Twist調控人胃癌組織中的上皮間質轉化和血管生成擬態作用機制研究

于淇?張兆堃?鄂思含?李露露?徐萬鵬

摘 要｜目的：研究Twist促進VM的形成，豐富和完善了血管生成擬態理論。方法：觀察胃癌組織及正常胃組織Twist、EMT標志蛋白（E-cadherin和Vimentin）及VM標記物CD34-PAS的表達情況，分析Twist、EMT標志蛋白與胃癌臨床病理特征的相關性，研究VM與EMT標志蛋白的關系，Twist與EMT標志蛋白的關系。進一步驗證Twist通過促進胃癌EMT、從而促進VM的形成結果：EMT標志蛋白和VM有統計學差異，Twist及EMT標志蛋白有一定的相關性。結論：Twist可能誘導胃癌細胞EMT的發生，并促進胃癌VM的形成。

關鍵詞｜EMT；Twist；侵襲；相關性

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Twist是人類胚胎發育的主要調控因子，其中Twist1基因通過其誘導上皮-間充質轉化（EMT）的能力，被證明有利于癌細胞的轉移擴散。通過之前的研究表明，很大一部分人類癌癥過度表達了Twist1或Twist2基因［1］。胃癌（gastric carcinoma，GC）是一種惡性腫瘤，源于胃黏膜上皮細胞的異常增生。胃癌的流行病學表現在不同地區呈現顯著差異，特別是西北和東部沿海地區，發病率比南方地區明顯偏高。胃癌通常易發病于50歲以上人群，但隨著現代飲食結構的改變、工作壓力的增大以及幽門螺桿菌感染等多種因素的影響，胃癌呈年輕化趨勢。盡管在發達國家（如歐美等）胃癌的患病率和死亡率呈下降趨勢，這與社會經濟發展和生活水平提高相關，但在亞洲和拉丁美洲等地，胃癌依然屬高發疾病。近年來，胃癌早期診斷率、綜合治療效果、手術切除率以及術后生存率都有所提高［2］。

1 腫瘤血管生成與血管生成擬態

傳統的血管生成理論認為，腫瘤的生長依賴于新血管的形成。一旦實體腫瘤的直徑超過2mm，就迫切需要引導血管生成，以獲取足夠的血液供應以維持其持續性生長；否則，腫瘤細胞可能因為缺乏足夠的血氧供應而發生壞死［3］?？寡苌芍委煈\而生，但隨著抗血管生成藥物的廣泛應用，有學者發現并沒有取得預期的效果。1999年，美國Maniotis等［4］在研究高侵襲性人眼葡萄膜黑色素瘤微循環時發現并命名了一種新的血液供應模式——VM。VM的發現打破了傳統認為腫瘤獲得血供的唯一途徑為內皮血管的理論，解釋了具有高侵襲性、高轉移性的惡性腫瘤的生物學行為。VM是由腫瘤細胞而不是內皮細胞（內皮細胞標記物CD34陰性）在特定的微環境下通過自身塑形及細胞外基質重塑圍成的、內有一層基膜樣物質（正常血管壁及VM壁的組成部分標記PAS陽性）的不規則的網格狀類血管樣管道［5］。三維培養是目前體外實驗研究VM的一個相當重要的評價方法［6］，基質膠的作用與哺乳動物細胞基底膜類似，是體外研究VM理想的支架來源之一。

2 EMT與血管生成擬態

參與形成VM的腫瘤細胞模擬內皮細胞的功能和表型，而內皮細胞本身屬于間質細胞的一種，因而可能發生腫瘤細胞由上皮型向間質型內皮細胞轉化，這種現象就是EMT［7］。EMT是一定條件下緊密連接的上皮細胞向連接松散的紡錘體樣間質細胞轉化的動態病理過程，同時細胞形態發生相應的變化。通過EMT，腫瘤細胞獲得了較高的轉移和侵襲能力，在腫瘤的發生發展過程中扮演重要角色。

