NDUFA13 過表達可減輕CCl4誘導的小鼠肝纖維化：基于抑制NLRP3 活化

徐小惠，馮金梅，羅 穎，何昕覦，臧金寶，黃道超

1重慶醫科大學附屬兒童醫院兒科研究所//國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心//兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014；2重慶醫科大學附屬兒童醫院心內科//國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心//兒童發育疾病研究教育部重點實驗室//國家臨床心血管內科重點?？?/重慶市衛生健康委兒童重要器官發育與疾病重點實驗室，重慶 400014；3重慶市九龍坡區第二人民醫院檢驗科，重慶400052

肝纖維化是由遺傳因素、病毒感染、毒物暴露等引起肝損傷后組織的自我修復反應，主要表現為肝內結締組織增生和細胞外基質沉積，是各種慢性或急性肝病的共同病理過程［1-3］。臨床上很多肝纖維化后期發展為肝硬化、肝衰竭甚至肝癌，嚴重影響患者生存質量［4］。而對于終末期肝纖維化患者的治療，除了肝臟移植，目前仍缺乏有效手段。因此，探究肝纖維化發病機制，尋找有效的預防及治療靶點，對于肝纖維化的早期防控具有重要意義。

肝纖維化的發病機制涉及氧化應激、鐵死亡及線粒體功能障礙等［5］。其中，線粒體作為細胞能量與代謝中心，在肝纖維化病理進程中的重要作用近來備受關注［6,7］。如肝纖維化的發生往往伴隨肝細胞線粒體結構異?；蚬δ芪蓙y［6］。線粒體內膜蛋白NDUFA13，是線粒體呼吸鏈NADH脫氫酶復合體Ⅰ的功能亞單位［8］。我們前期研究揭示了NDUFA13缺陷可誘導小鼠慢性自發性肝炎和肝纖維化病理表型，并通過肝臟NDUFA13特異性敲除模擬了一種自發性、慢性肝纖維化動物模型［9,10］。而NDUFA13蛋白是否涉及CCl4誘導的小鼠急性肝損傷和肝纖維化，其作用及調控機制仍需進一步探究。

炎癥小體作為機體固有免疫系統感受器，是參與肝臟炎癥和肝纖維化的重要炎癥信號分子［11］。其中Nod樣受體蛋白3（NLRP3）是炎癥小體家族的經典成員，與肝纖維化的緊密聯系已被廣泛報道［12-14］。課題組最新研究發現，胃黏膜壁細胞中NDUFA13 表達缺失通過ROS-NRF2-HO-1-NF-кB信號軸觸發NLRP3炎癥小體激活，且腹腔注射NLRP3抑制劑可顯著減輕NDUFA13敲除誘導的小鼠胃炎病理表型［15］。另有文獻報道，NDUFA13是NLRP3炎癥小體活化的重要上游調節蛋白［16］，但靶向NDUFA13蛋白而抑制NLRP3炎癥小體通路激活，能否成為減輕肝臟炎癥甚至逆轉肝纖維化進程的有效手段，尚無相關研究報道。本研究探討NDUFA13蛋白在CCl4致小鼠肝纖維化中的保護作用，并基于NLRP3信號探索其可能機制，為抗肝纖維化的治療策略提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實驗動物 BALB/C小鼠（7～8周齡，SPF級，體質量22±3 g）購買于重慶醫科大學動物實驗中心。所有小鼠均飼養于重慶醫科大學附屬兒童醫院實驗動物中心，SPF環境下（12 h光暗循環），溫度22～24 ℃，相對濕度40%～50%，自由采食與飲水。分別在CCl4誘導3、5、7周后處死小鼠，獲取肝組織樣本用于實驗檢測。所有操作均遵照實驗動物倫理學要求（倫理編號：CHCMUIACUC20210114023）進行。

1.1.2 主要試劑 Masson染色試劑盒（索萊寶），四氯化碳（CCl4，Sigma），玉米油（索萊寶），蛋白裂解液（碧云天），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），NDUFA13小鼠抗人單克隆抗體（Santa cruz），NLRP3兔抗人多克隆抗體（Bioss），α-SMA 小鼠抗人單克隆抗體（Bioss），Collagen Ⅲ兔抗人多克隆抗體（Bioss），TNF-α小鼠抗人單克隆抗體（Bioss），IL-1β兔抗人多克隆抗體（Bioss），小鼠抗β-actin抗體（Sigma），Western BrightTMECL顯色試劑盒（Advansta），山羊抗兔Alexa-Fluor 555熒光二抗（Bioss），山羊抗小鼠Alexa-Fluor 647 熒光二抗（Bioss）。

