秋水仙堿通過激活AMPK減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷

陳國棟，羅素新

重慶醫科大學附屬第一醫院心血管內科，重慶400016

急性心肌梗死（AMI）是一種因冠狀動脈內粥樣斑塊破裂、管腔內血栓形成等原因引起的血管閉塞導致的心肌組織缺血梗死的急性心臟病，它在全世界有著非常高的發病率和死亡率［1,2］。隨著科學技術取得長足的發展，再灌注治療如溶栓和經皮冠狀動脈介入治療術已經在各個地區被廣泛的應用和開展，并成為了AMI的常規治療策略［3,4］。然而相關研究證實再灌注治療也會對患者的心肌產生不利影響，導致心功能降低［5］。探索降低再灌注損傷的方法，保護心臟功能對急性心肌梗死的治療是非常有意義的。

心肌缺血再灌注損傷（I/R）所涉及的機制非常復雜，包括線粒體功能障礙、活性氧增多、細胞凋亡、鈣超載等［6,7］。線粒體功能障礙在其中扮演著非常重要的角色，線粒體是細胞的能量工廠，它的正常工作可以為細胞提供正常生理功能所需的能力物質——ATP［8］。心臟跳動伴隨著生物的一生，心肌細胞無時無刻不在跳動，需要大量的能量，因此心肌細胞含有豐富的線粒體［9］。當線粒體出現功能障礙時，會停止ATP的產生，并進而產生大量的活性氧產生細胞損害［10］。同時，線粒體發生功能障礙時可以介導線粒體途徑的凋亡發生，加重組織功能障礙［11］。

秋水仙堿（CCC）是一種有著悠久的使用歷史的抗炎藥物，其通過破壞微管蛋白，進而影響炎癥反應過程和途徑［12］。秋水仙堿對先天免疫系統有廣泛的抑制作用，包括吞噬作用、炎癥小體激活、中性粒細胞招募和功能等［13］。臨床上秋水仙堿常用于急性痛風、復發性心包炎等疾病的治療［14］。相關研究證明秋水仙堿可以通過對抗氧化應激和炎癥反應改善骨骼肌缺血再灌注損傷的作用［15］。一項針對H9C2細胞進行的研究表明，秋水仙堿可以通過PI3K/AKT通路對抗缺氧復氧處理導致的H9C2凋亡增加［16］，提示秋水仙堿在體外模擬心肌缺血再灌注損傷時具有保護作用，但缺乏體內實驗加以驗證。進一步明確秋水仙堿發揮保護作用的機制，可以為秋水仙堿用于治療心肌缺血再灌注損傷提供堅實的理論基礎。

AMPK是細胞中最重要的能量調節因子之一，與體內多種代謝調節、信號傳導有關［17,18］。許多研究證實AMPK可以調節心肌線粒體功能，激活AMPK被證實可以減少心肌缺血再灌注損傷［19,20］。研究表明AMPK介導了秋水仙堿在巨噬細胞中的多種抗炎作用［21］。因此我們假設在心肌缺血再灌注損傷中，秋水仙堿治療同樣具有激活AMPK進而改善心臟功能，并從體外和體內兩個層面來對此設想進行探究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

8周齡雄性C57BL/6小鼠（體質量約20 g）購自重慶醫科大學實驗動物中心，本實驗所涉及的動物實驗方案由重慶醫科大學實驗動物管理和使用委員會審查并批準（批準編號：IACUC-CQMU-2023-0064）。H9C2心肌細胞系（武漢普諾賽）；AMPK 抗體、NRF2 抗體（Wanleibio）；p-AMPKα（T172）抗體（Bimake）；秋水仙堿和DSMP（MCE）；BAX 抗體、Bcl-2 抗體、NOX4 抗體、SOD2抗體、COX IV抗體、β-actin抗體、羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（Proteintech）；cleaved caspase-3 抗體、Cytochrome c（Cyto C）（Cell Signaling Technology）；8-OHdG（Santa Cruz Biotechnology,Inc.）；Cy5羊抗鼠二抗和FITC羊抗兔二抗（Servicebio）；LDH試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Mouse Cardiac Troponin T Elisa Kit，2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（Solarbio）；ATP檢測試劑盒、組織線粒體分離試劑盒（Beyotime）；CCK-8（Biosharp）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 H9C2心肌細胞系被用于本研究體外實驗，并培養在含10%胎牛血清（PAN）的DMEM高糖培養基（Gibco）中。行缺氧/復氧（H/R）處理時，首先將H9C2細胞接種培養24 h，饑餓4 h，在饑餓處理的最后1 h在H/R+CCC組加入3 nmol/L 秋水仙堿預處理1 h，在后續處理中，每更換一次培養基均在該組培養基中加入3 nmol/L秋水仙堿，秋水仙堿使用濃度參考文獻［22］。然后將細胞培養基更換為不含葡萄糖和血清的DMEM（Gibco），并在低氧培養箱中培養4 h（5%CO2，1%O2和94%N2），以進行缺氧處理。再通過將缺血DMEM改變為完全培養基(含4.5 g葡萄糖和10%胎牛血清)并使用95%空氣+5%CO2培養來啟動復氧過程。在復氧4 h后收集細胞以用于Western blotting檢測，復氧24 h小鼠后用于細胞活力檢測。

