LncRNA HAGLR靶向miR-625-5p對脂多糖誘導的視網膜色素上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響△

李 晶 曾衛娟

視網膜色素上皮(RPE)細胞處于神經視網膜、脈絡膜之間,可維持光感受器存活、視網膜內環境穩定,參與血-視網膜屏障、黃斑免疫防御等,其病變可引起年齡相關性黃斑變性等視網膜病[1-2]。因而明確RPE細胞損傷機制,有助于保護視網膜功能,以防視網膜疾病發生發展。長鏈非編碼RNA(LncRNA)可通過染色體重塑、轉錄后加工等方式調節基因表達,其差異表達可調控眼部疾病發生發展。研究發現,LncRNA可調節RPE細胞生理功能,影響視網膜疾病發展進程[3-4]。LncRNA HAGLR可與內源性RNA競爭性結合微小RNA(miRNA),在炎癥反應、心肌細胞凋亡等過程中發揮調控作用[5]。但LncRNA HAGLR與視網膜病變相關研究報道相對較少。StarBase預測顯示,LncRNA HAGLR與微小RNA-625-5p(miR-625-5p)存在結合位點。但關于miR-625-5p對RPE細胞損傷的研究報道較少。因此,本研究旨在探討LncRNA HAGLR是否可通過靶向調控miR-625-5p表達參與RPE細胞損傷過程,為揭示視網膜病變機制及臨床治療奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)購自上海啟達生物公司;脂多糖(LPS)購自上海碧云天生物公司;陰性對照(sh-NC)、HAGLR慢病毒短發夾RNA(sh-HAGLR)、陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-625-5p寡核苷酸模擬物(miR-625-5p mimics)、特異性寡核苷酸抑制劑陰性對照(anti-miR-NC)、miR-625-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-625-5p)購自廣州銳博生物公司;pcDNA、pcDNA-HAGLR購自上海吉瑪生物公司;雙熒光素酶活性檢測試劑盒、野生型載體(WT-HAGLR)、突變型載體(MUT-HAGLR)購自美國Promega公司;Trizol試劑、轉染試劑LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen公司;反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化公司;凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解液購自江蘇凱基生物公司;白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒購自上海酶研生物公司;兔抗人活化的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cleaved-Caspase 3)抗體、兔抗人活化的cleaved-Caspase 9抗體、內參GAPDH、二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

ARPE-19細胞采用含有體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基培養,取對數生長期細胞接種于24孔板(每孔2×105個),加入10 mg·L-1LPS孵育24 h[6],記為LPS組。設置正常培養的ARPE-19細胞作為Con組。采用脂質體轉染法將sh-NC、sh-HAGLR、miR-NC、miR-625-5p mimics、sh-HAGLR+anti-miR-NC、sh-HAGLR+anti-miR-625-5p分別轉染至ARPE-19細胞,用10 mg·L-1LPS孵育24 h,依次分別記為LPS+sh-NC組、LPS+sh-HAGLR組、LPS+miR-NC組、LPS+miR-625-5p組、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC組、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p組,各組處理完成后收集細胞并進行后續實驗。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應

收集各組ARPE-19細胞后采用Trizol試劑提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA,采用試劑盒標準三步法進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)擴增,LncRNA HAGLR以GAPDH為內參,miR-625-5p以U6為內參,采用相對定量法2-ΔΔCt計算。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率

取各組ARPE-19細胞加入預冷PBS洗滌,之后加入500 μL Binding Buffer懸浮液,4 ℃條件下細胞懸液轉移至EP管,經1 500 r·min-1離心5 min,PBS洗滌2次,加入200 μL結合緩沖液,加入5 μL Annexin V-FITC,振蕩混勻,室溫避光孵育15 min,加入10 μL PI染色液,振蕩混勻,室溫避光孵育10 min,加入400 μL結合緩沖液,渦旋振蕩器中持續振蕩10 min,過濾,應用流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4 ELISA法檢測炎癥因子水平

