漆酶-原兒茶醛交聯魚皮膠原蛋白水凝膠的研究

楊長凱，李國英＊

（1.四川大學皮革化學與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065；2.四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都 610065）

引言

水凝膠具有類似細胞外基質（ECM）的親水三維網絡結構，為傷口提供透氣和濕潤的環境，優化傷口床的炎癥微環境，成為了當前的研究熱點[1-2]。膠原蛋白（COL）是一種具有良好生物相容性和生物降解性的可再生生物質資源[2-3]，其來源豐富易得，可以從牛[4]，豬[5]和魚[6]的皮膚組織結構中提取。與哺乳動物COL 相比，魚皮COL 作為一種可再生的COL 資源，并未受到克雅氏病和牛海綿狀腦病流行的限制，從而受到科研人員的重視[7]。然而，魚皮COL 在使用過程中仍然受到了一定的局限，如熱穩定性低，變性溫度遠低于37 ℃，力學性能相對較差，更加容易降解[8]。酶法交聯因具有反應條件溫和、不產生副產物、高特異性以及無毒性的特點在制備COL 水凝膠中備受青睞。

漆酶（LAC，EC 1.10.3.2）是一種多銅的氧化酶，各種酚類、非酚類芳香族化合物和酪氨酸殘基可以作為底物被催化，形成自由基，進而導致其他非酶促次級反應如羥化、歧化和聚合等反應[9-10]。眾所周知，膠原的氨基酸序列中存在酪氨酸（Tyr）殘基，一種含有酚羥基的芳香族極性α-氨基酸，這為LAC催化交聯COL 奠定了基礎[11]。然而，膠原分子的三螺旋結構造成的空間阻礙作用會在一定程度影響LAC 的可及性，從而弱化了LAC 對膠原分子的交聯作用。研究表明，LAC 的交聯效應可以通過添加一種小分子酚類物質來增強[12]。原兒茶醛（PAL；3,4-二羥基苯甲醛）是一種從草藥丹參的根部獲得且含有兒茶酚結構的小分子酚類物質，具有良好的生物相容性，已被作為一種潛在的天然生物交聯劑用于膠原基生物材料。例如，以高碘酸鈉作為氧化劑，通過PAL 與膠原分子之間的氨基交聯得到了穩定的膠原水凝膠[13]。另一項研究中，PAL 首先可以通過醛基和氨基的反應與脫細胞的豬心包進行結合，隨后利用PAL 分子的酚羥基與過硫酸銨之間的氧化還原反應產生交聯，以進一步提高生物假體心臟瓣膜的性能[14]。因此，PAL 具備作為增強LAC 交聯效應的小分子酚類物質來構建膠原生物醫用水凝膠的潛力。

本文通過漆酶、原兒茶醛和膠原之間的交聯作用獲得膠原基水凝膠，表征了其微觀結構、物理性質和力學性能，探討了PAL 參與下LAC 交聯膠原的作用機理和對水凝膠性能的影響。

1 實驗部分

1.1 主要材料與試劑

白鰱魚皮COL，按照Zhang 等人[15]的方法提??；PAL（純度≥98%），上海綠葉有限公司；醋酸，分析純，成都科隆化學品有限公司；LAC（來自Trametesversicolor），上海源葉生物技術有限公司；I 型膠原酶，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 膠原水凝膠的制備

COL 被溶解在0.1 mol/mL 醋酸溶液中，質量濃度為5 mg/mL。LAC 被溶解在去離子水中并進行離心，過濾獲得澄清透明的LAC 溶液，濃度為5 U/mL。將膠原氨基和PAL 按照一定的物質的量比（1∶0，1∶0.5，1∶1，1∶2）進行混合,調節pH 值至5.0，并攪拌24 h 后，加入LAC 溶液，攪拌均勻，利用8 mol/mL NaOH 調節混合溶液的pH 值至（5.0±0.2），最終獲得凝膠原液，并倒入12 孔板模具成膠。所有操作均在冰水浴條件下進行，各組凝膠最終組份濃度如表1 所示。對獲得的水凝膠依次命名為：COL-LAC、COL-PAL1 -LAC、COL-PAL2 -LAC、COL-PAL3-LAC。