1.2.2 Western blotting 配制一定體積RIPA裂解液，在RIPA裂解液（武漢賽維爾）按1∶100的比例加入PMSF、磷酸化蛋白酶抑制劑A液和磷酸化蛋白酶抑制劑B液（武漢賽維爾）。將冷凍于-80 ℃的心臟樣品取出，切取心尖再灌注區域心肌組織，加入配制好的的RIPA裂解液并使用勻漿機粉碎組織取得蛋白。對于細胞蛋白，在六孔板加入配置好的RIPA裂解液刮取細胞取得蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度并配平，加入上樣緩沖液后混勻，并放置于沸水中水浴加熱10 min完成樣品制備。使用10%～12%SDS-PAGE凝膠分離樣品中的蛋白，并將蛋白轉印至PVDF 膜上。使用含5%脫脂牛奶的TBST對轉印完畢的PVDF膜進行封閉。在4 ℃冰箱中孵育相應的一抗8～12 h。一抗稀釋比例依次為：p-AMPK（1∶1000）、AMPK（1∶1000）、NOX4（1∶1000）、NRF2（1∶500）、SOD2（1∶5000）、BAX（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000）、cleaved caspase-3（1∶1000）、Cyt C（1∶1000）、β-actin（1∶5000）、COX IV（1∶10 000）。一抗孵育結束后，取出PVDF膜，使用TBST洗去殘留一抗，于室溫中孵育對應的二抗1 h，二抗稀釋比例為1∶10 000。棄去二抗，并使用TBST洗去殘留二抗，使用ECL化學發光法檢測蛋白表達。

1.2.3 細胞活力 細胞活力使用CCK-8的方法檢測，將細胞種于96 孔板，處理同1.2.1，但復氧時間調整為24 h。到達處理終點時，棄去培養基。PBS清洗后，每孔加入100 μL無血清DMEM培養基+10 μL CCK-8溶液，于37 ℃中孵育3 h，使用酶標儀測定在450 nm處的吸光值。

1.2.4 小鼠心肌缺血再灌注損傷模型 共計32只小鼠被隨機分為：假手術（SO）組，I/R組、I/R+CCC組和I/R+CCC+Dorsomorphin（DSMP）組，每組8只。各組中，再隨機選取4只于再灌注開始后3 h處死取材，4只于再灌注開始后24 h處死取材。本實驗方法參考先前的研究［23］。使用1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）將小鼠麻醉后。將小鼠固定在加熱毯上，保持小鼠體溫在37 ℃。經口對小鼠行氣管插管術并連接至小鼠呼吸機（MiniVent 845）。對其胸部剃毛，并使用碘伏進行消毒。在左胸中部皮膚切一約1 cm橫切口，分離肌肉組織，暴露胸壁，在第三肋間切開肋間隙組織，暴露心臟。在左前降支處穿線，將一根直徑約1 mm塑料小棒一起結扎，開始缺血。對SO組小鼠，僅在前降支處穿線，而不結扎。缺血15 min后，腹腔注射0.4 mg/kg 秋水仙堿或等體積溶劑，秋水仙堿注射劑量參考文獻［24］。注射15 min后剪斷繩結，并移除塑料小棒和殘留線段，開始再灌注。逐層縫合切口，將小鼠放置于另一加熱毯等待蘇醒。3 h后再次麻醉小鼠，摘取心臟用于WB、ATP含量、熒光染色檢測。為充分抑制AMPK活性，手術前2 h以20 mg/kg的劑量對相應組別小鼠注射DSMP，劑量參考文獻［25］。用于評估心功能、梗死范圍、血清LDH和cTnT檢測的小鼠，再灌注24 h再進行，并在術后12 h再次注射1次同等劑量藥物。血液收集于非抗凝管，并離心10 min（3000 r/min），收集上清液并保存于-80 ℃冰箱用于后續實驗。

