綠原酸減輕膿毒癥誘導的小鼠急性腎損傷：基于抑制caspase-1經典細胞焦亡信號通路

房尚萍，孫任珂，蘇 慧，翟科程，項 毓，高楊夢娜，郭文俊

皖南醫學院1麻醉學院，2麻醉學實驗實訓中心，3第一附屬醫院，安徽 蕪湖241002

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征［1］，腎臟是在感染后發生瀑布式炎癥反應的主要攻擊器官之一［2,3］。膿毒癥急性腎損傷是因宿主對感染的反應失調，誘發炎癥反應，嚴重危及患者生命［4,5］。盲腸結扎穿刺（CLP）是模擬膿毒癥發生發展的常用動物模型，剖腹術在回盲瓣下結扎、穿刺盲腸［6］。由于盲腸充滿大量細菌，穿刺會導致多菌性腹膜炎、細菌移位進入血液，導致多器官功能障礙甚至感染性休克，最后導致死亡［7,8］。目前臨床上膿毒癥治療仍是棘手問題，有待進一步研究和探索。糖皮質激素具有抑制炎癥反應的作用，是治療膿毒癥的重要輔助藥物，占珠琴等［9］研究證實0.5 mg/kg地塞米松即可對膿毒癥急性腎損傷具有保護作用。何荷等［10］研究表明地塞米松可下調ROS/TXNIP/NLRP3信號通路表達水平，抑制炎癥分子產生及細胞焦亡發生,有效減輕膿毒癥小鼠肺損傷發生發展。地塞米松是一種有效的抗炎、抗過敏和抗毒作用，能有效減輕組織和細胞的炎癥反應，常用于急性膿毒癥的治療［11］，在本研究中用于陽性對照。

綠原酸（CGA）是一種存在于高等雙子葉之和和蕨類植物中的一類多酚類化合物，由咖啡酸的1位羧基和奎尼酸的3位羥基縮合成酯的天然產物［12］。膿毒癥引起的肺損傷的機制與細胞焦亡關系密切［13,14］，膿毒癥發生后會誘導機體產生依賴天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶,釋放炎性因子白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-18為特征的程序性細胞死亡［15,16］。徐靜紅等［17］研究表明，綠原酸能通過調節TLR4/NF-κB信號發揮抗炎作用，保護脂多糖（LPS）誘導的急性腎損傷小鼠。何荷等［10］發現綠原酸可通過下調ROS/TXNIP/NLRP3信號通路表達水平，抑制炎癥分子產生及細胞焦亡發生，有效減輕膿毒癥小鼠肺損傷。但綠原酸能否通過抑制NLRP3炎性小體進而抑制caspase-1介導的焦亡途徑，進而降低炎癥因子的表達保護膿毒癥性AKI呢？目前尚未有文獻報道綠原酸通過抑制NLRP3炎性小體，從而抑制caspase-1經典焦亡通路，保護膿毒癥急性腎損傷。故本實驗探究綠原酸是否通過抑制NLRP3/caspase-1經典細胞焦亡信號通路對AKI的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性C57Bl/6J小鼠24只，6～8周齡，體質量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物使用許可證號SCXK（京）2019-0010，本實驗動物研究符合皖南醫學院實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準（動物倫理批準號：2023-005），實驗遵循3R原則。將上述小鼠使用隨機數字表方法分成4組：假手術組（Sham 組，n=6）、CLP 組（n=6）、CLP+地塞米松組（CLP+DXM組，n=6）、CLP+綠原酸組（CLP+CGA組，n=6）。

1.2 主要試劑與儀器

綠原酸（上海吉至生化科技有限公司，C78051），地塞米松磷酸鈉注射液（辰欣藥業股份有限公司，國藥準字H37021959）。尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、腎損傷分子-1（KIM-1），IL-18和IL-1β的ELISA 試劑盒（江蘇菲亞生物科技）。Gasdermin-D 抗體（武漢三鷹生物公司），caspase-1、NLRP3 和GAPDH 抗體（Cell Signal Technology）。