表1 COL-PAL-LAC 水凝膠組分濃度Tab.1 Components and their concentrations of COL-PAL-LAC hydrogels

1.3 測試方法

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

采用溴化鉀壓片法，使用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet IS 10，美國賽默飛）對樣品進行掃描，設置范圍參數4 000～650 cm-1，分辨率為2 cm-1，平均進行掃描32 次。

1.3.2 X 射線光電子能譜（XPS）

通過XPS（K-Alpha，美國賽默飛）對COL 和凍干后的COL-LAC，COL-PAL1-LAC 凝膠樣品進行掃描分析，并利用Avantang 軟件對掃描結果進行處理。

1.3.3 掃描電子顯微鏡（SEM）

使用SEM（Apreo 2C，美國賽默飛）觀察各組水凝膠的橫截面形貌，用液氮脆斷凍干的凝膠，并固定在導電膠表面，噴金，在5 kV 的加速電壓下進行測試。

1.3.4 流變學測量

水凝膠的流變測量由流變儀（MCR 302，德國安東帕）評估，包括儲存模量（G'）和損失模量（G''）。水凝膠的動態頻率在20 ℃下從0.01 Hz 到10 Hz 變化，線性區域內的恒定應變為5%。

1.3.5 壓縮性能測試

使用萬能試驗機（UTM 2102，中國三思縱橫）以每分鐘2 mm 的恒定應變速度和0%～70%應變范圍來評估水凝膠的強度。壓縮模量由低應變下的應力-應變曲線斜率獲得。每個樣品進行3 次平行實驗，取平均值。

1.3.6 熱重分析（TG）

凍干水凝膠的熱降解是使用熱重分析儀（TG 209F1，德國耐馳）進行。將大約3～5 mg 的凍干水凝膠進行50～800 ℃的加熱，加熱速度恒定為10 ℃/min，氮氣作為保護氣體。

1.3.7 體外的酶促降解

I 型膠原蛋白酶溶解在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）中，溶液的最終濃度為1 U/mL。凍干的凝膠樣品（M0）在37 ℃下與I 型膠原酶溶液孵化。樣品以3 mL/mg 樣品的體積進行孵化，每隔一天更換一次酶溶液。然后在第1、2、4 和7 天收集樣品。每組樣品用PBS 溶液洗三次，用去離子水清洗三次，然后凍干后稱量（M1）。耐酶降解率根據公式（1）計算：

2 結果與分析

2.1 FTIR 分析

原分子的三股螺旋結構通常通過計算酰胺III 帶和1 450 cm-1處的吸光度比值AIII/A1450來驗證其完整性。COL-LAC、COL-PAL1-LAC、COL-PAL2-LAC和COL- PAL3- LAC 凝膠的AIII/A1450比值分別為0.96，0.95，1.00 和0.93，均大于膠原變性產物明膠的0.59[18]，說明各組凝膠中膠原結構穩定。這表明LAC-PAL 催化交聯作用溫和，并未破壞膠原結構。