1.2.5 組織ATP含量 心肌組織ATP含量使用商業檢測試劑盒進行，方法依照生產廠家說明書，最后檢測化學發光。

1.2.6 熒光染色 將組織浸泡于4%多聚甲醛中24 h，進行石蠟包埋，并切為5 μm厚的切片置于載玻片上。染色時，使用二甲苯進行脫蠟，后在乙醇中進行再水化。切片浸泡于檸檬酸鈉中放入微波爐加熱以修復抗原。使用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，后使用含10%山羊血清的PBS進行封閉1 h。使用相應的一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜，抗體稀釋比例為：8-OHdG（1∶200）、cleaved caspase-3（1∶400）。然后使用相應的熒光二抗孵育1 h，8-OHdG 使用Cy3 羊抗鼠二抗，cleaved caspase-3使用FITC羊抗兔二抗，抗體稀釋比例均為1∶100，隨后用DAPI 染細胞核。滴加抗熒光淬滅劑封片后，使用正置熒光顯微鏡拍照，使用imageJ進行統計分析。

1.2.7 組織線粒體提取 使用商業試劑盒分離心肌組織線粒體和細胞胞漿蛋白，方法依照廠家說明書，使用Western blot的方法分別檢測對應蛋白變化。

1.2.8 心臟超聲 再灌注24 h的小鼠用于評估心臟超聲，方法參考先前的研究［26］。使用1%～2%異氟烷麻醉小鼠并固定于加熱毯上，使體溫保持在37 ℃，心率保持在400～500 beats/min。使用L8-18i-D PROBE超聲探頭（GE Healthcare）在乳頭肌水平的短軸視圖上進行二維導向M型測量，測量包括左室射血分數（LVEF）和左室縮短系數（LVFS）。

1.2.9 心肌梗死面積評估 對再灌注24 h的小鼠心臟切片染色評估梗死面積，使用2%TTC溶液對心肌組織切片于37 ℃進行染色30 min，白色為梗死區域。使用imageJ對估計梗死區域占比。

1.2.10 血清LDH和檢測 血清LDH檢測使用商用試劑盒進行，方法依照生產廠家說明書，使用酶標儀對各個樣品吸光度進行測定，根據說明書計算LDH活性。

1.2.11 血清cTnT 檢測 血清cTnT 檢測使用商用ELISA試劑盒進行檢測，方法依照生產廠家說明書，使用酶標儀對各個樣品吸光度進行測定，根據說明書計算血清cTnT含量。

1.3 統計學處理

本實驗涉及實驗數據均來自于4 次獨立實驗結果。使用均數±標準差表示數據。使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析，比較各組間差異采用單因素方差分析后進行Turkey檢驗，Ρ＜0.05為差異有統計學意義。使用Microsoft excel制作統計圖。

2 結果

2.1 秋水仙堿對H9C2細胞H/R損傷的保護作用

與對照組組相比，H/R處理顯著降低了H9C2細胞的p-AMPK（Ρ＜0.05，圖1B）、NRF2（Ρ＜0.05，圖1E）、SOD2（Ρ＜0.05，圖1F）和Bcl-2（Ρ＜0.05，圖1H）的表達和細胞活力（Ρ＜0.05，圖1J），并使NOX4（Ρ＜0.05，圖1D）、BAX（Ρ＜0.05，圖1G）和cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖1I）表達上升。與H/R組相比，H/R+CCC組p-AMPK（Ρ＜0.05，圖1B）、NRF2（Ρ＜0.05，圖1E）、SOD2（Ρ＜0.05，圖1F）和Bcl-2（Ρ＜0.05，圖1H）的表達和細胞活力（Ρ＜0.05，圖1J）升高，而NOX4（Ρ＜0.05，圖1D）、BAX（Ρ＜0.05，圖1G）和cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖1I）的表達部分降低。