1.3 方法

1.3.1 膿毒癥性 AKI小鼠模型的建立參考文獻［18］中盲腸結扎穿刺法建立膿毒癥小鼠模型，適應性飼養1周，術前禁食12 h，正常飲水，1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，仰臥位固定后，備皮酒精消毒，沿腹部正中線開1 cm左右切口，逐層切至腹腔，游離腸系膜和盲腸，于盲腸血管弓內游離部至根部中外1/3處結扎，同時用滅菌的1 mL注射器針頭貫通結扎的盲腸末端，并擠出綠豆大小的腸內容物，回納盲腸至腹腔，關腹。sham組僅開腹，未結扎穿刺盲腸。造模成功小鼠表現：小鼠精神萎靡、嗜睡，活動少、怕冷、豎毛反應、呼吸急促。造模后的小鼠進行分組：sham組、CLP組、CLP+地塞米松組（CLP+DEX組）、CLP+綠原酸組（CLP+CGA組）。分別于造模后12 h持續靜脈泵注生理鹽水（NS）15 mg/kg，NS 15 mg/kg，地塞米松1 μg/kg，綠原酸15mg/kg 6 h［19］，如小鼠在此期間出現體動，需追加戊巴比妥鈉（50 mg/kg）1/4劑量，直至實驗結束。觀察各組小鼠7 d生存率。

1.3.2 樣本采集 各組小鼠均在持續靜脈泵注藥物結束8 h［10］，眼球靜脈采血1～2 mL，室溫下血液自然凝固后3000 r/min離心20 min 后取上清保存于-80 ℃用于血清炎癥因子及腎功能指標尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）和尿液腎損傷分子1（KIM-1）檢測；開腹后游離腎組織，觀察小鼠腎組織形態，右腎上1/3用10%甲醛固定后，用于HE染色及TUNEL染色觀察，左腎及剩余右腎組織保存于-80℃：用于腎組織相關基因及蛋白檢測。

1.3.3 HE染色 小鼠右腎上1/3用10%甲醛固定后石蠟包埋切片，然后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化并拍照。

1.3.4 TUNEL染色 小鼠右腎上1/3用10%甲醛固定后石蠟包埋切片，按試劑盒說明書檢測腎臟組織細胞凋亡情況，每張切片隨機選取5個視野。

1.3.5 ELISA檢測 用上述血清樣本，按照ELISA試劑盒操作步驟檢測血清炎癥因子IL-1β、IL-18、尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）；提取尿液按照ELISA試劑盒操作步驟檢測腎損傷分子1（KIM-1）。

1.3.6 Western blotting 小鼠左腎蛋白稱質量后，提取組織蛋白，BCA法測定蛋白含量，取適量分裝好的蛋白，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮10 min使蛋白變性，冷卻至室溫。每個樣本20 μg蛋白經電泳后轉移到膜上，室溫封閉2 h，然后分別與抗NLRP3、caspase-1、Gasdermin-D抗體以及GAPDH抗體（1∶1000稀釋）在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次，室溫下與相應的二抗孵育1 h，用增強化學發光（ECL）顯色并拍照，Image J軟件掃描并計算蛋白相對表達量。

1.3.5 qRT-PCR 用TRIzol提取小鼠剩余左腎總RNA。使用TAKARA（RR037A）將mRNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，在Biosystems 7500 Real Time PCR 系統上使用TAKARATB Green?Premix Ex Taq?RT-PCR試劑盒進行qRT-PCR。反應條件：預變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火-延伸60 ℃34 s，40個循環。引物序列：GAPDH，Forward-CGTCCCGTAGACAAAATG，Reverse-TTGATGGCAACAATCTCCAC；TNF-α，Forward-TA CTGAACTTCGGGGTGA，Reverse-ACTTGGTGGTT TGCTACG；IL-1β，Forward-GAAATGCCACCTTTT GACAGTG，Reverse-TGGATGCTCTCATCAGGACA G；IL-18，Forward-GTGAACCCCAGACCAGACTG，Reverse-CCTGGAACACGTTTCTGAAAGA；ASC，Forward-GACAGTGCAACTGCGAGAAG，Reverse-CGACTCCAGATAGTAGCTGACAA。

