骨組織工程支架力學要求。同時，試驗發現，兩組支架在壓縮過程中均沒有發生碎裂，顯示出較好的韌性。

2.4 NaOH處理對3D打印PCL網狀支架細胞黏附情況的影響

Voisin等[22]發現表面粗糙度的增加可引發細胞的早期成熟，以絲狀偽足延伸的形式可見。為了進一步研究細胞在蝕刻PCL網狀支架表面微結構上的黏附以及黏附的形態，觀察細胞接種后6，12 h與底物立即相互作用后的細胞反應。結合親水性和壓縮試驗結果，選擇NaOH處理參數組合為10 mol/L-6 h的處理支架進行細胞黏附試驗。圖6的SEM結果顯示了細胞黏附在未處理及處理組(10 mol/L-6 h)網狀支架表面的形態差異。由圖6可以看出，接種細胞6 h后，在未處理組PCL支架表面觀察到細胞產生細胞質片狀結構，纖維狀突起較少；而在NaOH處理組支架表面，細胞產生絲狀延伸，錨定在粗糙表面的凸起和凹陷內，即NaOH蝕刻后支架黏附細胞伸出的突觸更多(圖6b)。接種細胞12 h后黏附的“接觸誘導”效應更為明顯，呈現“拉伸”狀態(圖6d)；與處理組對比，未處理支架上的細胞數目少、細胞鋪展面積小。通過SEM觀察可得出堿蝕刻促進了黏附細胞在支架上的伸展，這一結果和文獻[22]的結果一致。

圖6 未處理組及處理組PCL網狀支架在大鼠BMSCs細胞接種6，12 h后材料表面細胞黏附情況Fig. 6 Cell adhesion on material surface of untreated and treated PCL mesh scaffolds after 6，12 h of cell inoculation with rat BMSCs cells

3 結論

(1)不同NaOH反應參數組合處理3D打印PCL網狀支架可有效改善其表面微形貌，主要產生了3種類型的表面形貌特征：一是溫和處理條件下形成的褶皺表面；二是較強處理形成的粗糙表面；三是NaOH處理強度進一步增加時形成的凹坑和孔洞。

(2)不同NaOH反應參數組合處理后，支架親水性相較于未處理組顯著增加，但支架壓縮強度隨著NaOH處理強度的增加而降低。

(3) NaOH處理3D打印PCL網狀支架可有效改善細胞反應。NaOH最適宜的處理反應參數組合為10 mol/L-6 h，支架顯示較佳的親水性且壓縮強度損失最小，增加了黏附細胞的數量，促進了黏附細胞的伸展。