3 材料和方法

3.1 研究對象

收集臨床上經手術切除并經病例證實的原發性胃癌石蠟標本，術前未進行化療、放療及免疫治療等腫瘤特異性治療。搜集患者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、組織學分級、有無淋巴結轉移及脈管癌栓形成等資料。另外病理證實胃良性潰瘍術后或胃減重手術后正常胃組織標本作為對照研究?；颊吆炇鹗茉囌咧橥鈺?，并遵守單位醫學倫理委員會的相關規定。

3.2 方法

蛋白免疫組織化學染色：采用S-P免疫組織化學方法檢測Twist、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達，具體操作如下：

（1）石蠟切片厚度3μm，60～65℃烘烤4小時；

（2）PBS緩沖液沖洗2次，每次5分鐘；

（3）組織抗原修護；

（4）PBS緩沖液洗滌3分鐘；

（5）每片加50μL過氧化物酶使溶液閉塞，室溫孵育10分鐘；

（6）PBS沖洗33分鐘；

（7）去PBS，每片加無免疫性動物血清50μL，室溫孵育10分鐘；

（8）PBS沖洗35分鐘；

（9）去PBS，每片加液，室溫溫育；

（10）PBS沖洗33分鐘；去PBS，每片加1滴，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘；

（11）去PBS，每片加新鮮DAB1～2次，顯色3～10分鐘，陽性顯色為褐色或黃色；

（12）自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗10～15分鐘；

（13）配制DAB顯色試劑，切片梯度酒精脫水干燥，透明化用二甲苯，按“切片脫蠟，水化”程序反向進行，最后中性樹膠封固。

CD34-PAS雙重染色：

（1）包埋好的標本用石蠟切片機切片，厚度4μm；

（2）切片經烤片處理、二甲苯脫蠟、梯度酒精至水；

（3）將切片放入pH為6.0的0.1mol/L檸檬酸抗原修復液中，進行沸水浴處理，保持20分鐘，停止加熱后自然冷卻20～30分鐘。

（4）用0.01mol/LPBS清洗3次，每次3分鐘，阻水筆圈畫組織，滴加3%的過氧化氫，封閉10分鐘，以去除內源性過氧化物酶；

（5）用0.01mol/LPBS洗滌3次，每次3分鐘，洗去過氧化氫，甩干PBS，滴加5%的山羊血清室溫封閉1小時；

（6）濾紙吸干多余封閉液，根據預實驗結果或抗體說明書中的建議濃度，滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過夜；

（7）第二天，使用0.01mol/L的PBS進行3分鐘的清洗，共進行5次，將一抗去除。將多余的PBS甩去后，滴加二抗，將切片置于室溫下的孵育盒中進行30分鐘的孵育；

（8）用0.01mol/LPBS清洗5次，每次3分鐘，洗去多余的二抗，甩去多余PBS，保持切片濕潤的狀態下，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察陽性，記錄最佳顯色時間，其余切片相同時間顯色；

（9）水洗多余的DAB（DAB為一類致癌物，水洗后的廢液需要加入硫酸-高錳酸鉀水溶液中和，可安全排出）；

（10）去離子水輕洗玻片，置換掉自來水分，甩干玻片上的水分，滴加高碘酸液，室溫處理10分鐘，去離子水洗2～3次，每次靜置1～2分鐘；

（11）甩去玻片上的水分，4℃取出PAS試劑，直接滴染，室溫孵育10分鐘；注意該步反應需要及時避光；用避光紙蓋住即可，不要移動，防止染液流動；

（12）PAS染色時間到后，使用亞硫酸沖洗液清洗玻片3～5次，每次靜置1～2分鐘；

（13）復染，滴加蘇木素染色液，室溫3分鐘，0.01mol/LPBS洗去多余的染液，3分鐘3次；

（14）進行梯度酒精復水處理：先使用80%酒精浸泡5秒，然后95%酒精浸泡10秒，接著使用100%酒精浸泡3分鐘，之后再用100%酒精浸泡5分鐘。接下來，使用二甲苯Ⅱ進行透明處理5分鐘，然后使用二甲苯Ⅰ進行透明處理5分鐘（如果未完全透明，可適當延長時間）；