圖1 秋水仙堿對H9C2細胞缺氧復氧損傷的保護作用Fig.1 Protective effect of 3 nmol/L colchicine(CCC)against hypoxia-reoxygenation injury in H9C2 cells.A:Western blots of p-AMPK/AMPK in H9C2 cells with different treatments. B: Quantitative analysis of the p-AMPK/AMPK (n=4). C-I:Western blots of NOX4,NRF2,SOD2,BAX,Bcl-2,and cleaved caspase-3 in H9C2 cells and quantitative analysis of the protein expressions(n=4).J:Quantitative analysis of viability of H9C2 cells.*P＜0.05 vs Control group;#P＜0.05 vs H/R group.

2.2 秋水仙堿可以逆轉I/R 手術導致的小鼠心肌p-AMPK降低

與SO組相比，I/R手術可以降低小鼠心肌p-AMPK（Ρ＜0.05）的表達。與I/R組相比，I/R+CCC組p-AMPK（Ρ＜0.05）表達上升（圖2）。

圖2 秋水仙堿可以逆轉I/R手術導致的小鼠心肌p-AMPK降低Fig.2 Colchicine reverses reduction of myocardial p-AMPK expression induced by I/R in mice. A: Western blots of p-AMPK/AMPK in the myocardium of mice in sham-operated (SO),I/R,and I/R+CCC groups. B:Quantitative analysis of the protein expressions(n=4).*P＜0.05 vs SO group;#P＜0.05 vs I/R group.

2.3 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌線粒體功能障礙

與SO組相比，I/R手術可以降低小鼠心肌ATP含量（Ρ＜0.05）。與I/R組相比，I/R+CCC組ATP含量（Ρ＜0.05）上升。與I/R+CCC組相比，I/R+CCC+DSMP組ATP含量（Ρ＜0.05）下降（圖3）。

圖3 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌線粒體功能障礙Fig.3 Colchicine reverses I/R injury-induced myocardial mitochondrial dysfunction in mice by activating AMPK.Myocardial ATP content is quantitatively analyzed in SO,I/R,I/R+colchicine,and I/R+colchicine+DSMP groups(n=4).*P＜0.05 vs SO group;#P＜0.05 vs I/R group;&P＜0.05 vs I/R+colchicine group.

2.4 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌氧化應激增加

與SO組相比，I/R手術可以提高小鼠心肌NOX4（Ρ＜0.05，圖4B）的表達和8-OHdG陽性染色率（Ρ＜0.05，圖4F），降低NRF2（圖4C）和SOD2（圖4D）的表達。與I/R組相比，I/R+CCC組NOX4（Ρ＜0.05，圖4B）表達和8-OHdG 陽性染色率（Ρ＜0.05，圖4F）降低，NRF2（Ρ＜0.05，圖4C）和SOD2（Ρ＜0.05，圖4D）表達上升。與I/R+CCC 組相比，I/R+CCC+DSMP 組NOX4（Ρ＜0.05，圖4B）表達和8-OHdG陽性染色率（Ρ＜0.05，圖4F）升高，NRF2（Ρ＜0.05，圖4C）和SOD2（Ρ＜0.05，圖4D）表達降低（圖4）。

圖4 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌氧化應激增加Fig.4 Colchicine reverses increased myocardial oxidative stress induced by I/R injury in mice by activating AMPK. A:Western blots of NOX4,NRF2,and SOD2 in the myocardium of mice in SO,I/R,I/R+colchicine,and I/R+colchicine+DSMP groups.B-D:Quantitative analysis of the protein expressions(n=4).E,F:Immunofluorescence staining of 8-OHdG in the myocardium of mice from SO,I/R,I/R+colchicine,and I/R+colchicine+DSMP groups.*P＜0.05 vs SO group;#P＜0.05 vs I/R group;&P＜0.05 vs I/R+colchicine group.