1.1.3 主要儀器 臺式高速離心機（Thermo Fisher Scientific），ChemiDocTMTouch成像系統（Bio-Rad），病理切片儀（Leica），A1R 激光共聚焦顯微鏡（Nikon），NIS Element離線數據分析工作站（Nikon）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 CCl4誘導肝纖維化小鼠模型的制備：36只BALB/C小鼠（7～8周齡，雌雄各半）被隨機分為實驗組（CCl4）和對照組（Normal），18只/組，雌雄各半。實驗組小鼠腹腔注射0.8 mL/kg CCl4（按1∶4體積比與玉米油混合稀釋），對照組小鼠注射等體積玉米油，每周注射2次。分別于第3周、5周和7周后，實驗組和對照組各取6只小鼠處死，進行肝臟取材。

腺相關病毒體內干預模型的制備：36只BABL/C小鼠（7～8周齡，雌雄各半）被隨機分為實驗組（CCl4+AAV-NDU13）和對照組（CCl4+AAV-NC），每組18只，雌雄各半。兩組小鼠分別尾靜脈注射經PBS稀釋的過表達病毒AAV8-TBG-NDUFA13（實驗組）和對照病毒AAV8-TBG-NC（對照組），注射劑量為1×1011V.G/100 μL載體/小鼠。在病毒注射10 d后，按照上述肝纖維化誘導方法，對小鼠進行0.8 mL/kg CCl4腹腔注射，每周兩次，在CCl4誘導3周、5周和7周后，分別處死對照組和實驗組小鼠各6只，進行肝臟取材。

1.2.2 組織病理學分析 獲取的小鼠肝組織經4%多聚甲醛固定，脫水石蠟包埋制成4 μm石蠟切片，經脫蠟水化等前處理后，分別按照試劑盒說明書進行蘇木素-伊紅染色和馬松染色。最后經過脫水透明并封固，用于鏡下觀察取圖，每組小鼠取10個高倍視野（×400），進行Ishak纖維化評分分析［10］。

1.2.3 Western blotting檢測 稱取50 mg各組小鼠肝組織，采用蛋白提取試劑盒提取全蛋白，再通過BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白濃度，加入5×SDS PAGE上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱5 min使蛋白變性。采用10%SDS PAGE凝膠電泳，每孔準確加入30 μg總蛋白，再電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，然后放入含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h，加入稀釋好的一抗（NDUFA13 1∶300，α-SMA 1∶500，內參為小鼠抗β-actin單克隆抗體1∶7000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀釋），室溫下孵育1 h，TBST再次洗膜，最后采用ECL顯色劑顯影，在全自動化學發光成像分析系統中檢測和成像，并通過Image J軟件對條帶進行灰度值分析，計算目標蛋白條帶灰度與內參條帶灰度之間的比值，即代表目標蛋白的相對含量［10］。

1.2.4 免疫熒光染色 取各組小鼠新鮮肝臟組織，經過OCT快速冷凍包埋，在冰凍切片機中制成8 μm冰凍切片，立即置于4%多聚甲醛溶液固定0.5 h。免疫組化筆畫圈并置入PBS 漂洗后，利用山羊血清在室溫下封閉1 h，甩干后滴加稀釋好的一抗溶液（NDUFA13 1∶50，NLRP3 1∶200，TNF-α 1∶200，IL-1β 1∶200，α-SMA 1∶500，Collagen III 1∶200），置于4 ℃冰箱孵育過夜。PBS洗滌后，滴加相應二抗溶液，并于室溫下孵育1 h，再次PBS洗滌后，通過DAPI溶液復染細胞核，最后采用抗熒光淬滅封片劑封片，用于激光共聚焦檢測成像。每組選取10個高倍視野（×400），進行平均熒光強度分析（MFI）。

