青楷槭樹葉成分分析及其提取物的抗氧化能力研究

夏偉良，王美淇，張惠銘，邢楓，金鐵巖

延邊大學農學院 （延吉133002）

青楷槭（AcertegmentosumMaxim.）又稱為青楷子、遼東槭，是無患子科槭屬植物，其樹形高大挺拔，葉色翠綠繁茂，是一種極具園藝觀賞價值的樹種。它生長在中國黑龍江、吉林、遼寧等省，在俄羅斯遠東地區和朝鮮北部也很常見[1]。青楷槭樹高10～15 m，樹皮灰色，表面光滑，枝干無毛。葉尖及上面深綠色，有光澤，葉面淺綠色，葉脈腋處有淡黃色毛，近圓形或橢圓形，長10～12 cm，寬7.0～9.0 cm，鈍尖，有強烈的齒。莖光滑，長4.0～7.0 cm，4月開花，9月結果?；S綠色，單性，無毛?；ūP和子房光滑，雄蕊短，雄蕊略帶流蘇，稍彎曲。種子有光澤，棕黃色，堅果稍扁平，翅鈍或幾乎水平展開，果柄細長，約5.0 mm[2]。研究表明，節疤樹根、枝和樹皮的提取物富含黃酮類、紅景天苷和香豆素等多種化合物，具有抗氧化、抗菌、消炎和降血脂等作用，被廣泛用于治療出血性傷口和化膿性皮膚感染。最初對楓香的研究主要集中在該樹種的栽培和生態方面，杜欣勇等[1]將楓香作為研究對象，在不同的土壤條件下開展研究，為楓香造林工作奠定了基礎；其次王興華[3]研究槭樹的生物學特性和生長期的相關管理，為槭樹的開發和利用奠定了基礎。近年來，槭樹逐漸被發現，不僅可用于觀賞，其各種組織還具有重要的藥用和治療作用，如：鄔楠等[4]發現，從槭樹樹干樹皮中提取的提取物可有效預防脂多糖誘導的小鼠敗血癥，其機制被認為與提取物的抗氧化能力以及減少TNF-α和IL-6的釋放有關；張鑫等[5]以青楷槭樹皮水提取物為起始原料，進一步進行抗氧化和抗菌活性的體外研究，結果表明青楷槭熱水提取物具有良好的自由基清除能力和抗菌能力；劉便強等[6]對青楷槭熱水提取物的抗氧化和抗菌活性開展小試，結果表明青楷槭熱水提取物具有良好的自由基清除能力和抗菌能力。研究了青楷槭不同部位提取物的抗氧化活性，結果表明各層均具有良好的抗氧化活性，其中乙酸乙酯層的抗氧化活性最強。在韓國和日本的民間醫學中，青楷槭被認為是治療疾病的良藥。國外研究表明，楓葉提取物含有大量活性物質，具有廣泛治療特性，是功能食品和草本天然藥物的候選品種，具有良好的市場前景。關于青楷槭的抗氧化活性，Lee等[7]發現青楷槭皮提取物具有很好的清除自由基和三價鐵還原能力，而乙醇提取物的抗氧化活性更好；Eun等[8]在對青楷槭的抗糖尿病活性研究中證實青楷槭皮提取物的抗糖尿病作用。提取干燥的青楷槭莖，發現它能抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，而抑制α-淀粉酶能提高抗氧化活性。Kwon等[9]在對青楷槭提取物的抗糖尿病活性進行研究時發現，青楷槭皮提取物對肝癌細胞的生長有顯著的抑制作用；Cho等[10]在對青楷槭提取物的高血脂酸化活性進行研究時發現，青楷槭莖和樹皮提取物能降低血脂水平，使脂肪細胞體積縮小60 μg/mL。綜上所述，青楷槭在藥物產品的生產方面越來越受到青睞，從青楷槭中提取的黃酮與多酚等物質可清除自由基，具有很好的抗氧化能力，在降血脂、抑制糖尿病等方面的效果十分顯著。但現階段人們對其相關的深入生物活性研究并不充分，如：僅限于在其莖皮與樹皮方面的研究，其他組織的生物活性方面還有待挖掘；青楷槭生理活性的研究中有較多測定指標，但對青楷槭樹葉的體外抗菌抗癌研究缺少相關機制的闡述；在抗癌活性的研究中有較多局限還在傳統認知的肝癌上，存在單一性，對于其他癌細胞是否能抑制尚不清楚。因此對青楷槭樹葉 的生物活性研究進行更深入研究將對青楷槭的資源利用及推動青楷槭產業化發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青楷槭樹葉：2022年5月于吉林省琿春市采集。

硫酸銅、硫酸鉀、乙腈、苯酚、亞甲基藍指示劑等，均為分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司；亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁[Al(NO3)3]、氫氧化鈉（NaOH）、抗壞血酸（VC）、檸檬酸（CTA），均為分析純；DPPH標準品（色譜純）、ABTS標準品（超純），均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

