CD155、TIGIT在胃腸神經內分泌腫瘤中的表達及與臨床病理特征的關系

謝 偉,余 松,侯能易,嚴 力,曹欽興,旦真甲,袁興梅,陸河江,劉 杰,龐明輝

謝偉,陸河江,劉杰,龐明輝,西南醫科大學臨床醫學院 四川省瀘州市 646000

余松,侯能易,嚴力,龐明輝,四川省醫學科學院·四川省人民醫院老年綜合外科 四川省成都市 610072

曹欽興,旦真甲,袁興梅,龐明輝,電子科技大學醫學院 四川省成都市 611731

0 引言

神經內分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasms,NENs)是一類起源于肽能神經元和神經內分泌細胞,具有神經內分泌分化并表達神經內分泌標記物的少見腫瘤.胃腸神經內分泌腫瘤(gastrointestinal neuroendocrine neoplasms,GINENs)是最常見的類型之一[1,2].病理學方面,根據分化程度,分為分化良好的神經內分泌瘤(neuroendocrine tumor,NET)、分化差的神經內分泌癌(neuroendocrine carcinoma,NEC)和特殊類型的混合性神經內分泌腫瘤-非神經內分泌腫瘤(mixed neuroendocrine-non-neuroendocrine neoplasm,MiNEN).近40年來全球各地區的NENs的發病率呈持續上升趨勢[3].NENs的臨床表現多樣,大部分NENs生物行為表現為惰性,惡性程度低,預后較好;但部分具有高侵襲性及轉移性,預后差.因此,探索早期診斷指標、預后指標仍然是NENs防治不可忽視的環節.

CD155是類果膠粘附分子家族的成員,參與細胞運動、自然殺傷細胞和T細胞介導的免疫.CD155在人體各種正常組織中幾乎不表達或弱表達,在多種癌癥類型的腫瘤細胞上高度上調,包括結腸癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6]、肺腺癌[7]、乳腺癌[8]、黑色素瘤[9]、膠質母細胞瘤[10]、原發性食道小細胞癌[11]等.T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)在腫瘤浸潤過程中,在淋巴細胞中高度表達,可與樹突狀細胞上的CD155高親和力結合,并通過調節樹突狀細胞的活性間接抑制T細胞的活化[12].CD155、TIGIT與GI-NENs發生發展及其預后的關系尚有待進一步研究.本研究采用免疫組化的方法檢測168例GI-NENs患者中CD155、TIGIT的表達情況,分析其臨床病理資料及生存數據,探討CD155、TIGIT在GI-NENs診治中的意義.

1 材料和方法

1.1 材料 回顧性收集2016-11/2020-08經四川省人民醫院診治的168例GI-NENs患者的臨床病理資料.納入標準:經消化內鏡或手術切除的原發性腫瘤的患者;術前未經化學及放射治療;有完整的病例資料和病理信息;病理組織蠟塊保存完善.合并其他類型腫瘤者,術前接受化學及放射治療和病例資料不全者排除在外.根據病理的增殖程度及分化程度,分為NET G1 107例、NET G2 22例、NET G3 2例、NEC 21例和MiNEN 16例(見圖1).分級標準參照2019年世界衛生組織消化系統腫瘤分類[13].

圖1 研究設計流程圖.NET: 神經內分泌瘤;NEC: 神經內分泌癌;MiENE: 混合性神經內分泌腫瘤-非神經內分泌腫瘤.

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法: 石蠟切片脫蠟至水: 依次將切片放入二甲苯Ⅰ 15 min,二甲苯Ⅱ 15 min,二甲苯Ⅲ 15 min,無水乙醇Ⅰ 5 min;無水乙醇Ⅱ 5 min,85%酒精5 min,75%酒精5 min,蒸餾水洗.抗原修復: 將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0),微波爐高火加熱10 min,?；? min,中高火再加熱10 min;冷卻后,PBS洗3次,每次5 min.阻斷內源性過氧化物酶: 將切片放入3%雙氧水,室溫10 min;PBS洗3次,每次5 min.血清封閉: 滴加山羊血清封閉液,室溫20 min.滴加一抗,4 ℃過夜.PBS洗3次,每次5 min,滴加二抗,37 ℃ 30 min,PBS洗3次,每次5 min.DAB顯色: 配制新鮮的DAB顯色液,滴加到組織上,室溫顯色,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,蒸餾水洗滌切片終止顯色.復染細胞核: 蘇木素復染3 min,自來水洗,清水返藍后流水沖洗.脫水封片: 將切片依次置于75%、85%、95%、無水乙醇、二甲苯中分別浸泡10 min,中性樹膠封片.