1.2.5 統計學分析 所有實驗獨立重復3次，數據以均數±標準差表示。采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，兩組間差異行獨立樣本t檢驗，多組間行單因素方差分析，Ρ＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CCl4處理對小鼠肝臟中NDUFA13蛋白表達的影響

2.1.1 CCl4誘導小鼠肝損傷和肝纖維化模型的建立與分析 HE染色和Masson染色評價CCl4誘導的小鼠肝損傷及肝纖維化程度。結果顯示，CCl4處理小鼠肝組織肝小葉結構排列紊亂，肝細胞變性壞死，炎癥細胞募集且伴大量膠原蛋白沉積，從肝小葉中央區逐步向外周發生纖維化。并且隨著時間推移，炎癥浸潤和纖維化程度進一步加重（Ρ＜0.001，圖1A、B）。Western blotting檢測結果發現，相比正常對照組，CCl4誘導小鼠肝組織中肝星狀細胞活化標志物α-SMA蛋白表達水平在各時間段均明顯增加（Ρ＜0.01，圖1C）。

圖1 HE染色、Masson染色檢測小鼠肝組織損傷及纖維化情況Fig.1 Pathological and fibrotic changes in the liver tissues of CCl4-treated mice (HE and Masson staining,Original magnification: ×400).A: HE staining of the liver tissues of CCl4-treated mice. B: Masson staining of the liver tissues.Ishak score was used to evaluate histological grading and staging of liver fibrosis.C:α-SMAprotein expression in the liver tissues of CCl4-treated mice detected by Western blotting.Relative density of α-SMA expression was shown.**P＜0.01,***P＜0.001 vs normal.

2.1.2 CCl4模型小鼠肝臟中NDUFA13 蛋白表達情況將上述CCl4連續誘導3、5、7 周的肝臟組織用于NDUFA13蛋白檢測。結果顯示，相比健康的非纖維化對照組，CCl4處理使得肝組織中NDUFA13蛋白表達顯著降低（Ρ＜0.001，圖2）。

圖2 CCl4處理小鼠肝臟中NDUFA13蛋白表達檢測Fig.2 NDUFA13 protein expression in the liver tissues of CCl4-treated mice detected by Western blotting.A:Western blots of protein.B:Relative of protein expression.***P＜0.001 vs normal.

2.2 NDUFA13蛋白過表達可減輕CCl4誘導的小鼠肝纖維化

2.2.1 AAV8介導肝細胞過表達NDUFA13蛋白的CCl4誘導鼠模型 通過AAV8-TBG病毒介導肝細胞特異性NDUFA13過表達，觀察其對CCl4誘導的肝纖維化病理進程的影響（圖3A）。通過Western blotting 驗證NDUFA13蛋白過表達的體內效率，結果顯示在CCl4處理3、5、7周后，相比CCl4+AAV-NC對照組，CCl4+AAVNDU13干預組小鼠肝組織中NDUFA13 蛋白的表達明顯增加（Ρ＜0.05，圖3B）。

圖3 AAV8介導肝細胞過表達NDUFA13蛋白的CCl4誘導鼠模型Fig.3 Hepatocyte-specific NDUFA13 overexpression mediated by AAV8 in CCl4-treated mice.A:Schematic diagram of AAV8 virus-mediated hepatocyte-specific NDUFA13 overexpression in CCl4-treated mice.B:NDUFA13 expression after AAV8 virus treatment detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01 vsAAV-NC.

2.2.2 NDUFA13蛋白過表達對CCl4誘導小鼠肝纖維化的影響 HE染色和Masson染色分析NDUFA13蛋白過表達的CCl4誘導小鼠肝組織損傷和肝纖維化情況。結果顯示，在CCl4干預后，AAV-NC組小鼠肝臟內肝細胞壞死，炎癥細胞浸潤和膠原纖維沉積顯著，而AAVNDU13組小鼠肝組織炎癥損傷和纖維化改變明顯減輕（Ρ＜0.001，圖4A～C）。

圖4 NDUFA13蛋白過表達對CCl4小鼠肝組織病理學的影響Fig.4 Effect of NDUFA13 overexpression on liver histopathology in CCl4-treated mice(×400).A:HE staining of the liver tissues of CCl4-treated mice with NDUFA13 overexpression. B: Masson trichrome staining for liver fibrosis.C:Ishak scores for histological grading and staging for fibrosis.***P＜0.001 vsAAV-NC.