圖1 各組凝膠的FTIR 譜圖Fig.1 FTIR spectra of the prepared hydrogels

2.2 XPS 分析

為了研究凝膠機理，對COL、COL-LAC、COL-PAL1-LAC 進行XPS 分析。圖2a 為凝膠全譜分析圖，在532.08、400.08 和285.08 ev 分別歸屬于O 1S、N 1S 和C 1S。我們進一步對每組凝膠的C 1S 進行了分封擬合分析。圖2b 為COL 的C 1S圖譜，在283.98、285.18 和287.08 ev 出現的特征峰，可分別歸屬于C-H/C-C、C-N/C-O 和COOH[19]。圖2c 為COL-LAC 的C 1S 圖譜，在284.88、286.28 和288.08 ev 處的典型特征峰可分配給C-C/C-H、C-N/C-O 和COOH。顯而易見，COL-LAC 的C 1S 圖譜在288.98 ev 出現了新的特征峰，可歸屬于C=O，這可能是由于膠原分子鏈中的Tyr 殘基被LAC 氧化形成了醌活性基團。 通過進一步分析COL-PAL1-LAC 的C 1S 圖譜（圖2d） 并與COL-LAC 對比發現，歸屬于C-N/C-O 的峰形變得尖銳，這可能PAL 的大量引入導致的。綜上所述，在LAC 作用下，PAL 的酚羥基被氧化成醌自由基，從而可能與膠原的氨基、Tyr 殘基或者PAL 分子之間發生邁克爾加成反應或席夫堿反應。COL-LAC凝膠和COL-PAL-LAC 凝膠的可能機理如圖3 所示。

圖2 水凝膠XPS 全譜（a），COL,COL-LAC 和COL-PAL1-LAC 的C 1s 光譜（b,c 和d）Fig.2 Full XPS spectrum of hydrogels (a) and the C 1s spectra of COL (b),COL-LAC (c) and COL-PAL1-LAC (d)

圖3 COL-LAC 和COL-PAL-LAC 水凝膠可能的凝膠機理示意圖Fig.3 Schematic possible gelation mechanisms of COL-LAC and COL-PAL-LAC hydrogels

2.3 水凝膠實物圖和SEM 分析

圖4(a)、4(b)和4(c)分別為各組水凝膠的直觀圖、凍干后樣品的形態以及SEM 圖。如圖4a 所示，在LAC 作用下膠原呈現透明凝膠狀，且在PAL 引入后，水凝膠顏色發生改變，隨著PAL 含量的增加，顏色由棕黃色（COL-PAL1-LAC） 到褐色（COL-PAL2-LAC） 轉變，直至深褐色且偏黑色（COL-PAL3-LAC），這說明LAC 催化氧化PAL 分子時產生了醌基團[20]。如圖4(b)所示，COL-LAC 凝膠凍干后呈塌陷狀態，COL-PAL-LAC 各組凝膠整體結構相對穩定，表明LAC 和PAL 與膠原之間的交聯作用有利于保持凝膠的整體骨架。如圖4(c)為凝膠的微觀結構，COL-LAC 的SEM 圖呈現較大的片狀結構，且相對松散，而COL-PAL1-LAC 整體相對緊密，COL-PAL2-LAC 凝膠的微觀結構則出現了局部致密現象。與此同時，隨著PAL 含量的進一步增加，COL-PAL3-LAC 凝膠的微觀結構更加緊密，這說明PAL 含量的增加能夠加強LAC 作用下PAL 與膠原之間的交聯作用，增強LAC 交聯膠原的交聯效應。

圖4 各組水凝膠（a）、凍干后的水凝膠（b）和SEM（c）Fig.4 Photos of the prepared hydrogels (a) , the lyophilized ones (b) and their SEM images (c)

2.4 流變學

分別對各組凝膠的流變性能進行了研究。圖5(a)和5(b) 為分別為各組水凝膠的G"和G'。所有水凝膠的G'都高于G"，證明了各組材料具有水凝膠典型的粘彈性行為。通過比較在0.1 Hz 頻率下的G'可知，與COL-LAC凝膠的49.74 Pa 相比，PAL加入后，各組凝膠的G'出現了明顯增加， 其中COL-PAL1-LAC 凝膠的G'最高達到了224.60 Pa，這表明PAL 的參與能夠進一步增強LAC 作用下膠原凝膠的力學性能。隨著PAL 含量的增加，COL-PAL2-LAC 和COL-PAL3-LAC 的G' 分別為206.58 Pa 和169.40 Pa，凝膠的G'呈現下降趨勢，這可能是LAC 作用下PAL 分子之間的相互作用增加形成多聚體導致在一定程度上破壞了膠原基材的整體骨架。

圖5 各組水凝膠的儲能模量（a）、損耗模量（b）、應力-應變曲線（c）和壓縮模量（d）曲線Fig.5 Energy storage modulus (a), loss modulus (b), typical tensile stress-strain curves (c) and compressive modulus (d) of the prepared hydrogels