1.3.6 統計學分析 所有統計分析采用GraphPad Prism 7.0軟件進行。數據用均數±標準差表示，多組間比較采取單因素方差分析，組內兩兩比較采用bonferroni法。當Ρ＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 綠原酸對膿毒癥小鼠7 d生存率的影響

術后7 d，CLP 組小鼠生存率明顯降低，而CLP+DEX組和CLP+CGA組小鼠生存率明顯升高，差異具有統計學意義（圖1，Ρ＜0.05）。

2.2 綠原酸對膿毒癥小鼠腎組織損傷的影響

2.2.1 肉眼觀察小鼠腎臟外觀 對照組小鼠腎臟大小正常，紅褐色有光澤，包膜緊密；CLP組腎組織整體腫脹，體積變大，充血明顯，包膜增厚，CLP+Dex組和CLP+CGA組腎組織大小接近對照組，紅褐色，充血減輕。質地堅硬，包膜增厚（圖2A），腎臟系數結果顯示CLP組明顯提高，CLP+Dex組和CLP+CGA組腎臟系數接近對照組，差異較CLP組明顯降低，差異具有統計學意義（Ρ＜0.05，圖2B）。

圖2 綠原酸改善膿毒癥小鼠腎組織大體觀及腎臟系數Fig.2 CGAimproves renal morphology(A)and kidney coefficient(B)in sepsis mice.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

2.2.2 HE染色結果 sham組腎組織結構相對正常，CLP組小鼠腎組織中腎小球毛細血管擴張，腎小管上皮細胞腫脹等變形脫落的情況，間質水腫明顯，炎癥細胞浸潤。地塞米松和綠原酸治療后，小鼠腎小球毛細血管擴張減少，腎小管上皮細胞脫落不明顯，腎間質水腫和炎癥細胞浸潤減輕。CLP組腎組織病理評分明顯增加，綠原酸可明顯改善腎組織病理評分（圖3）。

圖3 HE染色檢測各組腎組織病理損傷情況Fig.3 Renal pathologies in each group(Original magnification: ×400). A-D: HE staining of the kidney tissues in each group. E: kidney pathological score.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

2.3 綠原酸對膿毒癥小鼠炎癥因子表達的影響

與sham組相比，CLP組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-18 mRNA表達和血清中TNF-α、IL-1β、IL-18的含量明顯升高；地塞米松和綠原酸治療后小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-18 mRNA表達和血清中TNF-α、IL-1β、IL-18的含量明顯降低（Ρ＜0.05，圖4）。

圖4 綠原酸減輕膿毒癥小鼠腎損傷的炎癥因子Fig.4 CGA reduces inflammatory cytokines in septic mice with acute renal injury.A-C:qRT-PCR for detecting changes of TNF-α,IL-1β and IL-18 mRNAexpressions in the kidney tissues.D-F:ELISAfor detecting serum levels of TNF-α,IL-1β and IL-18.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

2.4 綠原酸對膿毒癥小鼠腎組織生化指標的影響

與sham組相比，CLP組小鼠血清中BUN、Scr、尿KIM-1的水平明顯升高（Ρ＜0.01）。綠原酸治療后，小鼠血清中BUN、Scr、尿KIM-1的水平明顯下降，差異均具有統計學意義（Ρ＜0.05，圖5）

圖5 綠原酸減輕膿毒癥小鼠腎損傷的生化指標Fig.5 CGA improves renal function parameters in septic mice.A-C:ELISA for detecting changes of serum levels of BUN,Scr and KIM-1.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

2.5 綠原酸對膿毒癥小鼠腎組織細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果顯示CLP組小鼠腎組織細胞凋亡率顯著升高，地塞米松和綠原酸處理后能夠降低膿毒癥小鼠腎組織中細胞凋亡率（Ρ＜0.05，圖6）。

圖6 綠原酸減輕膿毒癥小鼠組織細胞凋亡Fig.6 CGA reduces renal cell apoptosis in septic mice.A:TUNEL staining of the renal tissue.B:Renal cell apoptosis rate.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