2.3 NDUFA13蛋白過表達抑制肝組織中NLRP3活化

各組小鼠肝組織冰凍切片用于抗NDUFA13和抗NLRP3-CIAS免疫熒光雙標檢測。結果顯示，相比正常對照組，CCl4組肝臟NDUFA13蛋白表達顯著降低，且肝細胞中炎癥小體NLRP3蛋白聚集明顯增多（Ρ＜0.001，圖5）。而經AAV8病毒干預的CCl4模型鼠，NDUFA13過表達組相比NC組的NLRP3表達顯著減少（Ρ＜0.001，圖5）。

圖5 NDUFA13蛋白過表達對NLRP3活化的影響Fig.5 Effect of NDUFA13 overexpression on activation of NLRP3 in CCl4-treated mice. A: Dual immunofluorescence staining of NDUFA13 and NLRP3 in the liver tissues of CCl4-treated mice(×400).Green: NDUFA13;Red: NLRP3;Blue: Nucleus. B:Mean fluorescent intensity for quantifying protein expressions.***P＜0.001.

2.4 NDUFA13蛋白過表達減少肝組織中炎癥因子分泌

各組小鼠肝組織冰凍切片用于抗IL-1β和抗TNF-α免疫熒光雙標檢測。結果發現，相比正常對照組，CCl4組小鼠肝臟中炎性細胞因子IL-1β、TNF-α分泌均顯著增加（Ρ＜0.001，圖6）。而相比AAV-NC組，AAV-NDU13組小鼠經CCl4誘導后IL-1β、TNF-α釋放明顯減少（Ρ＜0.001，圖6）。

圖6 NDUFA13蛋白過表達對IL-1β和TNF-α的影響Fig.6 Effect of NDUFA13 overexpression on secretion of IL-1β and TNF-α in CCl4-treated mice. A: Dual immunofluorescence staining staining of IL-1β and TNFα in the liver of CCl4-treated mice(×400).Green:TNF-α;Red:IL-1β;Blue:Nucleus.B:Mean fluorescent intensity for quantifying protein expressions.***P＜0.001.

2.5 NDUFA13蛋白過表達減弱HSC活化與膠原生成

小鼠肝組織用于Western blotting檢測肝星狀細胞活化標志物α-SMA的表達水平，并通過免疫熒光分析其膠原合成情況。結果顯示，相比AAV-NC 干預組，AAV-NDU13過表達組小鼠肝臟α-SMA表達在CCl4處理3周、7周均出現明顯減弱（Ρ＜0.05，圖7A），且其膠原合成也受到顯著抑制（Ρ＜0.001，圖7B）。

圖7 NDUFA13蛋白過表達對HSC活化及其膠原生成的影響Fig.7 Effect of NDUFA13 overexpression on HSCs activation and collagen production in the liver of CCl4-treated mice.A:α-SMA protein expression in CCl4 mouse liver with AAV8 intervention detected by Western blotting.B:Dual immunofluorescence staining of α-SMA and collagen Ⅲin CCl4-treated mouse liver tissues(×400).Green: α-SMA;Red: Collagen-Ⅲ;Blue: Nucleus.Mean fluorescent intensity (MFI) for quantifying protein expressions.Representative images are shown.*P＜0.05,***P＜0.001 vs normal orAAV-NC.

3 討論

肝臟是人體重要的消化和解毒器官，其代謝異?？烧T發肝臟炎癥、肝硬化甚至肝癌［17］。其中，肝纖維化則是慢性肝損傷惡性轉變的重要節點［18］，能否在肝纖維化或肝硬化早期進行有效干預成為疾病逆轉的關鍵。因此，抗肝纖維化靶點或藥物的探究，仍然是相關疾病臨床治療的迫切需求。目前研究多關注于肝星狀細胞（HSCs）、肝巨噬細胞等與肝纖維化的關系［19,20］，而肝實質細胞作為病理損傷的主要靶細胞，其受損才是肝臟炎癥病理改變的起始事件，也是HSCs活化的主要誘因。我們通過建立CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型，從分子水平探究肝纖維化進程中肝細胞的改變，尋求改善肝細胞內穩態的可能靶點，對肝纖維化的早期預防和治療具有重要意義。