分析天平（YP2002型，上?？平虄x器有限公司）；紅外線水分測定儀（CSY-H5A型，深圳市分析儀器制造有限公司）；馬弗爐（KSW型，沈陽市節能電爐廠）；索氏提取儀（SZF-06C型，浙江托普儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（DC-0506型，南京舜瑪儀器設備有限公司）；全自動凱氏定氮儀（KN680型，濟南阿爾瓦儀器有限公司）；原子吸收光譜儀（OES6000型，江蘇天瑞儀器股份有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101型，泰斯特儀器有限公司）；紫外可見分光光度計[V-5800（PC）型，上海元析儀器有限公司]；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型，無錫沃信儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（RE-2000B型，鞏義市瑞德儀器設備有限公司）；全波長酶標分析儀（HBS-ScanY型，南京德鐵實驗設備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 青楷槭樹葉預處理

將試驗用青楷槭樹葉清洗干凈，在通風處晾曬之后由粉碎機進行粉碎，放入-20 ℃冰箱中儲存備用。

1.3.2 青楷槭樹葉一般成分測定

水分測定，取2.0 g左右青楷槭樹葉粉末置于紅外線水分測定儀托盤中，均勻鋪平，根據儀器提示規范操作，于105 ℃快速烘干，水量將以百分比直接顯示在儀表屏幕上。

粗灰分含量測定，參照GB 5009.4—2016 《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》；蛋白質含量測定，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》；粗脂肪含量測定，參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》；碳水化合物含量測定，以青楷槭樹葉碳水化合物含量為100%中減去水分、粗灰分、蛋白質和粗脂肪所測定的含量；總膳食纖維含量測定，參照GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》。

1.3.3 游離糖含量

參照GB 5009.8—2016 《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》測定。

1.3.4 青楷槭樹葉提取物抗氧化能力

將青楷槭樹葉粉碎，過孔徑0.180 mm（80目）篩，取50 g青楷槭樹葉粉末按不同料液比、提取溫度、提取時間進行制備，制備好的樣品分別旋轉濃縮，而后凍干成粉末，最終得到青楷槭樹葉乙醇提取物（ATEE）和青楷槭樹葉熱水提取物（ATWE），于4 ℃冰箱儲存備用。對青楷槭樹葉提取物設計體外抗氧化試驗測定青楷槭樹葉提取物的抗氧化性。

DPPH自由基清除能力：參考Williams等[11]的方法稍作修改，測定ATEE和ATWE對DPPH自由基的清除能力。將ATEE和ATWE與陽性對照VC的溶液設置為0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL。稱取30 μg的DPPH粉末，用無水乙醇定容至100 mL。將樣品溶液與 DPPH溶液按1∶1比例加入96孔板中，在避光條件按式（1）計算。

式中：A空白為100 μL DPPH溶液+100 μL蒸餾水的吸光度；A樣品為100 μL DPPH溶液+100 μL樣品溶液的吸光度。

ABTS+自由基清除能力：參考Garzon等[12]方法稍作修改，測定ATEE和ATWE對ABTS+自由基清除能力。

將7 mmol/L ABTS與 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，遮光處理16 h，配得ABTS+儲備液。在測定ABTS+自由基清除能力前，將ABTS+儲備液在734 nm波長處用蒸餾水稀釋至吸光度為0.70±0.02的工作液。使用蒸餾水將待測樣品溶液配制成質量濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的溶液作為待測液，備用。取0.1 mL樣品溶液與3.9 mL ABTS+儲備液充分混勻后靜置6 min，于734 nm波長處測吸光度，記為Ai；使用相同方法，取3.9 mL ABTS+溶液與0.1 mL蒸餾水混合，測定吸光度A0，取3.9 mL蒸餾水與0.1 mL樣品溶液混合，測定吸光度為Aj。ABTS+清除率按式（2）計算。

式中：Ai為樣品吸光度；Aj為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

鐵離子還原能力：參照邵郅勝等[13]的測定方法稍加改動，測定ATEE和ATWE對鐵離子的還原能力。分別移取5 mL質量濃度為0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的ATEE和ATWE稀釋液和陽性對照檸檬酸于試管中，分別加入5 mL 0.1% K3[Fe(CN)6]溶液和5 mL pH 6.6的PBS緩沖液充分混勻，在50 ℃下恒溫水浴25 min后加入5 mL 10% TCA溶液充分反應。取反應后的溶液5 mL加入等量蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3溶液后放置10 min，于波長700 nm處測定其吸光度。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次，使用 Excel 2020統計與計算數據；利用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 青楷槭樹葉一般成分的分析

試驗測定青楷槭樹葉中的一般成分含量，結果如表1所示。青楷槭樹葉中水分、粗灰分、粗脂肪、蛋白質以及碳水化合物含量分別為13.11%，4.68%，5.36%，19.57%和56.28% 。在青楷槭樹葉的碳水化合物中，膳食纖維在其中占比較高，含量為49.07%。膳食纖維在人體中發揮著重要的生理作用，它能改善腸道微生物結構，降低血糖和血脂水平，有助于預防肥胖、糖尿病和其他慢性疾病。膳食纖維可以增加有益菌的數量，抑制有害菌的生長，從而改善腸道菌群結構，通過調節胰腺的胰島素和葡萄糖分泌，改善代謝紊亂和胰島素拮抗作用，改變細胞氧化和抗氧化之間的平衡，減緩炎癥反應，從而降低體內血糖水平，維持血糖穩定[14]。