（15）中性樹膠封片，待樹膠干透后，鏡檢。

結果判定、評分：免疫組化結果的判定采用免疫反應半定量積分法，總分等于染色強度積分乘以陽性細胞比例積分。染色強度積分按照不顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分進行評分；陽性細胞比例積分通過在低倍鏡下隨機計數10個視野，確?？偰[瘤細胞數不低于1000個，計算陽性細胞比例，分別為0分（0%）、1分（1%～10%）、2分（11%～50%）、3分（51%～80%）、4分（>80%）?？偡址秶鸀?～12分，定義0～3分為陰性，3分為陽性。CD34-PAS雙重染色及VM判定：CD34陽性顆粒在血管內皮細胞漿/膜表達，PAS陽性在血管腔壁基膜表達，呈紫紅色或櫻桃紅色。具體判定標準為：由CD34陰性腫瘤細胞（在HE光鏡下確認）圍成的內有一層不規則血管狀結構的PAS陽性基膜樣物質，有時其內可見紅細胞，管路周圍無出血、壞死及明顯炎細胞，判定為VM。其中，CD34和PAS均為正向表達的規則環狀物質，被排除為內皮血管。

3.3 統計學方法

本研究采用SPSS22.0軟件進行統計分析，以X±S表示計量數據計數數據采用χ2檢驗，并加以采納。將檢驗標準定為α=0.05，在p值小于0.05的情況下，會認為差值存在統計學意義。

4 結果

4.1 人胃癌組織中VM表達情況分析

這項研究在術后對50名胃癌患者實施了蠟塊VM表達的組織檢測。研究結果顯示，的確有VM現象存在于胃癌患者身上。研究發現，50例胃癌患者中，VM表達（+）的患者有。此外，VM陽性表達與統計學上具有一定意義（p<0.05）的腫瘤組織分化較差、臨床分期較高、復發轉移等有關。

4.2 人胃癌組織中VM蛋白和EMT蛋白表達的相關性分析

這項研究發現，在11例VM陽性結腸癌組織中，Vimentin的高表達率為63.7%，而E-cadherin的低表達率為18.2%。相比之下，在VM陰性組中，Vimentin的低表達率為15.4%，E-cadherin的低表達率為74.4%（詳見表1）。通過統計學分析發現，VM陽性組與陰性組的E-cadherin的胃癌細胞在表達方式（p<0.05）上存在顯著差異，具有統計學意義。這表明，在有VM的胃癌組織中，上皮間質轉化（EMT）更容易發生在腫瘤細胞中，表達的Vimentin和E-cadherin有相關性。

4.3 Twist和EMT蛋白在胃癌組織中的表達

在50例胃癌組織標本中，Twist蛋白表達陽性的病例數為35例（70.00%），E-cadherin蛋白表達陽性的病例數為19例（38.00%），維門汀蛋白表達陽性的病例數為24例（48.00%）。經統計分析發現，Twist蛋白在表達上（p=0.000）在胃癌組織中差異明顯（表2）。

研究的50例胃癌組織標本中，35例顯示Twist蛋白表達陽性，其中19例胃癌組織呈現E-cadherin蛋白表達陽性。此外，在15例Twist蛋白呈陰性表達的胃癌組織中，有11例患者出現E-cadherin蛋白呈陰性表達。Spearman等對這兩種蛋白的相關性分析表明：Twist蛋白E-cadherin蛋白表達呈正相關系數為0.544，其相關性具有統計學意義（p=0.010）。此外，35例表達Twist蛋白陽性的胃癌組織中，24例顯示Vimentin蛋白表達陽性；然而，在15例Twist蛋白呈陰性表達的胃癌組織中，有12例患者出現Vimentin蛋白呈陰性表達。Spearman等對這兩種蛋白的相關性分析表明：Twist蛋白Vimentin蛋白表達呈正相關系數為0.362，其相關性具有統計學意義（p=0.010）。