1.2.2 圖像采集及結果判讀: 使用顯微攝像系統對切片進行圖像采集,每張切片先于100倍下觀察全部組織,再分別采集400倍顯微圖像,共采集3張.采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定所采集全部圖像的光密度(integrated optical density,IOD)和面積,并計算每張圖像的平均光密度(mean density,MD),使用3張圖像的平均光密度再計算平均數,得出每例樣本的平均光密度.蘇木素染細胞核為藍色,DAB顯出的陽性表達棕黃色.

1.2.3 隨訪: 患者的聯系方式通過病案首頁、住院患者隨訪群等方式查詢到,通過電話、微信、門診隨訪等方式進行隨訪.隨訪時間截至2023-09.從疾病初次確診時間至當前隨訪或患者死亡的時間定義為總生存時間.

統計學處理 使用Halo數據分析系統計算每張圖像陽性面積占比.應用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析.符合正態分布的計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-g檢驗;繪制受試者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,計算曲線下面積(area under curve,AUC),評估CD155和TIGIT與GI-NENs患者預后的相關性,并確定CD155和TIGIT預測GI-NENs患者預后的最佳截斷值.Kaplan-Meier生存曲線、Cox回歸進行生存分析;組間生存分析比較采用Log-rank檢驗.P＜0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 CD155與TIGIT在胃腸神經內分泌腫瘤組織中的表達情況 CD155(圖2)、TIGIT(圖3)主要在細胞質及細胞間質表達,染色褐色或棕黃色細胞代表陽性,染色藍色細胞代表陰性,底物呈現白色.

圖2 CD155在GI-NENs組織中的表達情況(免疫組化染色).A: NET G1;B: NET G2;C: NET G3;D: NEC;E: MiNEN.箭頭: CD155免疫組化的典型染色區域.GI-NENs: 胃腸神經內分泌腫瘤;NET: 神經內分泌瘤;NEC: 神經內分泌癌;MiENE: 混合性神經內分泌腫瘤-非神經內分泌腫瘤.

圖3 TIGIT在GI-NENs組織中的表達情況(免疫組化染色).A: NET G1;B: NET G2;C: NET G3;D: NEC;E: MiNEN.箭頭: CD155免疫組化的典型染色區域.GI-NENs: 胃腸神經內分泌腫瘤;TIGIT: T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白;NET: 神經內分泌瘤;NEC: 神經內分泌癌;MiENE:混合性神經內分泌腫瘤-非神經內分泌腫瘤.

G3組由于樣本數量較少原因,不具備統計條件,故不納入統計.

圖4顯示,GI-NENs組織中CD155的表達量隨著病理分級的增高而增高,與G1、G2組相比,NEC組、MiNEN組腫瘤組織CD155表達量均明顯升高;GI-NENs組織中TIGIT的表達量在病理分級中無明顯變化趨勢,但與G1、G2組相比,NEC組、MiNEN組腫瘤組織TIGIT表達量均明顯升高.

圖4 不同病理類型GI-NENs組織中的表達情況.A: CD155平均光密度;B: TIGIT平均光密度.GI-NENs: 胃腸神經內分泌腫瘤;TIGIT: T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白;NET: 神經內分泌瘤;NEC: 神經內分泌癌;MiENE: 混合性神經內分泌腫瘤-非神經內分泌腫瘤.

表1顯示,與G1組相比,NEC組、MiNEN組腫瘤組織CD155表達量均明顯升高,具有顯著統計學意義(P＜0.05);G2組腫瘤組織CD155表達量無明顯變化,不具有統計學意義.與G2組相比,NEC組、MiNEN組腫瘤組織CD155表達量均明顯升高,具有顯著統計學意義(P＜0.05).與NEC組相比,MiNEN組腫瘤組織CD155表達量無明顯變化,不具有統計學意義.與G1組相比,NEC組、MiNEN組腫瘤組織TIGIT表達量均明顯升高,具有顯著統計學意義(P＜0.05);G2組腫瘤組織TIGIT表達量無明顯變化,不具有統計學意義.與G2組相比,NEC組、MiNEN組腫瘤組織TIGIT表達量均明顯升高,具有顯著統計學意義(P＜0.05).與NEC組相比,MiNEN組腫瘤組織TIGIT表達量無明顯變化,不具有統計學意義.