表1 青楷槭樹葉一般成分含量

2.2 青楷槭樹葉游離糖含量的分析

試驗測定青楷槭樹葉中游離糖的含量，結果如表2所示。青楷槭樹葉中的果糖含量最為豐富，其含量達5.08%，其次是葡萄糖，含量為3.42%，其中未檢測出麥芽糖和乳糖。果糖能使人精力充沛，減輕疲勞。適量果糖能提高血糖水平，減少低血糖癥，即低血糖引起的冷汗和黑眼圈[15]。

表2 青楷槭樹葉游離糖含量的分析

2.3 DPPH自由基清除能力

與抗氧化劑的有效成分結合后，抗氧化劑的顏色消失，與抗氧化劑反應后，DPPH自由基被還原，導致吸收值下降，還原速度與它接受電子的數量，即自由基吸收能力有定量關系[16]。如圖1所示，在試驗濃度范圍內，ATEE和ATWE的DPPH自由基清除率均與樣品濃度關系呈正向相關，并在質量濃度1 mg/mL時，清除率分別為86.25%和64.03%。在測試范圍內，ATEE的DPPH自由基清除率均高于ATWE，綜上所述，ATEE與ATWE均有較好的DPPH自由基清除能力，且ATEE的DPPH自由基清除能力優于ATWE。

圖1 ATEE和ATWE的DPPH自由基清除能力

2.4 ABTS陽離子自由基清除能力

如圖2所示，在試驗濃度范圍內，隨著濃度的上升，ATEE和ATWE對ABTS+自由基清除能力也逐漸增強，且在質量濃度1 mg/mL時，ATEE清除率達93.31%，此時ATWE清除率為78.96%?？傮w而言，ATEE與ATWE均具有較好的ABTS+自由基清除能力，且ATEE在ABTS自由基清除能力上優于ATWE。

2.5 鐵離子還原能力

鐵的還原能力是指在抗氧化劑存在下鐵的還原程度（從三價鐵到二價鐵的轉變）。分子一旦被還原就會改變顏色，在700 nm波長處二價鐵含量與吸光度呈正相關關系，從而可通過分光光度法進行測定[17]。如圖3所示，在試驗濃度范圍內，隨著ATEE和ATWE質量濃度的增大，兩者的鐵離子還原能力均升高，濃度較低（0～0.1 mg/mL）時，兩者所對應的鐵離子還原力相差不大，隨質量濃度升高（0.1～1 mg/mL），ATEE和ATWE鐵離子還原力均有較大提升，質量濃度達到1 mg/mL時，ATEE的吸光度為2.76和ATWE的吸光度為1.84。綜上所述，ATEA與ATWE均具有極強的鐵離子還原能力，且ATEE的鐵還原能力優于ATWE。

圖3 ATEE和ATWE的鐵離子還原能力

3 結論

試驗測定青楷槭樹葉中的基本成分、游離糖含量及其提取物的抗氧化能力。

青楷槭樹葉中富含碳水化合物，其中很大一部分是纖維。研究和報告表明，膳食纖維可降低心血管疾病、冠心病、肥胖癥、糖尿病和其他疾病的風險[18]；青楷槭樹葉的膳食纖維含量較高，對改善相關領域可能具有良好的潛力，但可溶性與不可溶性成分的比例以及是否存在有效的活性功能還需進一步分析和研究。

果糖、葡萄糖和半乳糖是人體內的主要單糖，攝入相同量的果糖和葡萄糖時，攝入葡萄糖后血糖升高的速度遠高于攝入果糖后血糖升高的速度，因此果糖及相關周邊產品被廣泛應用于糖尿病患者的膳食參考標準中；試驗表明，果糖可作為能量來源，促進ATP合成，促進紅細胞增殖，保護和維持正常的生理功能；青楷槭樹葉中果糖含量較高，這為青楷槭樹葉作為功能性食品原料提供理論依據。

結果表明：青楷槭樹葉水分為13.11%，粗灰分為4.68%，粗脂肪為5.36%，蛋白質為19.57%，碳水化合物為56.28%，總膳食纖維為49.07%；青楷槭樹葉中檢測出3種游離糖，其中果糖、蔗糖、葡萄糖的含量分別為5.08%，1.37%和3.42%，未檢測出麥芽糖和乳糖。在青楷槭樹葉提取物的抗氧化試驗中，將3種不同類型的抗氧化測定作為檢測指標，結果表明ATEE和ATWE均具有良好的抗氧化能力，且兩者質量濃度均與其抗氧化能力呈現正相關關系，并在總體上ATEE抗氧化能力優于ATWE。