5 討論

TWIST基因是一種重要的轉錄因子，已被證明在多種癌癥中發揮關鍵作用，尤其在胃癌的發展中具有顯著影響［8］，且該研究表明TWIST通過調控細胞黏附、遷移和侵襲相關基因，引導胃癌細胞發生上皮間質轉化。上皮-間質轉化使癌細胞失去上皮細胞獨有的結構，獲得間質細胞的特征，從而增強了細胞的遷移和侵襲能力。TWIST還參與了胃癌組織中的易化血管生成擬態，促使血管內皮細胞發生擬態變化，表現出腫瘤相關的血管生成特征［9］。這進一步支持了腫瘤的生長和營養供應。在分子水平上，TWIST通過與其他轉錄因子和信號通路相互作用，調控了一系列與癌細胞生物學特征相關的基因表達，這包括促進細胞周期的變化、抑制凋亡、增強細胞遷移和侵襲等關鍵過程［10，11］。TWIST的過度表達與胃癌的臨床病理特征、預后及治療反應密切相關，因此，TWIST基因可能成為胃癌預后評估和治療靶點的重要標志物［12］。未來的研究可以重點關注以下方向：深入挖掘TWIST在信號通路中的交叉調控機制，闡明其與其他關鍵因子的相互作用；探討TWIST在胃癌早期診斷和預測預后中的潛在價值；開展藥物篩選研究，尋找能夠干預TWIST作用的新型治療靶點。TWIST作為胃癌發展的關鍵調控因子，其在診斷、治療和預后評估方面具有廣闊的應用前景。深入研究TWIST的分子機制有望為開發靶向TWIST的治療藥物提供理論基礎，為個體化治療和精準醫學奠定基礎。TWIST在人胃癌組織中的作用機制復雜而多樣，涉及上皮間質轉化和易化血管生成擬態等多個方面。未來的研究和應用將有望深化對TWIST在胃癌中的理解，并為相關治療策略的制定提供有力支持。

綜上所述，TWIST基因在人胃癌組織中通過促進上皮間質轉化和易化血管生成擬態等多個機制參與了腫瘤的發展和進展。深入理解TWIST在胃癌中的作用有望為胃癌的治療提供新的靶點和策略。

參考文獻

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Investigation of the Mechanisms by which Twist Regulates Epithelial-mesenchymal Transition and

Vasculogenic Mimicry in Human Gastric Cancer Tissues

Yu Qi1 Zhang Zhaokun1 E Sihan1 Li Lulu2 Xu Wanpeng3

1. Weifang Medical University， weifang;

2. The Hospital affiliated with WeiFang Medical College Department of Pathology， weifang;

3. The Hospital affiliated with WeiFang Medical College Gastrointestinal surgery， weifang

Abstract： Objective： The aim of this study was to investigate the role of Twist in promoting Vasculogenic Mimicry， thereby enriching and enhancing the theory of vasculogenic mimicry. Methods： The expression of Twist， Epithelial-mesenchymal Transition markers （E-cadherin and Vimentin）， and VM marker CD34-PAS were observed in gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues. The correlation between Twist， EMT markers， and clinical pathological features of gastric carcinoma was analyzed. The relationship between VM and EMT markers， as well as Twist and EMT markers， was studied. Furthermore， the involvement of Twist in promoting gastric carcinoma EMT and VM formation was validated. Results： Significant differences were observed in the expression of EMT markers （E-cadherin and Vimentin） and VM marker CD34-PAS. Twist showed a certain correlation with EMT markers. Conclusion： Twist may induce EMT in gastric carcinoma cells and promote the formation of VM in gastric carcinoma. Note The translation provided aims to align with the language style typically used in scientific publications.

Key Words： EMT; Twist; Invasion， Correlation