表1 CD155、TIGIT平均光密度統計結果

2.2 不同臨床病理特征GI-NENs患者CD155的表達比較 患者CD155表達量在年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、Ki-67指數方面比較有統計學差異(P＜0.05);性別與CD155的表達量無統計學意義(見表2).

表2 不同臨床病理特征GI-NENs患者CD155的表達比較

表3 不同臨床病理特征GI-NENs患者TIGIT的表達比較

表4 GI-NENs患者總生存率的Cox分析

2.3 不同臨床病理特征GI-NENs患者TIGIT的表達比較 患者TIGIT表達量在腫瘤最大直徑、T分期、淋巴結轉移、TNM分期、Ki-67指數方面比較有統計學差異(P＜0.05);性別、年齡、不同腫瘤位置、遠處轉移與TIGIT的表達量差異無統計學意義(見表3).

2.4 CD155表達情況與GI-NENs患者生存的關系 168例GI-NENs患者的隨訪時間為1-81 mo,中位隨訪時間49 mo.其中GI-NETs、NEC和MiNEN的中位生存時間分別是50 mo、9 mo和18.5 mo.利用約登指數計算出CD155、TIGIT的最佳截斷值,分為高表達CD155(MD＞0.1986)、低表達CD155(MD≤0.1986)、高表達TIGIT(MD＞0.2500)、低表達CD155(MD≤0.2500).利用Kaplan-Meier行單因素生存分析發現,性別、年齡、腫瘤最大直徑、病理分級、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、Ki-67指數、高表達CD155、高表達TIGIT與生存預后較差相關(P＜0.05)(見圖5A-K).進一步多因素Cox回歸分析,提示提示病理分級[風險比(hazard ratio,HR)=2.727]、[95%置信區間(confidence interval,CI): 1.213-6.131]、T分期[HR=7.552(95%CI: 1.324-43.079)]、遠處轉移[HR=12.617(95%CI: 2.786-57.138)]和高表達CD155[HR=12.441(95%CI: 2.270-68.182)]是患者生存預后差的因素(P＜0.05)(見表4).為了評估CD155、TIGIT對GI-NENs患者預后的預測價值,進一步繪制ROC曲線,結果顯示CD155的AUC為0.766(95%CI: 0.679-0.853,P＜0.001),TIGIT的AUC為0.609(95%CI: 0.479-0.740,P=0.084),CD155聯合TIGIT的AUC為0.794(95%CI:0.706-0.881,P＜0.001),我們發現CD155聯合TIGIT的AUC較單個指標更大(見圖5L).

圖5 168例GI-NENs患者的Kaplan-Meier生存分析.A: 性別;B: 年齡;C: 腫瘤最大直徑;D: 病理分級;E: T分期;F: 有無淋巴結轉移;G: 有無遠處轉移;H: TNM分期;I: Ki67(%);J: 不同CD155表達情況;K: 不同TIGIT表達情況;L: CD155、TIGIT、CD155聯合TIGIT評估GI-NENs患者預后的繪制受試者操作特征曲線.GI-NENs: 胃腸神經內分泌腫瘤;NET: 神經內分泌瘤;NEC: 神經內分泌癌;MiENE: 混合性神經內分泌腫瘤-非神經內分泌腫瘤;TIGIT: T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白;AUC: 曲線下面積.

3 討論

GI-NENs生長緩慢,但生物學行為不一,約有1/4在初次診斷發生轉移,轉移灶多位于肝臟[14].大部分GI-NETs的發現主要依靠胃腸鏡篩查,并且預后較好.然而,NEC和MiNEN其惡性程度較高,易發生遠處轉移,總體預后較NET差.近年來隨著群眾健康意識提高和臨床醫師的重視,更多的GI-NENs患者被發現,但其發生發展機制以及預后因素的研究較少,尋找有效的治療靶點以及精準的預后預測因素,對GI-NENs的診療有著重要的意義.