2.6 綠原酸對膿毒癥小鼠腎組織NLRP3炎性小體表達的影響

與sham 組相比，CLP 組小鼠腎臟組織NLRP3、caspase-1蛋白和ASC mRNA水平明顯表達明顯升高，地塞米松和綠原酸治療后，小鼠腎臟組織NLRP3、caspase-1蛋白和ASC mRNA表達明顯降低（Ρ＜0.05，圖7）。

圖7 綠原酸抑制膿毒癥小鼠腎組織NLRP3炎性小體表達Fig.7 CGA inhibits the expression of NLRP3 inflammasomes in renal tissues of septic mice. A-C: Western blotting for detecting changes in NLRP3 and caspase-1 in the kidneys of the mice with acute kidney injury.D:qRT-PCR for detecting changes of ASC mRNA expression in the kidney tissues.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

2.7 綠原酸對膿毒癥小鼠腎組織GSDMD-N 表達的影響

與sham組相比，CLP組小鼠腎臟組織Casp1-p20、GSDMD-N蛋白表達升高，地塞米松和綠原酸治療后，小鼠腎臟組織Casp1-p20、GSDMD-N表達明顯降低，差異具有統計學意義（Ρ＜0.05，圖8）。

圖8 綠原酸減弱膿毒癥小鼠腎組織caspase-1及GSDMD-N的表達Fig.8 CGAreduces expressions of caspase-1 and GSDMD-N in renal tissues of septic mice.A-C:Western blotting for detecting changes in caspase-1 and GSDMD-N in the kidneys of septic mice with acute kidney injury.*P＜0.05 vs sham Group;#P＜0.05 vs CLP group.

3 討論

CLP作為研究膿毒癥最常見的動物模型，腎臟是其中受累的器官之一，會引發急性腎損傷［20］。其是膿毒癥患者常見且嚴重的并發癥之一［21］。本研究結果中，采用CLP構建膿毒癥腎損傷模型，發現小鼠7 d生存率明顯降低。肉眼觀測腎組織整體腫脹，體積變大，充血明顯，包膜增厚等大體結構改變，血清BUN、Scr、KIM-1表達明顯增高，說明CLP構建的急性膿毒癥損傷模型是構建成功的。馮秀晶等［22］研究發現，脂多糖（LPS）誘導的急性腎損傷大鼠，血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿液腎損傷分子1（KIM-1），及TNF-α，IL-6，IL-1β等血清炎癥因子明顯升高，說明膿毒癥導致的腎損傷不僅會影響腎組織的功能，會引起全身炎癥反應。地塞米松是一種有效的抗炎、抗過敏和抗毒作用，能有效減輕組織和細胞的炎癥反應，常用于急性膿毒癥的治療［23,24］，因此本研究中用于陽性對照。本研究發現，地塞米松治療后，膿毒癥小鼠的7 d生存率明顯提高，腎臟大體觀明顯好轉，及腎損傷后血清中的相關指標BUN、Scr和KIM-1明顯降低，提示地塞米松可減輕膿毒癥腎損傷的癥狀。雖然地塞米松抗炎、抗過敏、免疫抑制作用突出，但停藥后可能出現停藥綜合征，如頭暈、昏厥、腹痛等癥狀；長期、大量使用地塞米松，免疫功能會被抑制，導致機體免疫力低下，及感染、胃腸道刺激等其他副作用［25］?；诖?，需要尋找其他類似藥物替代地塞米松治療膿毒癥急性腎損傷的藥物。

綠原酸作為一種天然的多酚類化合物，具有明顯的抗炎作用［26］。本研究發現綠原酸干預后膿毒癥小鼠的7 d生存率改善，王翔等［19］研究發現與本研究一致，綠原酸可改善膿毒癥模型大鼠7 d生存率，可能的原因是綠原酸改善小鼠腎組織血管通透性，引起腎組織損傷，進一步發展為多器官功能障礙導致死亡。本研究發現腎臟大體觀和腎臟病理切片炎癥滲出明顯好轉；腎損傷后血清中的相關指標BUN、Scr和尿KIM-1明顯降低，馮秀晶等［27］研究發現，綠原酸通過激活Nrf2信號通路促進下游HO-1和NQO1蛋白表達，抑制NLRP3炎癥小體激活，減輕炎癥級聯瀑布反應，從而對LPS誘導的大鼠AKI起到保護作用，說明綠原酸可緩解膿毒癥急性腎損傷。