2.5 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌細胞線粒體途徑凋亡增加

與SO 組相比，I/R 手術可以提高小鼠心肌Mito-BAX（Ρ＜0.05，圖5B）和Cyt-Cyto C（Ρ＜0.05，圖5D）的表達。與I/R組相比，I/R+CCC組Mito-BAX（Ρ＜0.05，圖5B）和Cyt-Cyto C（Ρ＜0.05，圖5D）表達降低。與I/R+CCC組相比，I/R+CCC+DSMP組Mito-BAX（Ρ＜0.05，圖5B）和Cyt-Cyto C（圖5D）表達升高（圖5）。

圖5 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌細胞線粒體途徑凋亡增加Fig.5 Colchicine reverses increased mitochondrial pathway apoptosis in mouse cardiomyocytes induced by I/R by activating AMPK.A,B:Western blotting of Mito-BAX in the myocardium of mice from SO,I/R,I/R+colchicine,and I/R+colchicine+DSMP groups(n=4).C,D:Western blotting of Cyt-Cyto C in the myocardium of the mice in the 4 groups(n=4).*P＜0.05 vs SO group;#P＜0.05 vs I/R group;&P＜0.05 vs I/R+colchicine group.

2.6 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌細胞凋亡增加

與SO組相比，I/R手術可以提高小鼠心肌BAX（Ρ＜0.05，圖6B）、cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖6D）的表達和cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖6F）的陽性染色率，降低Bcl-2（Ρ＜0.05，圖6C）的表達。與I/R 組相比，I/R+CCC 組BAX（Ρ＜0.05，圖6B）、cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖6D）表達和cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖6F）的陽性染色率降低，Bcl-2（Ρ＜0.05，圖6C）表達上升。與I/R+CCC組相比，I/R+CCC+DSMP組BAX（Ρ＜0.05，圖6B）、cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖6D）表達和cleaved caspase-3（Ρ＜0.05，圖6F）的陽性染色率升高，Bcl-2（Ρ＜0.05，圖6C）表達降低（圖6）。

圖6 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心肌細胞凋亡增加Fig.6 Colchicine reverses increased myocardial cell apoptosis induced by I/R in mice by activating AMPK.A-D:Western blotting of BAX,Bcl-2,and cleaved caspase-3 in the myocardium of mice in SO,I/R,I/R+colchicine,and I/R+colchicine+DSMP groups(n=4).E,F:Immunofluorescence staining of cleaved caspase-3 in the myocardium of the mice.*P＜0.05 vs SO group;#P＜0.05 vs I/R group;&P＜0.05 vs I/R+colchicine group.

2.7 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心功能下降和心臟損傷

與SO組相比，I/R手術可以提高小鼠心肌梗死面積（Ρ＜0.05，圖7F）、血清LDH（Ρ＜0.05，圖7G）和cTnT（Ρ＜0.05，圖7H）含量，降低LVEF（Ρ＜0.05，圖7B）和LVFS（Ρ＜0.05，圖7C）。與I/R組相比，I/R+CCC組心肌梗死面積（Ρ＜0.05，圖7F）、血清LDH（Ρ＜0.05，圖7G）和cTnT（Ρ＜0.05，圖7H）含量降低，LVEF（Ρ＜0.05，圖7B）和LVFS（Ρ＜0.05，圖7C）上升。與I/R+CCC組相比，I/R+CCC+DSMP組心肌梗死面積（Ρ＜0.05，圖7F）、血清LDH（Ρ＜0.05，圖7G）和cTnT（Ρ＜0.05，圖7H）含量升高，LVEF（Ρ＜0.05，圖7B）和LVFS（Ρ＜0.05，圖7C）下降。各組小鼠心率之間差異無統計學意義（Ρ＞0.05，圖7D）。

圖7 秋水仙堿通過激活AMPK逆轉I/R手術導致的小鼠心功能下降和心臟損傷Fig.7 Colchicine reverses reduced cardiac function and cardiac damage in mice induced by I/R by activating AMPK.A:Representative M-mode ultrasound images of the mice in each group.B-D:Quantitative analysis of the LVEF,LVFS and HR(n=4).E:Representative TTC staining images of the mice in each group.F-H:Quantitative analysis of the infarct area and serum cTnT and LDH levels(n=4).*P＜0.05 vs SO group;#P＜0.05 vs I/R group;&P＜0.05 vs I/R+colchicine group.