CD155是類花青素分子家族的第五個成員,具有脊髓灰質炎病毒受體(poliovirus receptor,PVR)的功能,因此CD155也被稱為連接素樣分子-5或PVR.作為一種免疫球蛋白樣粘附分子,CD155參與細胞運動、自然殺傷細胞和T細胞介導的免疫.CD155在人體各種正常組織中幾乎不表達或弱表達,在多種癌癥類型的腫瘤細胞上高度上調,包括結腸癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6]、肺腺癌[7]、乳腺癌[8]、黑色素瘤[9]、膠質母細胞瘤[10]、原發性食道小細胞癌[11]等.在本研究中,我們發現CD155在GI-NENs也有較高的表達,在不同病理分級中CD155表達有差異,分級越高,表達量也升高,這可能與NEC是一種高度惡性和侵襲性腫瘤有關.重要的是,我們的研究結果與其他腫瘤組織類型的研究結果相似,這表明CD155的表達也可能在GI-NENs的發展和治療反應中發揮重要作用.

在本研究中我們發現,CD155與腫瘤最大直徑、TNM分期、病理分期、病理分級、是否遠處轉移及淋巴轉移有關,這表明CD155的過表達可能與腫瘤的轉移和增殖有關.此前,Sloan等[10]研究發現,CD155的表達以基質依賴的方式減少了基質粘附、細胞擴散、局灶粘附密度和肌動蛋白應力纖維的數量.在人類膠質瘤細胞中消耗內源性CD155可抑制其遷移、增加細胞擴散并下調相同的信號通路.NEC和MiNEN是一種高侵襲性腫瘤,往往顯示Ki-67高表達.在這項研究中,我們發現CD155的表達與Ki-67表達和腫瘤類型一致,部分證實了它在腫瘤增殖中的作用.Triki等[8]的研究表明腫瘤細胞質CD155(cyt-CD155)與淋巴管侵襲有關,而膜CD155(m-CD155)與腫瘤浸潤NK細胞的存在密切相關.本研究中,我們發現有淋巴結轉移的GI-NENs中,細胞質CD155較陰性組表達量高,未發現CD155在細胞膜上表達,表明CD155可能參與了GI-NENs的淋巴結轉移過程.Li等[15]的研究表明CD155缺失小鼠分別通過DNAM-1的上調和CD8+T和NK細胞效應功能的增強減少了腫瘤的生長和轉移.CD155缺失的腫瘤細胞也顯示出腫瘤生長減緩和轉移減少,這證明了CD155在腫瘤內在作用中的重要性.因此,CD155可能在GI-NENs的增殖和轉移過程中扮演重要角色,但其分子機制還需要進一步研究.

TIGIT是一種抑制性檢查點受體,在腫瘤浸潤過程中,在CD8+T細胞、CD4+T細胞和NK細胞中高度表達[16-18],可與樹突狀細胞上的CD155高親和力結合,并通過調節樹突狀細胞的活性間接抑制T細胞的活化[12].在這項研究中,我們發現TIGIT在腫瘤組織中高表達,而且TIGIT的高表達預示著GI-NENs患者的疾病分期更晚、預后更差.TIGIT最近已成為癌癥免疫療法的一個主要靶點.Wu等[19]發現,CD155/TIGIT信號阻斷可逆轉頭頸部鱗狀細胞癌中的T細胞衰竭并增強抗腫瘤能力.靶向CD155/TIGIT可增強CD8+T細胞反應,而聯合靶向TIGIT和PD-1可進一步增強CD8+T細胞活化[5].NK細胞是先天性免疫的重要組成部分,被認為在早期消除癌癥和防止轉移方面發揮著重要作用[20].此外,Zhang等[21]研究發現在幾種腫瘤小鼠模型中,TIGIT阻斷被證明可防止NK細胞衰竭并促進NK細胞依賴性腫瘤免疫.在治療分化較差的腫瘤時,包括化療/放療在內的許多傳統治療策略療效較差,然而,近年來免疫療法在小細胞肺癌[22]中的應用取得了令人鼓舞的成果.Thibaudin等[23]研究發現聯合靶向TIGIT和PD-L1可以重新激活結直腸癌腫瘤中的CD8+T細胞、CD4+T細胞.CD155與TIGIT在GI-NENs表達,特別是在病理分級較高、分期較晚的患者中高表達,因此,阻斷CD155與TIGIT之間的相互作用可能是GI-NENs免疫治療的一個靶點.

在本研究中,我們發現CD155高表達、病理分級、T分期、遠處轉移是患者生存預后差的因素,可預測患者的預后情況.此前,Yong等[24]發現CD155高表達的乳腺癌患者總生存期較差;Sun等[25]則表明CD155表達是肺腺癌的獨立危險因素,CD155高表達的患者總生存期和無進展生存期較短;Zhao等[11]表明CD155表達是原發性食道小細胞癌的獨立預后指標,CD155和TIGIT高表達患者的總生存期和無進展生存期明顯較短.Triki等[8]的研究發現,細胞質CD155水平高的患者的總生存期和無進展生存期明顯差于低表達的患者,而膜CD155水平高的患者則預后較好.本研究與之前報告的結論類似,然而CD155/TIGIT在腫瘤細胞內及細胞間中的作用,還需要進一步研究.