2.5 壓縮性能

與此同時，進一步測量凝膠的壓縮模量來反映凝膠的力學性能。如圖5(c)所示，根據各組凝膠的應力- 應變曲線計算出 COL-LAC、COL-PAL1-LAC、COL-PAL2-LAC 和COL-PAL3-LAC 水凝膠的壓縮模量分別為4.27、7.19、9.40 和6.77 kPa（圖5(d)）。由此可知，PAL 的加入導致LAC 作用下膠原凝膠后的力學性能增強，其中COL-PAL2-LAC 水凝膠的壓縮模量達到了COL-LAC 水凝膠的2.2 倍左右，進一步表明了PAL 的參與有利于LAC 作用下膠原水凝膠力學性能的改善。

2.6 熱重分析

采用所有水凝膠的TGA和熱重曲線研究各組凝膠的熱降解行為，如圖6(a)所示，觀察到了熱降解行為的兩個階段，包括被吸收的水和結構水的損失，以及COL 凝膠的分解。在50～150 ℃溫度范圍內，主要的減重行為是由于膠原凝膠中的水蒸發和膠原分子之間的氫鍵斷裂。隨著溫度從200 ℃增加到800 ℃，COL分子開始分解，三螺旋結構逐漸被破壞成多肽，這些多肽被裂解并蒸發為二氧化碳和水，導致第二階段的質量損失[21]。從圖6(a)可以看到，COL-LAC和各組COL-PAL-LAC 水凝膠的殘留質量相較于純COL均得到了提升。此外，與COL-LAC 水凝膠的殘留質量相比，COL-PAL1-LAC 和COL-PAL3-PLAC 水凝膠殘留質量差別不大，這可能是由于PAL 含量少導致LAC的催化交聯作用不足以改善膠原整體的穩定性，而PAL含量過高則會導致LAC 作用下PAL 之間的相互作用形成大量多聚體從而對膠原分子骨架的整體結構造成破壞，引起穩定性的下降，這也可能是COL-PAL3-LAC 凝膠G' 下降的原因。 另外，COL-PAL2-LAC 水凝膠的殘余質量從25.36%提高到了28.49%，表明適宜的PAL 含量有利于膠原水凝膠熱降解的穩定性。

圖6 各組水凝膠的TG（a）和DTG（b）曲線Fig.6 TG (a) and DTG (b) curves of the prepared hydrogels

2.7 耐酶降解分析

圖7 是水凝膠的耐酶降解性質表征。實驗中，COL-LAC 凝膠在24 h 內迅速降解，只留下非常少量的絮狀物質，說明單純的LAC 參與導致的膠原交聯作用相對較差，這有可能與LAC 作用底物Tyr 含量較少有關。隨著PAL 的引入，COL-PAL1-LAC 和COL-PAL2-LAC 在7 d 后才基本完全降解，而此時COL-LAC3-PAL 水凝膠的降解率在73%左右。由此可以看出，PAL 的參與增強了LAC 交聯膠原水凝膠的交聯效應，從而增強了膠原水凝膠的耐酶降解性質，且隨著PAL 濃度的增加，膠原水凝膠的耐酶降解性質增強。

圖7 各組水凝膠的酶降解Fig.7 Enzymatic degradation curves of the prepared hydrogels

3 結論

通過漆酶-原兒茶醛催化交聯作用獲得了一種膠原水凝膠，通過FTIR 和XPS 分析研究漆酶-原兒茶醛交聯膠原的作用機理，探索了漆酶作用下不同原兒茶醛含量對膠原水凝膠的微觀結構、力學性能、熱穩定性和降解性的影響。實驗結果表明，原兒茶醛可以增強漆酶的底物特異性，即為漆酶-多酚介體的交聯效應。對漆酶-膠原水凝膠體系的力學性能、穩定性和耐酶降解性質有一定的提升作用，是獲得膠原水凝膠的一種有效策略。