3 討論

AMI的高發病率和高死亡率已經為全球衛生事業帶來巨大挑戰，作為其最有要的治療手段——再灌注治療，在治療AMI時，也會對心肌造成嚴重的，乃至不可逆的損傷［27］。本研究探討了秋水仙堿對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，并首次發現秋水仙堿可以通過激活AMPK來抑制缺血再灌注損傷導致的氧化應激和凋亡，并改善小鼠心臟功能。

秋水仙堿是治療急性痛風發作的經典藥物，具有強大的抗炎作用［28］。近期有研究證實秋水仙堿可以通過激活AMPK抑制膽固醇晶體引起的內皮細胞炎癥［29］，但在心肌細胞或者缺血再灌注研究中并未見相關報道。我們首先在H9C2細胞上，使用缺氧復氧的方式模擬缺血再灌注損傷。本研究表明秋水仙堿有助于減少H/R處理引起AMPK磷酸化水平降低，保護了H9C2細胞中AMPK的活性。AMPK是細胞內最重要的能量受體和調節因子之一，在病理情況中，AMPK磷酸化水平可能下降，其活性受到抑制，而激活AMPK有助于改善許多心血管疾病的結局［30,31］。許多研究也證實了激活AMPK可以降低心肌缺血再灌注損傷［32,33］。因此本研究結果預示著秋水仙堿可以通過激活AMPK來對抗心肌缺血再灌注損傷。

為更進一步驗證本研究的觀點，我們對小鼠行I/R手術以更為真實地模擬AMI后的再灌注治療造成的損傷。首先發現秋水仙堿治療的確可以抑制小鼠心肌再灌注區域AMPK磷酸化的降低，與細胞實驗取得的結果相似。AMPK具有調節線粒體功能的作用，許多研究也證實激活AMPK可以減少I/R損傷［32,34］。推測秋水仙堿在改善再灌注導致的小鼠心肌的損傷中具有AMPK依賴性。為明確秋水仙堿是否能夠在動物整體研究中同樣能夠發揮抗氧化應激、抗凋亡的作用，以及秋水仙堿發揮保護作用是否是通過AMPK來完成，在后續實驗中使用DSMP來抑制AMPK的活性。

線粒體功能障礙是缺血再灌注損傷中的最重要的原因［35］。線粒體作為細胞的能量工廠，因再灌注損傷導致其功能損傷可以引起能量物質ATP的產生減少，并增加活性氧的產生和介導線粒體途徑的細胞凋亡，導致細胞功能下降［36,37］。我們檢測了心肌組織中ATP含量的變化，結果顯示I/R引起心肌組織中ATP含量的下降，此時線粒體內中出現功能障礙，正常的電子傳遞受阻，ATP合成障礙，導致大量活性氧生成，引起氧化應激反應，造成心肌功能損傷。隨后檢測了氧化應激反應相關蛋白分子，并對切片進行了8-OHdG染色，證實了I/R引起了強烈的的氧化應激反應。秋水仙堿治療可以通過AMPK依賴的方式降低與I/R有關的氧化應激反應。

正常情況下BAX駐留在細胞質中，當接收到死亡信號后，轉至線粒體并促進Cyt C釋放入胞質，啟動線粒體途徑的凋亡［38］。本研究檢測到線粒體BAX表達增高，而胞漿中Cyto C表達上升，表明線粒體途徑的凋亡啟動。同時，也發現心肌組織整體的凋亡水平增加。而秋水仙堿可以通過激活AMPK降低心肌的線粒體凋亡和整體凋亡水平。

I/R引起的心肌氧化應激反應和凋亡水平增加，最終體現在了心臟功能下降，導致心力衰竭甚至心源性休克，威脅個體生命。我們運用超聲、染色和血清學檢測，分別評估了受損心臟的功能、梗死面積和損傷程度，結果提示秋水仙堿可以減少I/R導致的LVEF和LVFS降低和梗死面積、LDH、cTnT的升高，減少了心肌損傷，保護了心臟功能。而抑制AMPK則可以抵消秋水仙堿的保護作用，這意味著AMPK是秋水仙堿發揮保護作用的重要媒介。

總之，本研究首次證實秋水仙堿這一經典的抗炎藥物可以通過激活AMPK來減少心肌缺血再灌注損傷，逆轉心功能下降。本研究為該經典藥物被創新性地應用在預防心肌再灌注損傷中提供了理論依據。