收集各組ARPE-19細胞(4×105個·mL-1),取細胞懸液加入24孔板(每孔500 μL),經3 000 r·min-1離心10 min后取上清液,采用ELISA法檢測IL-6、IL-1β水平:收集各組細胞培養基,從冰箱中取出ELISA試劑盒,若試劑盒內洗滌液出現結晶吸出,需放入恒溫水浴鍋內溶解,取細胞培養于室溫條件,經2 000 r·min-1離心20 min,IL-6標準品稀釋濃度:240、160、80、40、20、0 ng·L-1,IL-1β標準品稀釋濃度:120、80、40、20、10、0 ng·L-1,設置不加樣品孔與酶標試劑的空白對照孔,待測樣品孔內加入樣品稀釋液40 μL、上清液10 μL,水浴鍋升溫至37 ℃,酶標板封板,置于37 ℃水浴鍋內孵育30 min后檢測。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗

采用StarBase預測顯示LncRNA HAGLR、miR-625-5p存在結合位點,以結合位點為模板進行擴增,插入pmirGLO載體,分別構建WT-HAGLR、MUT-HAGLR,同時取對數生長期ARPE-19細胞接種于24孔板,將上述載體分別與miR-NC或miR-625-5p mimics共轉染至ARPE-19細胞,48 h后收集細胞并檢測熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot檢測cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白表達水平

收集各組ARPE-19細胞加入RIPA裂解液,冰上孵育30 min后離心取上清,采用BCA法檢測蛋白濃度,蛋白變性5 min后行SDS-PAGE凝膠分離,轉膜后采用脫脂奶粉(37 ℃)封閉90 min,加入cleaved-Caspase 3(1800)、cleaved-Caspase 9(1800)一抗、內參GAPDH抗體(11 000)稀釋液在 4 ℃ 條件下孵育過夜,次日加入二抗稀釋液(15 000)后室溫下孵育90 min,顯色曝光后應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 LncRNA HAGLR和miR-625-5p在LPS誘導的ARPE-19細胞中的表達

Con組、LPS組LncRNA HAGLR表達水平分別為1.00±0.00、3.71±0.29,miR-625-5p表達水平分別為1.00±0.00、0.42±0.05,與Con組比較,LPS組LncRNA HAGLR表達水平升高,miR-625-5p表達水平降低(均為P<0.05)。

2.2 干擾LncRNA HAGLR表達對LPS誘導的ARPE-19細胞損傷的影響

Con組、LPS組、LPS+sh-NC組、LPS+sh-HAGLR組細胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平差異均有統計學意義(均為P<0.05)。與Con組比較,LPS組細胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均升高(均為P<0.05)。與LPS+sh-NC組比較,LPS+sh-HAGLR組細胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均降低(均為P<0.05)(表1)。

表1 LncRNA HAGLR對ARPE-19細胞損傷的影響

2.3 LncRNA HAGLR靶向調控miR-625-5p的表達

LncRNA HAGLR基因序列上存在miR-625-5p結合位點(圖1)。miR-NC、miR-625-5p mimics與WT-HAGLR共轉染后熒光素酶活性分別為1.08±0.07、0.34±0.04,miR-NC、miR-625-5p mimics與MUT-HAGLR共轉染后熒光素酶活性分別為1.06±0.09、1.04±0.08。與miR-NC、WT-HAGLR共轉染相比,miR-625-5p mimics、WT-HAGLR共轉染后熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)。與miR-NC、MUT-HAGLR共轉染相比,miR-625-5p mimics與MUT-HAGLR共轉染后熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。LncRNA HAGLR可負向調控miR-625-5p表達(P<0.05)(表2)。

圖1 LncRNA HAGLR的序列中含有與miR-625-5p互補的核苷酸序列

表2 LncRNA HAGLR調控miR-625-5p的表達

2.4 miR-625-5p過表達對LPS誘導的ARPE-19細胞損傷的影響

與LPS+miR-NC組比較,LPS+miR-625-5p組miR-625-5p表達水平升高,細胞凋亡率及cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均降低(均為P<0.05)(表3)。

表3 miR-625-5p對ARPE-19細胞損傷的影響

2.5 下調miR-625-5p表達可逆轉干擾LncRNA HAGLR表達對LPS誘導的ARPE-19細胞損傷的影響

與LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC組比較,LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p組miR-625-5p表達水平降低,細胞凋亡率及cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均升高(均為P<0.05)(表4)。