本研究發現，綠原酸干預后腎組織的凋亡細胞數量明顯減少，表明綠原酸能明顯抑制細胞死亡。Ranjbary等［11］研究發現，綠原酸可治療結腸癌，對結腸癌細胞系具有細胞毒性、引起細胞周期阻滯和誘導凋亡。NLRP3炎性小體介導的細胞焦亡調控膿毒癥的發生發展，NLRP3，ASC 蛋白 及caspase-1 蛋白及下游 的Gasdermin-D蛋白是細胞焦亡的重要的蛋白。細胞在感受到外來信號刺激后，激活NLRP3 炎性小體，caspase-1 前體蛋白被剪切，形成具有活性的cleaved caspase-1，并剪切IL-18、IL-1β前體形成有生物活性的成熟體。同時caspase-1通過剪切Gasdermin-D蛋白誘導細胞焦亡，使細胞發生腫脹和滲透性溶解［28,29］。本研究發現，膿毒癥AKI 小鼠腎組織中NLRP3 的表達增加。Li等［30］研究發現，NLRP3缺陷，可通過減少腎臟炎癥和缺鐵性貧血來減輕LPS誘導的膿毒癥相關急性腎損傷，表明NLRP3對膿毒癥急性腎損傷的促進作用。NLRP3炎性小體激活可促進caspase-1裂解，進而激活下游的炎癥因子IL-18、IL-1β的表達，從而促進炎癥反應和腎損傷發展［31］。本研究結果顯示，CLP組小鼠腎臟組織中NLRP3和ASC的表達較sham組明顯升高，說明膿毒癥時NLRP3炎性小體被激活；同時caspase-1蛋白及下游的炎癥因子IL-18、IL-1β的表達明顯增加，說明caspase-1焦亡通路被激活。Chai等［26］研究發現，膿毒癥心肌損傷時經典的NLRP3-casepase-1信號通路是被激活的。

綠原酸是源自高等雙子葉之和和蕨類植物中的一類多酚類化合物，具有調節脂肪因子、抗炎和抗氧化應激的作用［32］。本研究發現綠原酸干預后，NLRP3、ASC，caspase-1和GSDMD-N蛋白表達顯著降低。膿毒癥發生時，caspase-1經典細胞焦亡途徑被激活，首先激活NLRP3，以NLRP3為代表的炎性小體則進一步切割活化caspase-1，活化的caspase-1促進IL-1β和IL-18等炎癥因子的產生，還可以切割GSDMD的N端結構域，介導細胞焦亡發生。綠原酸首先抑制NLRP3和ASC等結構的NLRP3 炎性小體的活化，進而抑制caspase-1 活化，導致caspase-1 p20亞基，Gasdermin-D蛋白及下游的炎癥因子IL-18、IL-1β的表達降低。劉暢等［33］研究發現綠原酸可能通過提高miR-223 水平，靶向抑制NLRP3表達,降低LPS誘導的急性肺損傷小鼠炎癥反應,緩解肺組織病理損傷。劉帆等［34］研究發現，綠原酸可緩解Aβ誘導的AD小鼠神經損傷及NLRP3炎癥小體活化。說明綠原酸在不同疾病中可通過抑制NLRP3炎性小體活化，達到治療疾病的目的。后期我們將進一步深入研究綠原酸是否對miR-223等micro-RNA的影響，進而抑制NLRP3炎性小體的活化，最終影響caspase-1經典細胞焦亡途徑。

綜上所述，本研究發現綠原酸可減輕膿毒癥小鼠急性腎損傷，抑制caspase-1經典細胞焦亡途徑的活化，NLRP3炎性小體表達，對膿毒癥小鼠具有保護作用。