4 結論

綜上所述,CD155表達量在病理分級、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、Ki-67指數相關,病理分級越高,Ki-67指數越高,分期越晚,其表達量越高,提示CD155高表達可能與GI-NENs的增殖和轉移有關系.TIGIT表達量在病理分級、T分期、淋巴結轉移、TNM分期、Ki-67指數有關,病理分級越高,Ki-67指數越高,分期越晚,其表達量越高,提示CD155/TIGIT信號通路可能在GI-NENs的增殖和轉移過程扮演重要作用,可能是GI-NENs免疫治療的一個靶點.GI-NENs的預后與病理分級、T分期、遠處轉移和CD155高表達有關系,對患者的預后有一定的預測價值,TIGIT對患者的預后預測價值有限,但CD155聯合TIGIT對患者不良預后的AUC大于兩者單用.Kaplan-Meier生存分析顯示高表達CD155、TIGIT的GI-NENs患者生存率低于低表達CD155、TIGIT的患者,說明CD155聯合TIGIT對GI-NENs患者的預后具有較好的預測價值.本研究中NET-G3的患者較少,原因可能受既往免疫組化的影響以及本研究樣本量的不足.同時隨著NENs分級的進一步細化,有必要將病理切片二次評估腫瘤的分級狀態.由于NEC、MiNEN的細胞來源以及驅動基因和NETs存在明顯差異,CD155/TIGIT在異質性高的不同病理分級中的作用仍有待深入研究.

文章亮點

實驗背景

胃腸道神經內分泌腫瘤(gastrointestinal neuroendocrine neoplasm,GI-NENs)的發病率呈持續上升趨勢,其臨床表現多樣,部分具有高侵襲性及轉移性,預后差.CD155人體各種正常組織中幾乎不表達或弱表達,在多種癌癥類型的腫瘤細胞上高度上調,參與細胞運動、自然殺傷細胞和T細胞介導的免疫,T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)可與樹突狀細胞上的CD155高親和力結合,并通過調節樹突狀細胞的活性間接抑制T細胞的活化.分析CD155、TIGIT表達與臨床病理特征及預后關系,探討GI-NENs免疫治療有重要的意義.

實驗動機

通過免疫組化檢測CD155、TIGIT在GI-NENs中的表達,分析其與臨床病理特征及預后的關系,為GI-NENs的預后提供幫助,同時為GI-NENs的免疫治療提供一個新的方向.

實驗目標

探討CD155、TIGIT在GI-NENs中的表達量與臨床病理特征的關系.

實驗方法

收集2016-11/2020-08經我院診治的168例GI-NENs患者的臨床病理資料,免疫組化檢測CD155、TIGIT的表達量,分析其與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、Ki-67指數以及預后的關系.

實驗結果

CD155和TIGIT在病理分級高的GI-NENs組織中,表達量也較高,差異有統計學意義(P＜0.05);CD155表達量與年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、病理分級、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、Ki-67指數有關(P＜0.05);TIGIT表達量與腫瘤最大直徑、病理分級、T分期、淋巴結轉移、TNM分期、Ki-67指數有關.高表達CD155、高表達TIGIT與GI-NENs生存預后較差相關(P＜0.05),CD155聯合TIGIT的繪制受試者操作特征曲線下面積為0.794(95%置信區間: 0.706-0.881,P＜0.001).

實驗結論

CD155和TIGIT表達量在不同分級、分期的GI-NENs患者存在差異,可能參與了GI-NENs的發生及進展的調控過程,高表達可能提示預后不佳.

展望前景

高表達CD155、高表達TIGIT與GI-NENs生存預后較差相關,為臨床醫生對GI-NENs的預后提供幫助.CD155與TIGIT表達量與腫瘤最大直徑、病理分級、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、Ki-67指數有關,提示CD155/TIGIT信號通路可能在GI-NENs的增殖和轉移過程扮演重要作用,可能是GI-NENs免疫治療的一個靶點.但本研究未進行細胞和動物實驗,CD155/TIGIT信號通路在GI-NENs的作用仍需要進一步研究和探索.