表4 sh-HAGLR與anti-miR-NC共轉染對ARPE-19細胞損傷的影響

3 討論

視網膜病變機制可能與炎癥、氧化應激等有關,ARPE細胞炎癥損傷可降低其吞噬功能,促使未消化碎片處于胞漿內,并沉積于基底膜、Bruch膜后形成玻璃膜疣,促使新生血管形成,進而發展為視網膜病變,LPS可作為視網膜病變炎癥細胞模型的刺激物[7]。因而本研究選用LPS構建ARPE-19細胞損傷模型。既往研究顯示,LncRNA在LPS誘導的ARPE細胞損傷中可發揮調控作用,并可參與年齡相關性黃斑變性等視網膜病變發生發展過程[8]。

目前LncRNA HAGLR在LPS誘導的ARPE-19細胞中表達趨勢尚未明確,本研究結果顯示,LPS誘導的ARPE-19細胞中LncRNA HAGLR表達水平升高。既往研究表明,LncRNA HAGLR在LPS誘導的神經細胞中表達上調,敲低其表達可抑制LPS誘導的神經細胞炎癥、神經元凋亡,并可靶向調節miR-182-5p/ATAT1表達,而ATAT1又可激活NLRP3炎癥小體加重神經細胞損傷[9]。LncRNA HAGLR可靶向調控miR-130a-3p表達促進IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡,沉默其表達可抑制炎癥因子分泌,減少細胞凋亡,減輕軟骨細胞炎癥損傷,而miR-130a-3p可直接靶向JAK1參與軟骨細胞損傷過程[10]。LncRNA HAGLR可調節miR-204/CDK5R1表達促進周圍神經損傷[11]。由此推測,LncRNA HAGLR表達水平升高可能引起組織或細胞損傷。同時本研究發現,LPS處理后細胞凋亡率及cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平升高,與既往研究結果類似[12]。Caspase在細胞凋亡信號轉導中發揮調節作用,線粒體膜電位變化可促進細胞色素C釋放至細胞質,激活Caspase 9、Caspase 3,導致細胞凋亡[13]。本研究結果表明,干擾LncRNA HAGLR表達后細胞凋亡率降低,通過對凋亡蛋白研究,證實LncRNA HAGLR具有促凋亡作用,提示LncRNA HAGLR可能作為視網膜病變臨床治療的潛在靶點。炎癥反應與視網膜病變發生發展密切相關,而ARPE-19細胞受到外界刺激后可產生多種炎癥因子,可激活Caspase途徑,促使細胞凋亡[14]。本研究選取檢測LncRNA HAGLR對LPS誘導的ARPE-19細胞外分泌炎癥因子IL-6、IL-1β水平變化,用于判別LncRNA HAGLR是否可通過調節炎癥因子形成以調節炎癥反應,結果發現,LPS誘導的ARPE-19細胞中IL-6、IL-1β水平升高,而干擾LncRNA HAGLR后IL-6、IL-1β水平降低,提示干擾LncRNA HAGLR表達可抑制炎癥因子分泌,阻斷炎癥反應相關ARPE-19細胞凋亡。其作用機制可能與LncRNA HAGLR調節miR-182-5p/ATAT1、miR-130a-3p/JAK1、miR-204/CDK5R1表達有關。

本研究證實LncRNA HAGLR可靶向結合miR-625-5p,并負向調控miR-625-5p表達,這也是本研究創新之處。miR-625-5p在LPS誘導的急性肺損傷模型中呈低表達,上調其表達可抑制NF-κB p65蛋白表達,發揮抗炎作用,以減輕急性肺損傷[15-16]。本研究結果顯示,LPS誘導的ARPE-19細胞中miR-625-5p表達水平降低,提示miR-625-5p水平降低可能促進ARPE-19細胞損傷。由此推測,miR-625-5p水平降低可促進炎癥因子釋放,加重LPS誘導的ARPE-19細胞損傷。本研究進一步分析發現,miR-625-5p過表達可抑制細胞凋亡、炎癥因子分泌,而下調其表達可減弱干擾LncRNA HAGLR表達對ARPE-19細胞的損傷作用,提示LncRNA HAGLR可能通過靶向調控miR-625-5p表達參與LPS誘導的ARPE-19細胞損傷過程。

4 結論

LPS誘導的ARPE-19細胞中LncRNA HAGLR表達上調,miR-625-5p表達下調,干擾LncRNA HAGLR表達可通過靶向調節miR-625-5p表達,降低細胞凋亡率、炎癥因子表達水平,進而減輕ARPE-19細胞損傷,但關于miR-625-5p是如何調控下游靶基因表達尚需進一步探究。