CCl4暴露誘導的急性肝損傷模型，可模擬人類肝纖維化疾病狀態，常被用于肝臟毒理解析和潛在保護劑的探究［21,22］。CCl4進入機體后可通過肝臟細胞色素P450代謝產生氧自由基，結合肝細胞線粒體的磷脂分子發生氧化反應而影響其呼吸功能，使得ATP減少和ROS釋放增加，最終導致肝細胞氧化應激損傷［23］。雖然肝損傷機制復雜多樣，但肝細胞線粒體氧化損傷是許多藥物肝毒性或慢性肝臟疾病的重要機理之一。NDUFA13蛋白是線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的關鍵組分，對于線粒體膜電位維持、線粒體ROS產生至關重要，近年又作為一種潛在抑癌基因被報道［8］。此外，我們前期研究揭示了肝細胞NDUFA13雜合敲除可誘導小鼠自發性肝炎和肝纖維化表型［9,10］。本研究發現CCl4處理使得線粒體NDUFA13蛋白表達顯著降低，而NDUFA13蛋白過表達可顯著抑制CCl4誘導的小鼠肝纖維化。這就充分揭示了NDUFA13蛋白可作為抗纖維化的靶標，發揮對肝臟穩態的保護作用。

NLRP3屬目前研究最廣泛的一類炎癥小體，是炎癥性疾病中由細胞內模式識別受體（PRRs）參與組裝形成的一類多蛋白復合體，主要包括核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（NLRP3）、含caspase募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和絲氨酸蛋白酶（caspase-1）［11,12］。NLRP3炎癥小體受多種信號調控被激活，是肝臟炎癥與肝纖維化病理進程的關鍵信號分子［12］。相關文獻表明，NLRP3炎癥小體組分可進入HSCs胞內調節其活化，促進膠原纖維的沉積［24］。此外，NLRP3 可通過caspase-1依賴性方式剪切釋放成熟的IL-1β、IL-18及IL-33等活性炎癥因子，進一步活化HSCs，加速肝纖維化進程［11］。在非酒精性脂肪肝小鼠模型中，NLRP3活化是肝纖維化進展的重要前提［25］；而NLRP3抑制可顯著減輕實驗小鼠的肝炎和肝纖維化表型［14］。在肝細胞特異性NDUFA13敲除鼠中，我們亦觀察到NLRP3炎癥小體的顯著活化［9］。與這些結果相一致的是，CCl4誘導的肝纖維化小鼠肝臟組織中NDUFA13蛋白表達降低而NLRP3聚集增多，而NDUFA13蛋白過表達可顯著降低NLRP3表達水平。這表明NDUFA13蛋白可能通過抑制NLRP3活化減輕CCl4誘導的肝損傷和肝纖維化。

作為一個多細胞、多因子參與的持續性炎癥反應過程，炎癥相關信號的激活則是誘導肝纖維化發生發展的關鍵。IL-1β作為IL-1家族重要成員，可通過自分泌或旁分泌的方式進行雙向反饋調節，一方面促進HSCs持續活化和增殖并合成ECM，另一方面上調金屬基質蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）表達而抑制ECM降解，加重肝臟炎癥及肝纖維化程度［26］。TNF-α主要由淋巴細胞及巨噬細胞合成，可加速HSCs增殖與促進膠原合成，并介導IL-6、IL-8等其他炎性因子生成，臨床上常使肝纖維化進行性加重并向肝硬化進展［27］。此外，臨床研究表明患者血清中IL-1β、TNF-α含量與其肝纖維化程度有著緊密聯系［28］。我們的研究也證實了，CCl4處理的小鼠肝臟IL-1β與TNF-α分泌明顯增多，而NDUFA13蛋白過表達顯著抑制了IL-1β與TNF-α表達水平。這可能解釋了NDUFA13蛋白經NLRP3炎癥信號調控抑制的HSCs活化及膠原合成。

綜上所述，NDUFA13蛋白過表達可減輕CCl4誘導的小鼠肝纖維化，其可能機制涉及NLRP3介導的炎癥因子調控，但具體的調控路徑還有待后續進一步探究。本研究揭示了肝細胞NDUFA13作為抗肝纖維化靶點的可能作用，為相關疾病的臨床治療提供新思路。